Name: Fare retina Pigment epiteli birincil hücre kültürleri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-16T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Öğrenin fare gözünden retinal pigment epiteli hücrelerini izole etme ve in vitro kültürleme yöntemini. Bu basit ve uygulanabilir protokol, araştırmacıların diseksiyon becerilerini geliştirmelerine yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışmada kısmen (DS için) BrightFocus Vakfı tarafından finanse edildi.

Hayvan konular içeren yordamlar kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC), Pittsburgh Üniversitesi tarafından onaylanmıştır
1. çözümleri hazırlayın
<ol><li>Büyüme orta tarafından getirilerini Dulbecco modifiye kartal orta (DMEM), yüksek glikoz % 10 fetal sığır serum (FBS), % 1 penisilin/streptomisin, 2.5 mM L-glutamin ve 1 x MEM önemli olmayan amino asitler ile hazır olun. 37 ° C kuluçka kullanmadan önce medya önceden ısıtmak.</li>
	<li>%2 (wt/vol) dispase II çalışma çözüm hazırlayın:<ol>
<li>Dispase II 300 µL HEPES arabelleğe alınmış serum (50 mM HEPES/KOH pH 7.4, 150 mM NaCl) içinde 30 mg çözülerek 100 mg/mL dispase II stok çözeltisi hazırlamak. Bu birim için 3-4 fareler, ölçekli veya aşağı fareler için deneme sayısını temel alan). Bu hisse senedi en az 1 hafta 4 ° C'de depolanan</li>
		<li>% 2 dispase çalışma çözüm olarak 100 mg/mL 300 µL ekleyerek dispase II stok 1.2 mL steril DMEM, yüksek glikoz ve çözüm 0,22 µm filtre filtreleme için hazırlayın. Bu adım laminar akışı steril koşullarda kabine yapılmalıdır. 37 ° C kuluçka kullanmadan önce hazırlanan dispase II önceden ısıtmak.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. fare gözler elde etme
<ol><li>Onaylanmış herhangi bir yöntem kullanarak fare ötenazi ve emici bir yastık yerleştirin.</li>
	<li>Eldivenler, başparmak ve işaret parmağı gözün çevresinde koyun ve cilt proptose gözü yavaşça itin.</li>
	<li>Cilt ve göz küresi arasında açılı makas ucunu takın ve dikkatle göz kesin. Kirlenmesini önlemek için kısaca %70 etanol gözüne batır.</li>
	<li>Hemen göz içinde fosfat tamponlu tuz (PBS) içinde Petri kabına yerleştirin.</li>
	<li>İkinci da gözü çıkarmak için 2.2-2.4 adımları yineleyin.</li>
</ol>3. göz diseksiyon
<ol><li>Dikkatli bir şekilde bağ dokusu diseksiyon mikroskop altında Eye'dan çıkarın. Bu PBS veya kuru Petri kabına üzerinde yapılabilir.<ol>
<li>Dikiş forseps bağ dokusu göz küresi üzerinden Kaldır ve kenasen makas kullanılarak kesin için kullanın. Sklera kesersen sağlam posterior eyecups elde etmek pratik olarak mümkün değildir çünkü sklera kesme.</li>
		<li>Bağ dokusu temizlendikten sonra elde edilen göz yıkama adım için PBS içinde tutun. Not: Aşağıdaki adımların tümünü laminar akış steril koşullarda kabine içinde gerçekleştirilmelidir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gözleri iki kez Önceden ısıtılmış 37 ° C'de DMEM (yüksek glikoz) yıkayın. Dikkatle forseps kullanarak gözbebekleri Önceden ısıtılmış 37 ° C DMEM (yüksek glikoz) içine aktarın. Yeni bir tabak taze orta orta ve transfer gözbebekleri Aspire edin.</li>
	<li>DMEM (yüksek glikoz) orta Aspire edin ve Önceden ısıtılmış %2 (wt/vol) dispase II çalışma çözüm için 45 dk 37 ° C kuluçka gözünde kuluçkaya. Not: Aşağıdaki adımlarda, yerleştirin ve gözleri veya dokuyu korumak ve iyi bir aracı diseksiyon için sağlar eyecups büyüme orta işlemek.</li>
	<li>Dispase II çözüm kaldırın ve eski orta aspirating ve yeni Önceden ısıtılmış 37 ° C büyüme orta (Şekil 1a) ekleyerek iki kez büyüme aracı olarak gözleri yıkayın. Not: dispase II tarafından ayrılma sonra gözbebekleri yumuşak olmak.</li>
	<li>Forseps ile göz tutun ve ora serrata çevresinde kesik laminar akış kabine yerleştirilmiş diseksiyon mikroskop altında kenasen makas kullanarak her göz olun.<ol>
<li>Göz küresi çözüm içinde tutmak, dikkatlice ön kornea ora serrata çevresi kesme uzanan ve kesme tam edildikten sonra ön kornea uzak çekerek çıkarın.</li>
		<li>Lens kapsülü ve ilişkili Iris Pigmentli epitel yavaşça onları dışarı kadeh teethed forseps (Şekil 1b, 1 c) ile çekerek çıkarın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Elde edilen posterior eyecups 20 dk 37 ° C'de sinirsel retina ayrılması RPE kolaylaştırmak için büyüme orta kuluçkaya.</li>
	<li>Laminar akış kabine yerleştirilmiş diseksiyon mikroskop altında 4 yaprakları posterior eyecups kesilmiş. Kesikler bağlı yaprakları (şekil 1 d) tutmak için kısa ama kadeh düzleştirmek yeterince uzun olmalıdır.<ol>
<li>Kadeh dümdüz ve sinirsel retina çok yavaşça o Forseps ile kalan tutarken çekerek çıkarın RPE-koroid-sklera kompleksi ile başka bir forseps (1e rakam). Kenarları yerine merkezi çekerek başlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Önceden ısıtılmış 37 ° C büyüme orta ile dolu yeni bir steril kültür çanak içine katlanmış mendil aktarın.</li>
</ol>4. yalıtım birincil RPE hücrelerinin
<ol><li>Tutan bir yaprağı ile katlanmış RPE-koroid-sklera kompleks forseps süper güzel, yavaşça RPE sağlam yaprak alttaki Bodrum zar (Bruch'ın membran) diseksiyon mikroskop altında mikrocerrahi Hilal bıçak kullanarak akasındaki laminar akış içinde kabine (ekil 1f) yerleştirilir.<ol>
<li>RPE sayfaları içeren büyüme orta P200 micropipette kullanarak yeni steril kültür çanak içine aktarın. RPE sayfaları aktarırken, pipet ipuçları büyüme orta ile birkaç kez pipetting tarafından ıslak doku içinde belgili tanımlık uç yapışmasını önlemek için. RPE-ecek var olmak--dan koroid açıkça ayırt: koroid daha koyu ve yapışkan ve kabarık görünüyor iken RPE daha kahverengi görünüyor.</li>
		<li>Alternatif olarak, Enzimatik sindirim ve forseps olmadan nazik ayrılma choroid14RPE ayırmak için kullanın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>2 - 3 kez Önceden ısıtılmış 37 ° C kullanarak RPE çarşafları büyüme orta steril kültür tabağına. Her yıkama adımdan sonra dikkatle retina enkaz veya koroid gibi diğer dokulara kaçınırken RPE sayfaları toplamak. Son yıkama sonunda P200 micropipette RPE sayfalarıyla toplamak ve yeni bir 1.5 mL microcentrifuge tüpü koyun. Not: RPE sayfaları santrifüj kapasitesi için gerek yoktur: 1 dk içinde yerçekimi tarafından tortu olacaktır.</li>
	<li>P200 micropipette kullanarak ilave büyüme orta kaldırın. Taze Önceden ısıtılmış büyüme orta hücrelerde resuspend ve yavaşça P200 micropipette kullanarak triturate. Kabarcıklar oluşumunu önlemek. Bir tek hücre süspansiyon idealdir ama aynı zamanda çok fazla toz önlemek, aksi takdirde RPE hücrelerinin hayatta mümkün değildir. Çok yavaşça toz için 40 - 50 kez öneririz.</li>
</ol>5. Kültür RPE hücrelerinin
<ol><li>Hücre kültür plaka üzerinde plaka.<ol>
<li>RPE hücrelerinin aşağı akım uygulamaları onların polarite istinat gerektiriyorsa, 2 adet 12 mm polyester membran insert 12-şey kültür levha önceden yüklenmiş farelerde dan plaka RPE hücreleri. Bu durumda RPE hücrelerinin altıgen şekil ve pigmentasyon gibi orijinal özelliklerini devam edebiliyoruz çünkü hücreleri yüksek yoğunluklu, kaplama isteniyorsa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Plaka taşımayın veya büyüme orta kültür ilk 72 h için değiştirin. 3 gün sonra eski orta ile taze Önceden ısıtılmış büyüme orta yerine. Bundan sonra her gün kültür orta değiştirin. RPE hücrelerinin confluency çıkınca, FBS büyüme orta % 2'ye azaltmak. Not: % 0.25 tripsin kullanarak hücreleri bölebilirsiniz. Ancak, bölme sonra hücreleri kendi altıgen şekil ve pigmentasyon sonraki pasajlar kaybedebilirsiniz. Biz hücreleri bölme tavsiye etmiyorum, ama kültür, aşağı akım uygulamaları tarafından gerekirse Primer hücre süresiz olarak passaged olamaz unutmayın: de-5-7 pasajlar sonra ayırt etmek için bilinir.</li>
</ol>

<ol><li>Martínez-Morales, J. R., Rodrigo, I., Bovolenta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eye+development%3A+a+view+from+the+retina+pigmented+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Eye development: a view from the retina pigmented epithelium.</a> Bioessays. 26, 766-777 (2004).</li>
<li>Lehmann, G. L., Benedicto, I., Philp, N. J., Rodriguez-Boulan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+protein+polarity+and+trafficking+in+RPE+cells%3A+past%2C+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane protein polarity and trafficking in RPE cells: past, present and future.</a> Exp Eye Res. 126, 5-15 (2014).</li>
<li>Fronk, A. H., Vargis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+culturing+retinal+pigment+epithelial+cells%3A+a+review+of+current+protocols+and+future+recommendations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Methods for culturing retinal pigment epithelial cells: a review of current protocols and future recommendations.</a> J Tissue Eng. 7, (2016).</li>
<li>Rizzolo, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barrier+properties+of+cultured+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Barrier properties of cultured retinal pigment epithelium.</a> Exp Eye Res. 126, 16-26 (2014).</li>
<li>Lu, F., Yan, D., Zhou, X., Hu, D. N., Qu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+melanin-related+genes+in+cultured+adult+human+retinal+pigment+epithelium+and+uveal+melanoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Expression of melanin-related genes in cultured adult human retinal pigment epithelium and uveal melanoma cells.</a> Mol Vis. 13, 2066-2072 (2007).</li>
<li>Boulton, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+melanin+and+lipofuscin+in+RPE+cell+culture+models%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Studying melanin and lipofuscin in RPE cell culture models.</a> Exp Eye Res. 126, 61-67 (2014).</li>
<li>Saini, J. S., Temple, S., Stern, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Retinal+Pigment+Epithelium+Stem+Cell+%28RPESC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Human Retinal Pigment Epithelium Stem Cell (RPESC).</a> Adv Exp Med Biol. 854, 557-562 (2016).</li>
<li>Akrami, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+pigment+epithelium+culture%3Ba+potential+source+of+retinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ophthalmic+Vis+Res%22%5BJournal%5D)">Retinal pigment epithelium culture;a potential source of retinal stem cells.</a> J Ophthalmic Vis Res. 4, 134-141 (2009).</li>
<li>Hu, J., Bok, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+cultured+human+fetal+retinal+pigment+epithelium+in+studies+of+the+classical+retinoid+visual+cycle+and+retinoid-based+disease+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">The use of cultured human fetal retinal pigment epithelium in studies of the classical retinoid visual cycle and retinoid-based disease processes.</a> Exp Eye Res. , 46-50 (2014).</li>
<li>Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+photoreceptor+outer+segment+phagocytosis%3A+use+and+utility+of+RPE+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: use and utility of RPE cells in culture.</a> Exp Eye Res. 126, 51-60 (2014).</li>
<li>Reichhart, N., Strauss, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+channels+and+transporters+of+the+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Ion channels and transporters of the retinal pigment epithelium.</a> Exp Eye Res. 126, 27-37 (2014).</li>
<li>Valapala, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomal-mediated+waste+clearance+in+retinal+pigment+epithelial+cells+is+regulated+by+CRYBA1%2F%CE%B2A3%2FA1-crystallin+via+V-ATPase-MTORC1+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Lysosomal-mediated waste clearance in retinal pigment epithelial cells is regulated by CRYBA1/βA3/A1-crystallin via V-ATPase-MTORC1 signaling.</a> Autophagy. 10, 480-496 (2014).</li>
<li>Shang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amino+acid+transporter+SLC36A4+regulates+the+amino+acid+pool+in+retinal+pigmented+epithelial+cells+and+mediates+the+mechanistic+target+of+rapamycin%2C+complex+1+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">The amino acid transporter SLC36A4 regulates the amino acid pool in retinal pigmented epithelial cells and mediates the mechanistic target of rapamycin, complex 1 signaling.</a> Aging Cell. , (2017).</li>
<li>Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture+and+characterization+of+primary+mouse+RPE+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells.</a> Nat Protoc. 11, 1206-1218 (2016).</li>
<li>Pfeffer, B. A., Philp, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture+of+retinal+pigment+epithelium%3A+Special+Issue%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Cell culture of retinal pigment epithelium: Special Issue.</a> Exp Eye Res. 126, 1-4 (2014).</li>
<li>Singh, S., Woerly, S., McLaughlin, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+and+artificial+substrates+for+retinal+pigment+epithelial+monolayer+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Natural and artificial substrates for retinal pigment epithelial monolayer transplantation.</a> Biomaterials. 22, 3337-3343 (2001).</li>
<li>Sonoda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+the+culture+and+differentiation+of+highly+polarized+human+retinal+pigment+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells.</a> Nat Protoc. 4, 662-673 (2009).</li>
<li>Ho, T. C., Del Priore, L. V., Kaplan, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+culture+of+retinal+pigment+epithelium+following+isolation+with+a+gelatin+matrix+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+eye+research%22%5BJournal%5D)">Tissue culture of retinal pigment epithelium following isolation with a gelatin matrix technique.</a> Experimental eye research. 64, 133-139 (1997).</li>
<li>Toops, K. A., Tan, L. X., Lakkaraju, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+detailed+three-step+protocol+for+live+imaging+of+intracellular+traffic+in+polarized+primary+porcine+RPE+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">A detailed three-step protocol for live imaging of intracellular traffic in polarized primary porcine RPE monolayers.</a> Exp Eye Res. , 74-85 (2014).</li>
<li>Gibbs, D., Kitamoto, J., Williams, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+phagocytosis+by+retinal+pigmented+epithelium+that+lacks+myosin+VIIa%2C+the+Usher+syndrome+1B+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Abnormal phagocytosis by retinal pigmented epithelium that lacks myosin VIIa, the Usher syndrome 1B protein.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 100, 6481-6486 (2003).</li>
<li>Gibbs, D., Williams, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+primary+mouse+retinal+pigmented+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of primary mouse retinal pigmented epithelial cells.</a> Adv Exp Med Biol. 533, 347-352 (2003).</li>
<li>Pitkänen, L., Ranta, V. P., Moilanen, H., Urtti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeability+of+retinal+pigment+epithelium%3A+effects+of+permeant+molecular+weight+and+lipophilicity%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Permeability of retinal pigment epithelium: effects of permeant molecular weight and lipophilicity.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 46, 641-646 (2005).</li>
<li>Mao, Y., Finnemann, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+photoreceptor+outer+segment+phagocytosis+by+RPE+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of photoreceptor outer segment phagocytosis by RPE cells in culture.</a> Methods Mol Biol. 935, 285-295 (2013).</li>
</ol>

DS Araştırma fon Bayer HealthCare, Almanya ve F. Hoffmann La Roche Merkezi, İsviçre aldı. Kalan yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının bildirin. Bu eser araştırma önlemek körlük (sınırsız hibe Wilmer göz Enstitüsü ve Pittsburgh Üniversitesi) tarafından desteklenmektedir.  Bu eser DS için start-up fonlarından Oftalmoloji, Pittsburgh Üniversitesi tarafından da desteklenir.

Kültürlerin confluency 1 hafta sonra ulaşmak ve altıgen şekil ve pigmentasyon 2 hafta sonra ana RPE niteliklerinden fare birincil RPE güvenilir kuruluş sunulan ayrıntılı iletişim kuralı sağlar. Elde edilen RPE hücrelerinin aşağı akım kullanma öyle aynı derecede A vitamini metabolizma9, photoreceptor dış segmentleri10 fagositoz ve iyon taşıma11, epitel hücre polarite2, lizozomal bir dizi için kullanılabilir homeostazı ve autoph...

Retina pigment epiteli (RPE) sinir retina ve koroid göz arasında yer alan tek bir katman polarize epitel hücresi var. RPE hücrelerinin işlevsellik ve RPE monolayer bütünlüğünü vizyon için kritik çünkü RPE dış kan-retina bariyeri, taşıma su ve retina arasında iyonları bakımı gibi birden çok işlem önemli bir rol oynar ve Choroid, ışık emilimi, oksidatif stres, retinoid metabolizma kontrolünü ve fagositoz photoreceptors1,2dış segmentleri koruma. RPE göz gibi sistemik kan üzerinden geçişine Vitre mizah yönetilmektedir uyuşturucu önleme bariyer fonksiyonu arkasında konumunu RPE işlev içinde vivokarmaşıklığı çalışmaya zor yapmak. Böylece, esnek, kontrollü bir ortamda3,4RPE hücrelerinde çalışmaya RPE hücre kültürleri kurulması için büyük bir ihtiyaç vardır.
Kolay ve rahat bir şekilde elde etmek ve hücre depolama sağlayan birkaç kurulan RPE hücre satır yok; Ancak, pasajlı hücreleri Primer hücre2,3,4' e göre bazı dezavantajları var. İlk olarak, onlar kez hücre morfolojisi değişimler ile karakterizedir. Örneğin, varolan hücre hatlarda RPE bariyer özellikleri hücre polarite fenotip kaybı ve sıkı kavşak4kısmi kaybolması nedeniyle, güvenilir bir çalışma için uygun bulunmuştur. Polarite ve uygun hücre hücre bağlantıları kaybı ek olarak, RPE hücre satırlarını hızlı bir şekilde olmaması nedeniyle kendi pigmentasyon yetişkin RPE5anahtar melanogenesis enzimlerin kaybetmek. Pigmentasyon geri yüklenebilir, ancak iletim elektron mikroskobu bir arada içeren yeniden pigmentasyon mekanizmasının kapsamlı analiz, melanin varlığını doğrulamak için gen ifade analizi ve kimyasal deneyleri vardır asla gerçekleştirilen6oldu. Bir daha fazla sınırlama RPE hücre hatları genişletilmiş hücre yaşam (bazen - ölümsüzlük) ve belirli koşullar altında substrat ve koloniler7, yüzen formu ayırmak kendini yenileyerek multipotent kök hücre içine dönüştürebilirsiniz olması 8. bu sınırlama nakli3deneyler için hücre hatları kullanmak imkansız hale getiriyor.
Kurulan RPE hücre hatları dezavantajları göz önüne alındığında, taze dokulardan alınan birincil RPE hücre kültürleri RPE çalışmaya daha biyolojik olarak uygun bir model olarak hizmet verebilir. A vitamini metabolizma9, photoreceptor dış segmentleri10 ve iyon fagositoz11taşıma gibi sadece RPE özgü işlevleri çalışmaya, aynı zamanda temel hücre biyolojisi gibi çalışmaya birincil RPE hücrelerinin kullanıldığını epitel hücre polarite2 , lizozomal homeostazı ve autophagy12,13.
Birincil RPE kültürler oluşturma konusunda yayınlar bir dizi olmuştur yıl son çift içinde bu alanda araştırma3,14,15büyüyen bir ilgi gösteren. Yayınlanan16,insan RPE hücrelerinin ve insan olmayan RPE hücrelerinin sığır ve domuz RPE hücrelerinin gibi çok sayıda protokollerde idi17,18,19. Ancak, fare RPE hücrelerinin çok daha küçük boyutlarından dolayı işlemek daha zordur. Tamamen a sayı yayınların RPE hücrelerinin fare14,20,21yalıtmak için protokolleri tarif var olsa bile, orada hala pek çok araştırmacı RPE hücrelerinin olmadan yalıtmak için mücadele kirlenme choroid hücre veya hücreler nöral retina enkaz üzerinden. Burada birincil fare RPE hücre kültürü, gözleri elde etme fare, gözleri diseksiyon ve yalıtım hücre kültürü çalışmalarının için vermeye RPE sayfaların dahil kurmak için iletişim kuralı mevcut. Bu video protokol fare birincil RPE kültürleri ile çalışmak ve diseksiyon teknikleri konusunda yardıma gereksinim başlayan araştırmacılar için özellikle yararlı olacaktır.

<table><tbody><tr><td><güçlü > hayvanlar< / güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 ~ 3 haftalık vahşi tip fareler</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>< güçlü > Adı< / güçlü ></td> <td>< güçlü > Şirket< / güçlü ></td> <td>< güçlü > Katalog Numarası</td><td> Yorumlar< / strong</td></tr><tr><td>>reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM), yüksek glikoz</td><td>GIBCO</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Sigma</td><td>D4693</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)</td> <td>Sigma</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin (10.000 U / mL)</td> <td>GIBCO</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>MEM Esansiyel Olmayan Amino Asit Çözeltisi (100X)</td><td>GIBCO</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin (PBS), 1X, pH 7.4</td><td>GIBCO</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Cellgro</td><td>61-034</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1310-58-3</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Ambion</td><td>AM9759</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin (200 mM)</td><td>GIBCO</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Etil Alkol</td><td>Fisher Scientific</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>RPE65 antikoru</td><td>Dr. Michael Redmond'dan</td><td></td><td></td>bir hediye</tr><tr><td>Floresein Phalloidin&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>F432</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti-Tavşan IgG (H + L), Alexa Unu 568 & nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>İnvitrojen</td><td>A11011 ve nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Keçi serumu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit (PFA)</td> <td>Polysciences, Inc</td><td>00380</td><td></td></tr><tr><td>ZO-1 Poliklonal Antikor</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>40-2200</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalog Sayı</güçlü></td><td><güçlü>Yorumlar</güçlü</td></tr><tr><td>><güçlü>alet ve ekipmanlar</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laminer akış kabini</td><td>Baker</td><td>SterilGARD SG403A</td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon mikroskobu (Zoom stereomikroskop)</td><td>Sıcak</td><td></td> hava sterilizasyonlu Nikon SMZ1500 <td></td></tr><tr><td>CO2 inkübatörü</td><td>Bağlayıcı</td><td>C150</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>5702</td><td></td></tr><tr><td>Petri kapları</td><td>Fisher Scientific</td><td>0875712</td><td></td></tr><tr><td>12 oyuklu kültür plakalarına önceden yüklenmiş 12 mm polyester membran ekleri, gözenek boyutu: 0,4 ve mikro; m, Steril</td><td>Corning Incorporated</td><td>COR-3460</td><td></td></tr><tr><td>Westcott tenotomi makası, std bıçakları, keskin</td><td>STEPHENS aletleri</td><td>S7-1320</td><td></td></tr><tr><td>Castroviejo dikiş forseps 0.12mm</td><td>Stroz Oftalmik Aletler</td><td>E1796</td><td></td></tr><tr><td>Hilal düz bıçak</td><td>Beaver-Visitec International</td><td>373808</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Cımbız #5, 11 cm, Düz, 0.1x0.06 mm Uçlar, Dumostar</td><td>World Hassas Aletler</td><td>500233</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Makas, 8 cm, 45 derece; Açı, Standart</td><td>Dünya Hassas Aletler</td><td>500260</td><td></td></tr><tr><td>Millex-GS Şırınga Filtre Ünitesi, 0.22 & m</td><td>Millipore</td><td>SLGL0250S</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga, 5 mL</td><td>BD</td><td>309632</td><td></td></tr><tr><td>Ters Laboratuvar Mikroskobu&nbsp; Leica DM IL LED</td><td>&nbsp; Leica&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipet</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bariyeri ve filtrelenmemiş pipet uçları</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

fare retina pigment epiteli birincil hücre kültürleri

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

Retina pigment epiteli (RPE) sinir retina ve koroid göz arasında yer alan bir çok polarize çok fonksiyonlu epitel var. Hexagonally Paketli ve sıkı kavşaklar tarafından bağlı Pigmentli hücreleri tek bir sayfadır. RPE ana işlevleri ışık, fagositoz döken photoreceptor dış segmentleri, kayma iyonları tampon, besin, iyonlar ve su yanı sıra aktif katılımı taşımacılığının emilimini görsel döngüsünde içerir. Böyle önemli ve çeşitli fonksiyonları ile biyoloji RPE hücrelerinin çalışma kritik önemlidir. RPE hücre satır sayısını kurduk; Ancak, bazı morfolojik ve fizyolojik özellikleri doğal RPE hücrelerinin hızla kaybetmeye pasajlı ve ölümsüzleştirdi hücreler denir. Böylece, Primer hücre RPE hücre biyolojisi ve işlev farklı yönlerini eğitim için daha uygundur. Fare modelleri biyolojik çalışmalarda yaygın olarak kullanıldığından fare birincil RPE hücre kültürü araştırmacılar için çok yararlı, ancak RPE toplama fare hücreleri de kendi küçük boyutu nedeniyle çok zor. Burada, enükleasyon ve gözleri diseksiyon ve yalıtım RPE yaprak hücre kültürü çalışmalarının için verim içeren birincil fare RPE hücre kültürleri kurmak için bir protokol mevcut. Bu yöntem etkili hücre kurtarma sağlar. İki fare elde RPE hücrelerinin kültür tabağına sonra kültür ve bazı iyi niyetli RPE orijinal özelliklerini hücreleri altıgen şekil ve pigmentasyon iki sonra gibi görünen bir hafta önceden yüklenmiş bir 12 mm polyester membran Ekle confluency ulaşabilirsiniz Kültür Haftası.

2 fareler kültür 1 hafta sonra 12 mm polyester membran Ekle ulaştığı % 90-95 confluency kurulan fare birincil RPE kültür. Kültür, % 100 confluency vardım ve bir mozaik altıgen, Pigmentli kurmaya başladım hücreleri ve hücre BI parçalanmayabilir 2 hafta sonra. Kültür, şekil ve pigmentasyon, kurmaya devam etti hücreleri tarafından 3 hafta ancak, 4 hafta sonra hücrelerin bir kısmı hiperpigmente (Şekil 2) var.
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-pa...

Retina pigment epiteli (RPE) çok fonksiyonlu bir epitel göz olduğunu. Burada bir iletişim kuralı fare RPE türetilmiş birincil hücre kültürleri kurmak için mevcut.

Fare retina Pigment epiteli birincil hücre kültürleri

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Bu prosedürün genel amacı, fare gözlerinden retina pigment epitel hücreleri elde etmenin ve orijinal özelliklerini koruyarak in vitro olarak kültürlemenin uygun bir yolunu göstermektir. Bu yöntem, RPE araştırmacılarının fare RPE hücre kültürlerinin kurulması için gerekli olan diseksiyon becerilerini edinmelerine ve bunun nasıl kolay bir şekilde yapılacağını göstermelerine yardımcı olacaktır. Bu prosedürün temel avantajı, basit ve uygulanabilir olmasıdır.Gerekli olan tek şey pratiktir ve RPE izolasyonunun ve mikroskobun görsel gösterimi, gerekli becerilerin nasıl elde edileceğini tam anlamıyla gösterir. Fare gözbebeklerini izole etmek için, önce onaylanmış herhangi bir yöntemi kullanarak iki fareyi ötenazi yapın ve eldiven giyerek emici bir ped üzerine yerleştirin. Başparmağınızı ve işaret parmağınızı gözün etrafına yerleştirin ve göz küresini dışarı çıkarmak için cildi nazikçe itin.Göz küresi çıkıntı yaptıktan sonra, açılı bir makasın ucunu cilt ile göz küresi arasına sokun ve göz çevresindeki dokuyu serbest kalana kadar dikkatlice kesin. Ardından, izole edilmiş gözü kısa bir süreliğine% 70 etanole batırın ve bir Petri kabında PBS'ye batırın. Farelerin her birinden her iki gözü de

primary-cell-cultures-from-the-mouse-retinal-pigment-epithelium

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz insan fetal retina pigment epitel hücreleri (hfRPE) hücrelerin kültür konfluent mono tabakaları, morfoloji, fizyoloji, polarite, ve yetişkin doğal doku protein ve gen ekspresyonu sergilediği için tekrarlanabilir bir yöntem sağlar. Bu çalışma, çeşitli göz hastalıkları bir hayvan modeli uzatıldı.

Retina Pigment Epitel Fizyoloji ve Patofizyoloji Çalışma Deneysel Modeller

Bu video, siliyer epitelden fare gözün retina kök hücreleri izole kültür ve klonal retina küreler oluşturacak şekilde büyümeye nasıl göstereceğiz. Izole edilmiş kök hücre küre kardinal özelliklere sahip: kendini yenileme ve multipotentiality.

Fare Göz Retina Kök Hücre İzolasyonu

8 gün yaşlı bir fare Sinir retina% 4 jelatin bloğunun üstünde olduğunu. Vibratome ile fotoreseptör tabakası (200 um), izole edildikten sonra, fotoreseptör kültür mekanik ve enzimatik ayrışma sonrasında tohumlanır. fotoreseptör moleküler ve biyokimyasal analizler ya da transplantasyon için kullanılabilir.

Vibratome Kesit Fare Retina fotoreseptör Kültürler hazırlayın

Protokol, fare nöroretinasınınorganotipik eksplantlarını açıklar Retina pigment epiteliyle (RPE) birlikte yetiştirilen, R16 tanımlı ortamda, serum ve antibiyotik içermez. Bu yöntemin in vivo deneylere kıyasla gerçekleştirilmesi nispeten basit, daha az pahalı ve zaman alıcıdır ve çok sayıda deneysel uygulamaya uyarlanabilir.

Sağlam Retina Pigment Epitel ile Organotipik Fare Retina Eksplantlarının Uzun Süreli, Serumsuz Ekimi

İlk olarak 20161'deFernandez-Godino ve arkadaşları tarafından bildirilen bu protokol, Transwell plakalarında bir hafta içinde işlevsel ve polarize bir RPE monolayer oluşturan fare RPE hücrelerini verimli bir şekilde izole etmek ve kültüre etmek için bir yöntem tanımlamaktadır. İşlem yaklaşık 3 saat sürer.

Birincil Fare Retina Pigment Epitel Hücrelerinin Verimli Diseksiyonu ve Kültürü

Bu yazıda retinal pigmente epitel (RPE) hücrelerinin fare gözlerinden kademeli olarak izole edilmesi için basitleştirilmiş bir protokol anlatılmaktadır. Protokol, fare gözlerinin enükleasyonunu ve diseksiyonunu, ardından RPE hücrelerinin izolasyonunu, tohumlanmasını ve kültürlenmesini içerir.

Primer Fare Retinal Pigmentli Epitel Hücrelerinin İzolasyonu

Burada, primer domuz retinal pigment epitel hücrelerinin in vitro olarak kültürlenmesi için takip edilmesi kolay bir yöntem sunulmaktadır.

Domuz Retinal Pigment Epitel Hücrelerinin Primer Kültürü

Retinal pigment epitel (RPE) hücrelerinin hücrelerini genç pigmentli kobayların gözlerinden izole etmek için basit ve etkili bir yöntem sunuyoruz. Bu prosedür, gen ekspresyon analizleri de dahil olmak üzere izole RPE üzerinde moleküler biyoloji çalışmalarının izlenmesine izin verir.

Retinal Pigment Epitel Hücrelerinin Guinea Pig Gözlerinden İzolasyonu

Bu protokol, lokal kaynaklı domuz gözlerinden primer retinal pigment epitel (RPE) hücrelerinin elde edilmesi ve kültürlenmesi prosedürünü özetlemektedir. Bu hücreler, kök hücrelere yüksek kaliteli bir alternatif olarak hizmet eder ve in vitro retinal araştırmalar için uygundur.

İn Vitro Modelleme için Primer Domuz Retinal Pigment Epitel Hücrelerinin İzolasyonu

Bu el yazması, fare gözlerinden retinal glial Müller hücrelerini izole etmek için ayrıntılı bir protokolü açıklamaktadır. Protokol, fare gözlerinin enükleasyonu ve diseksiyonu ile başlar, ardından Müller hücrelerinin izolasyonu, tohumlanması ve kültürlenmesi ile devam eder.

Primer Fare Retinal Glial Müller Hücrelerinin İzolasyonu

Retina pigment epiteli (RPE), koroid ve retina arasında çok önemli bir bariyer görevi görür ve fotoreseptörler gibi retina hücre tiplerinin sağlığını ve işlevini destekler. Burada, yetişkin murin RPE'yi izole etmek ve kültürlemek için basit ve etkili bir protokol açıklıyoruz.

Yetişkin Farelerden Retinal Pigment Epitel Hücrelerinin İzolasyonu ve Kültürü için Basitleştirilmiş Bir Yöntem

Öğrenin fare gözünden retinal pigment epiteli hücrelerini izole etme ve in vitro kültürleme yöntemini. Bu basit ve uygulanabilir protokol, araştırmacıların diseksiyon becerilerini geliştirmelerine yardımcı olur.

Fare retina Pigment epiteli birincil hücre kültürleri

Daha fazla video keşfet