Fare retina Pigment epiteli birincil hücre kültürleri

Retina pigment epiteli (RPE) çok fonksiyonlu bir epitel göz olduğunu. Burada bir iletişim kuralı fare RPE türetilmiş birincil hücre kültürleri kurmak için mevcut.

Bu prosedürün genel amacı, fare gözlerinden retina pigment epitel hücreleri elde etmenin ve orijinal özelliklerini koruyarak in vitro olarak kültürlemenin uygun bir yolunu göstermektir. Bu yöntem, RPE araştırmacılarının fare RPE hücre kültürlerinin kurulması için gerekli olan diseksiyon becerilerini edinmelerine ve bunun nasıl kolay bir şekilde yapılacağını göstermelerine yardımcı olacaktır. Bu prosedürün temel avantajı, basit ve uygulanabilir olmasıdır.

Gerekli olan tek şey pratiktir ve RPE izolasyonunun ve mikroskobun görsel gösterimi, gerekli becerilerin nasıl elde edileceğini tam anlamıyla gösterir. Fare gözbebeklerini izole etmek için, önce onaylanmış herhangi bir yöntemi kullanarak iki fareyi ötenazi yapın ve eldiven giyerek emici bir ped üzerine yerleştirin. Başparmağınızı ve işaret parmağınızı gözün etrafına yerleştirin ve göz küresini dışarı çıkarmak için cildi nazikçe itin.

Göz küresi çıkıntı yaptıktan sonra, açılı bir makasın ucunu cilt ile göz küresi arasına sokun ve göz çevresindeki dokuyu serbest kalana kadar dikkatlice kesin. Ardından, izole edilmiş gözü kısa bir süreliğine% 70 etanole batırın ve bir Petri kabında PBS'ye batırın. Farelerin her birinden her iki gözü de topladıktan sonra diseksiyona devam edin.

Diseksiyon mikroskobu altında, göz çevresindeki bağ dokusunun çoğunu dikkatlice çıkarın. Bu adım sırasında gözü suya batırmak gerekli değildir. Bunu yapmak için, bağ dokularını göz küresinden kaldırmak için dikiş forsepsleri kullanın ve bunları Vannas makası kullanarak kesin.

Sklerayı kesmeyin, çünkü sklera kesilirse sağlam arka göz kaplarını elde etmek neredeyse imkansızdır. Bağ dokusunu temizledikten sonra, gözbebeklerini PBS'ye batırın ve steril koşullar altında laminer akış kabininde çalışmaya geçin. Şimdi, gözleri yüksek konsantrasyonda glikoz içeren ılık bir DMEM kabına aktarmak için forseps kullanın.

20 ila 30 saniye sonra, ikinci bir yıkama için aspirasyon kullanarak yıkama solüsyonunu değiştirin. Gözbebeklerini 15 mL'lik tüplerde ısıtılmış% 2 Dispase II çalışma solüsyonuna aktarın ve gözlerin ayrışması için 37 santigrat derecede 45 dakika inkübe etmesine izin verin. Kuluçka işleminden sonra gözbebekleri yumuşak olmalıdır.

Daha sonra, gözleri aynı kapta ısıtılmış büyüme ortamı ile iki kez yıkayın. İkinci yıkamadan sonra, büyüme ortamını taze ortamla değiştirin ve diseksiyona devam etmek için göz kürelerini ve ortamı yeni bir tabağa aktarın. Diseksiyon mikroskobu yardımı ile temiz bir tezgahta çalışmaya devam edin.

Gözü forseps ile sabitleyerek diseksiyona başlayın ve Vannas makası kullanarak ora serrata çevresinde bir kesi yapın. Göz küresini solüsyon içinde tutarak, kesiği ora serrata çevresinin etrafına uzatarak ön korneayı dikkatlice çıkarın. Kesimi tamamladıktan sonra ön korneayı dışarı çekin.

Ardından, lens kapsülünü ve ilişkili iris pigmentli epiteli dişli forseps kullanarak göz kabından nazikçe çekerek çıkarın. Daha sonra, kalan gözlerde diseksiyonu tekrarlayın ve nöral retinanın RPE'den ayrılmasını kolaylaştırmak için arka göz kaplarını 37 santigrat derecede 20 dakika boyunca büyüme ortamında inkübe edin. 20 dakika sonra, arka göz kaplarını dört yaprak halinde kesin.

Kesikleri göz kabını düzleştirecek kadar uzun, ancak yaprakları bağlı tutacak kadar kısa yapın. Ardından, nöral retinayı çıkarmak için göz kabını düzleştirin. Kalan RPE koroid sklera kompleksini baskın olmayan elinizle sabitleyin ve retinayı kenarlardan çok nazikçe çekin.

Nöral retina çıkarıldıktan sonra, dörde bölünmüş RPE koroid sklera kompleksini ılık büyüme ortamı ile doldurulmuş yeni bir steril kültür kabına aktarın. Petri kabında, dörde bölünmüş RPE koroid sklera kompleksinin bir yaprağını süper ince forsepslerle sabitleyin ve mikrocerrahi bir hilal bıçağı kullanarak, alttaki bazal zardan sağlam RPE tabakalarını nazikçe soyun. Kahverengimsi RPE, koyu, yapışkan, kabarık koroidden açıkça ayırt edilebilir olmalıdır.

Ardından, bir p200 mikropipet ucunu büyüme ortamı ile ıslatın ve RPE tabakalarını ısıtılmış büyüme ortamı içeren yeni tabağa aktarmak için ucu kullanın. Şimdi, RPE tabakalarını ısıtılmış büyüme ortamında üç kez yıkayın. Her yıkama adımından sonra, retina veya koroidden gelen kalıntılar gibi diğer dokulardan kaçınırken RPE tabakalarını dikkatlice toplayın.

Son yıkamadan sonra, RPE tabakalarını 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın ve yerçekimi ile çökelmelerine izin verin. Daha sonra, laminer akış kabininde ekstra büyüme ortamını çıkarın ve hücreleri taze yapılmış ılık büyüme ortamında yeniden askıya alın. Şimdi, kabarcıklar yapmadan bir p200 mikropipet kullanarak dokuyu nazikçe ezin.

Tek hücreli bir süspansiyon yapmaya yetecek kadar 40 ila 50 kez ezin. Çok fazla yıpranma öldürücü olabileceğinden dikkatli olun. Şimdi, her iki fareden toplanan RPE hücrelerini, 12 oyuklu bir kültür plakasının kuyucuğuna 12 mL'lik bir polyester membran ekinde plakalayın.

RPE hücrelerinin altıgen şekillerini ve pigmentasyonlarını korumaları için yüksek bir hücre yoğunluğu arzu edilir. 12 mm'lik bir polyester membran ekinde iki fareden oluşturulan bir fare birincil RPE kültürü, kültürde bir hafta sonra %90 ila 95 birleşmeye ulaştı. Kültürde iki hafta sonra, hücreler% 100 birleşti ve altıgen pigmentli ve iki çekirdekli hücrelerden oluşan bir mozaik oluşturmaya başladı.

Üçüncü haftaya kadar, hücreler şekil ve pigmentasyonda değişmeye devam etti. Bununla birlikte, dört hafta sonra hücrelerin bir kısmı hiperpigmente oldu. Birincil RPE hücre kültürünün saflığı, omurgalı görsel döngüsü için kritik bir enzim olan retinoid izomerohidrolazı etiketleyen RPE65 antikoru kullanılarak değerlendirildi.

Hücrenin hücre bağlantılarına ve altıgen hücre şekline bütünlüğü, falloidin ile boyama ile gösterildi. Sıkı bağlantılar, bir amino boyama kullanılarak görselleştirilebilen ve western blotlama ile doğrulanabilen ZO-1 protein ekspresyonunun analizi ile görselleştirildi. Genel olarak, kültürler sıkı bağlantılar oluştururken ve RPE65 gibi fonksiyonel belirteçleri ifade ederken çoğalabilir, pigmentasyonu ve altıgen şekillerini koruyabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, RPE hücrelerini fare gözlerinden nasıl izole edeceğinizi ve bunları in vitro olarak nasıl düzgün bir şekilde kültürleyeceğinizi iyi anlamış olmalısınız. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde yapılırsa üç saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, gözleri her zaman ıslak tutmayı ve olabildiğince hızlı çalıştırmaya çalışmayı unutmamak önemlidir.