Name: İki fotonlu lazer mikroskop kullanarak hücre zarı tamir tahlil (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 35 s
Description: Öğrenin, iki fotonlu lazer mikroskop kullanarak disferlinopati hastası fibroblast hücrelerinde hücre zarı tamir yeteneğini canlı görüntüleme ve niceliksel analiz yöntemini.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu eser yenilik (CFI) tıp ve diş hekimliği, arkadaş, Garrett Cumming araştırma sandalye Fonu, HM Toupin nörolojik bilim araştırma sandalye Fonu, kas distrofisi Kanada, Kanada Vakfı Alberta Üniversitesi Fakültesi tarafından desteklenmiştir, Alberta ileri eğitim ve Teknoloji (AET), Kanadalı Sağlık Araştırma (CIHR), Jesse'nin yolculuk - gen ve hücre tedavisi, kadın ve çocuk sağlığı Araştırma Enstitüsü (WCHRI), temeli enstitüleri ve Alberta Sağlık Çözümleri (AIHS yeniliklerin ).
Dr. Steven Laval tam uzunlukta dysferlin plazmid ile bize sağlamak için teşekkür etmek istiyorum. Ayrıca Dr Katsuya Miyake teknik tavsiye için teşekkür etmek istiyorum.

Bu çalışmada kullanılan insan fibroblast hücre Tıp Fakültesi ve diş hekimliği University of Alberta adlı insan Etik Komitesi onay ile kullanılmıştır.
1. transfection tam uzunlukta DYSF plazmid içeren hücrelerin
<ol>
	<li>Kültür fibroblast hücrelerinde büyüme medya - 36 mL Dulbecco'nın modifiye kartal orta (DMEM), fetal sığır serum (FBS) 4 mL ve penisilin/streptomisin (P/S) - CO2 kuluçka 37 ° C'de 20 µL 40 mL içeren bir T225 şişesi Not: Hücreleri yaklaşık % 70-80 confluency kültürlü olmalı ve tamamen Konfluent olmak için izin verilmemelidir.</li>
	<li>Hücreleri tohum için hazırlamak için iki kez fosfat tamponlu tuz (PBS) 40 mL hücrelerle durulama sonra hücreleri ayırmak için % 0.05 tripsin 5 mL ekleyin. Hücreleri 37 ° C CO2 kuluçka dönün ve 5 min için hücreleri kuluçkaya.<ol>
		<li>Hücreleri tamamen müstakil tripsin reaksiyonu durdurmak için büyüme ortamının 40 mL ekleyin.</li>
		<li>Bir hemasitometre kullanarak hücreleri veya başka bir hücreye aygıt sayma saymak.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>2 mL 1 x 105 hücre/mL, hücrelerin 35 mm kolajen kaplı cam-alt yemekleri tohum. CO2 kuluçka 37 ° C'de gecede hücrelerde kuluçkaya Not: Hücreleri yaklaşık % 50-60 birleşmesi ertesi gün olmalıdır.</li>
	<li>Büyüme ortamını çıkarın ve 2 mL serum yoksun medya (büyüme medya FBS olmadan) ile değiştirin.</li>
	<li>Hücreleri lipotransfection kullanarak tam uzunlukta dysferlin plazmid ile transfect.<ol>
		<li>150 µL serum yoksun medya 1,5 mL tüp (transfected her yemek için bir tüp) hazırlayın.</li>
		<li>Transfection reaktif 3 µL serum yoksun ortamı içeren her 1,5 mL tüp ekleyin. Oda sıcaklığında en az 5 dk kuluçkaya.</li>
		<li>Bir ayrı 1,5 mL tüp, 175 µL serum yoksun medya ve plazmid DNA 3,5 µg ekleyin. Not: transfected ek her yemek için yukarıdaki tutarları çarpmak.</li>
		<li>Plazmid DNA içine bir tüp ile 150 µL serum yoksun medya ve transfection reaktif içeren medya 150 µL birleştirin. Oda sıcaklığında 20 dk için kuluçkaya.</li>
		<li>Plazmid ve transfection reaktif ile medya 300 µL çanak arasında dağıtabilmenizi. Bulaşıkları CO2 kuluçka 37 ° C'de 24 h için kuluçkaya</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ortamı serum içeren taze büyüme medya ile değiştirin ve bir ek 24 h 37 ° C'de CO2 kuluçka için kuluçkaya</li>
</ol>
2. İki fotonlu yaralama tahlil için hücreleri hazırlanması
<ol>
	<li>Pipetting tarafından medyayı çıkarın ve bir kez 1 mL Tyrode'nın çözeltisi içeren hücreleri durulama sonra taze Tyrode'nın çözüm 2.5 mm FM 1 µL içeren 1 mL ekleyin 4-64 boya. Not: Son FM 4-64 boya 2.5 µM bölgedir.</li>
	<li>Membran onarım kalsiyum tükenmiş bir ortamda değerlendirmesini isterseniz, PBS 1 mL hücrelerle durulayın ve 1 mL 1 mM EGTA içeren PBS ekleyin. Not: PBS zaman içinde ayırmak hücreleri neden olur gibi yaralama tahlil mümkün olduğunca çabuk tamamlanmalıdır.</li>
</ol>
3. İki fotonlu lazer yaralama tahlil
<ol>
	<li>Bir ters confocal mikroskop ve ilişkili program yazılım kullanarak, 0.2 µm x 2 µm hedef oluşturabilir ve böylece hedef satırı ile çakışıyor ve hücre zarının (Şekil 2) yönünü dikey yatıyor hücre zarı arasındaki sınırda yer.</li>
	<li>543-nm Helene lazer FM boya sinyal heyecanlandırmak ve 600-760 nm için algılama aralığı ayarlamak için kullanın. 488-nm Argon lazer GFP sinyal (şekil 4) heyecanlandırmak ve 500-550 nm için algılama aralığı ayarlamak için kullanın.<ol>
		<li>Her 5 sıralı görüntü taramaları, hücreleri görüntüleme 5 dk zaman serisi oluşturmak s.</li>
		<li>Membran lezyon üretmek için çamaşır suyu hücrelerin 820-nm için % 15 kullanarak, ayarla İki fotonlu lazer kullanarak güç 10 yinelemeler ile lazer ve hücreleri 25 s zaman serisinin başında sonra çamaşır suyu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>4-64 boya Floresans FM ölçmek için 6 µm x 6 µm bölge (ROI) ilgi çekmek ve yer bitişik yaralama konumuna ve hücre (şekil 3) içinde belgili tanımlık bilgisayar yazılımı kullanın. Not: yazılım - bu uygulamada "Aralığı göstergesi" işlevini kullanarak piksel oversaturation örnekleme alanlarının önlemek için kırmızı piksel doygun piksel temsil eder. İstatistiksel analiz için bir elektronik tablo içine çiğ Floresans değerleri vermek.</li>
	<li>Arka plan (membran yaralama önce timepoints ortalama Floresans değeri) çıkararak her zaman noktası göreli Floresans değerlerini hesaplamak ve net artış tarafından Floresans bölen değer t = 0 (şekil 5, 6) .</li>
</ol>

<ol><li>Cong, X., Hubmayr, R. D., Li, C., Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+wounding+and+repair+in+pulmonary+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane wounding and repair in pulmonary diseases.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 312 (3), L371-L391 (2017).</li>
<li>Demonbreun, A. R., McNally, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+Membrane+Repair+in+Health+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Membr%22%5BJournal%5D)">Plasma Membrane Repair in Health and Disease.</a> Curr Top Membr. 77, 67-96 (2016).</li>
<li>McNeil, P. L., Ito, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrointestinal+cell+plasma+membrane+wounding+and+resealing+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Gastrointestinal cell plasma membrane wounding and resealing in vivo.</a> Gastroenterology. 96 (5 Pt 1), 1238-1248 (1989).</li>
<li>McNeil, P. L., Kirchhausen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+emergency+response+team+for+membrane+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">An emergency response team for membrane repair.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (6), 499-505 (2005).</li>
<li>Cooper, S. T., McNeil, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+Repair%3A+Mechanisms+and+Pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Membrane Repair: Mechanisms and Pathophysiology.</a> Physiol Rev. 95 (4), 1205-1240 (2015).</li>
<li>Geeraerts, M. D., Ronveaux-Dupal, M. F., Lemasters, J. J., Herman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytosolic+free+Ca2%2B+and+proteolysis+in+lethal+oxidative+injury+in+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cytosolic free Ca2+ and proteolysis in lethal oxidative injury in endothelial cells.</a> Am J Physiol. 261 (5 Pt 1), C889-C896 (1991).</li>
<li>McDade, J. R., Archambeau, A., Michele, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+actin-cytoskeleton-dependent+recruitment+of+plasma+membrane-derived+dysferlin+at+wounds+is+critical+for+muscle+membrane+repair%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Rapid actin-cytoskeleton-dependent recruitment of plasma membrane-derived dysferlin at wounds is critical for muscle membrane repair.</a> FASEB J. 28 (8), 3660-3670 (2014).</li>
<li>Benninger, R. K., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+excitation+microscopy+for+the+study+of+living+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Two-photon excitation microscopy for the study of living cells and tissues.</a> Curr Protoc Cell Biol. Chapter 4 (Unit 4), 11-24 (2013).</li>
<li>Demonbreun, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+actin-dependent+annexin+complex+mediates+plasma+membrane+repair+in+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">An actin-dependent annexin complex mediates plasma membrane repair in muscle.</a> J Cell Biol. 213 (6), 705-718 (2016).</li>
<li>McNeil, P. L., Khakee, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruptions+of+muscle+fiber+plasma+membranes.+Role+in+exercise-induced+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Disruptions of muscle fiber plasma membranes. Role in exercise-induced damage.</a> Am J Pathol. 140 (5), 1097-1109 (1992).</li>
<li>Rodriguez, A., Webster, P., Ortego, J., Andrews, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomes+behave+as+Ca2%2B-regulated+exocytic+vesicles+in+fibroblasts+and+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Lysosomes behave as Ca2+-regulated exocytic vesicles in fibroblasts and epithelial cells.</a> J Cell Biol. 137 (1), 93-104 (1997).</li>
<li>Reddy, A., Caler, E. V., Andrews, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+repair+is+mediated+by+Ca%282%2B%29-regulated+exocytosis+of+lysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane repair is mediated by Ca(2+)-regulated exocytosis of lysosomes.</a> Cell. 106 (2), 157-169 (2001).</li>
<li>Bansal, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+membrane+repair+in+dysferlin-deficient+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy.</a> Nature. 423 (6936), 168-172 (2003).</li>
<li>Han, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysferlin-mediated+membrane+repair+protects+the+heart+from+stress-induced+left+ventricular+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Dysferlin-mediated membrane repair protects the heart from stress-induced left ventricular injury.</a> J Clin Invest. 117 (7), 1805-1813 (2007).</li>
<li>Huynh, C., Roth, D., Ward, D. M., Kaplan, J., Andrews, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+lysosomal+exocytosis+and+plasma+membrane+repair+in+Chediak-Higashi%2Fbeige+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Defective lysosomal exocytosis and plasma membrane repair in Chediak-Higashi/beige cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (48), 16795-16800 (2004).</li>
<li>Corrotte, M., Castro-Gomes, T., Koushik, A. B., Andrews, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approaches+for+plasma+membrane+wounding+and+assessment+of+lysosome-mediated+repair+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Approaches for plasma membrane wounding and assessment of lysosome-mediated repair responses.</a> Methods Cell Biol. 126, 139-158 (2015).</li>
<li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li>
<li>Jontes, J. D., Buchanan, J., Smith, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+cone+and+dendrite+dynamics+in+zebrafish+embryos%3A+early+events+in+synaptogenesis+imaged+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Growth cone and dendrite dynamics in zebrafish embryos: early events in synaptogenesis imaged in vivo.</a> Nat Neurosci. 3 (3), 231-237 (2000).</li>
<li>Galbraith, J. A., Terasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+damage+in+thick+specimens+by+multiphoton+excitation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Controlled damage in thick specimens by multiphoton excitation.</a> Mol Biol Cell. 14 (5), 1808-1817 (2003).</li>
<li>McNeil, P. L., Miyake, K., Vogel, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endomembrane+requirement+for+cell+surface+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The endomembrane requirement for cell surface repair.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (8), 4592-4597 (2003).</li>
<li>Weisleder, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+MG53-mediated+cell+membrane+repair+using+in+vivo+and+in+vitro+systems%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualization of MG53-mediated cell membrane repair using in vivo and in vitro systems.</a> J Vis Exp. (52), (2011).</li>
<li>Matsuda, C., Kiyosue, K., Nishino, I., Goto, Y., Hayashi, Y. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysferlinopathy+Fibroblasts+Are+Defective+in+Plasma+Membrane+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Curr%22%5BJournal%5D)">Dysferlinopathy Fibroblasts Are Defective in Plasma Membrane Repair.</a> PLoS Curr. 7, (2015).</li>
<li>Philippi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysferlin-deficient+immortalized+human+myoblasts+and+myotubes+as+a+useful+tool+to+study+dysferlinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Curr%22%5BJournal%5D)">Dysferlin-deficient immortalized human myoblasts and myotubes as a useful tool to study dysferlinopathy.</a> PLoS Curr. 4, RRN1298(2012).</li>
<li>Cai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MG53+nucleates+assembly+of+cell+membrane+repair+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">MG53 nucleates assembly of cell membrane repair machinery.</a> Nat Cell Biol. 11 (1), 56-64 (2009).</li>
<li>Swaggart, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Annexin+A6+modifies+muscular+dystrophy+by+mediating+sarcolemmal+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Annexin A6 modifies muscular dystrophy by mediating sarcolemmal repair.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (16), 6004-6009 (2014).</li>
<li>Roostalu, U., Strahle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+molecular+interactions+at+damaged+sarcolemma%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of molecular interactions at damaged sarcolemma.</a> Dev Cell. 22 (3), 515-529 (2012).</li>
<li>Azakir, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+dispensability+of+dysferlin+C2+domains+reveals+rational+design+for+mini-dysferlin+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Modular dispensability of dysferlin C2 domains reveals rational design for mini-dysferlin molecules.</a> J Biol Chem. 287 (33), 27629-27636 (2012).</li>
<li>Lee, J., Yokota, T. Ch 6. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLee%2C+J+%22Translational+Research+in+Muscular+Dystrophy%22">Translational Research in Muscular Dystrophy</a>. Takeda, S., Miyagoe-Suzuki, Y., Mori-Yoshimura, M. , Springer Japan. 87-102 (2016).</li>
<li>Barthelemy, F., Wein, N., Krahn, M., Levy, N., Bartoli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+research+and+therapeutic+perspectives+in+dysferlinopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Translational research and therapeutic perspectives in dysferlinopathies.</a> Mol Med. 17 (9-10), 875-882 (2011).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

İki fotonlu lazer hücre membran yaralama içinde vitroyeniden mühürlemeden membran dinamikleri değerlendirmek için hassas ve çok yönlü bir tekniktir. Bu makalede, hücre zarının dysferlinopathy hasta hücrelerin tahlil yaralama İki fotonlu lazer kullanarak yeteneği yeniden mühürlemeden belirlemek için bir iletişim kuralı açıklanan. Dysferlinopathy hasta hücrelerin hücre zarının yeniden mühürleme, arızalı diğer araştırmacılar tarafından bulguları ile uyumlu olduğu ve hangi daha fazla hücre zarı dynamics kas arasında...

Bir çift-hücre içi/hücre dışı ortam tanımlar ve hücresel homeostazı ve hücre yaşam bakımı için önemlidir tabaka-in protein çivili fosfolipitler, ökaryotik hücre hücre zarı oluşur. Hücre zarının yaralanmaları mekanik veya kimyasal hakaret kaynaklanan çeşitli memeli hücre türleri sıradan, dahil iskelet ve kalp kası, mide ve akciğer hücreleri1,2,3,4. Yaralanmalar için günlük fizyolojik fonksiyon sonucu ek olarak, hücre zarlarında Ayrıca çevre hakaret, bakteriyel toksinler ve iskemik reperfüzyon5tarafından zarar görebilir. Hücre membran yırtığı yeniden mühürlemek için başarısızlık ekstraselüler Ca2 +- diğer potansiyel olarak toksik ekstraselüler bileşenleri - ile birlikte bir düzensiz akını hücre içine hızlı bir şekilde hücre neden olabilir aşağı akım sinyal cascades tetikleme yol açar Ölüm1,4,5,6.
Bugüne kadar hücrelerde membran onarım için birkaç önerilen modelleri olmuştur. Farklı onarım mekanizmaları boyutuna ve membran rüptürü niteliğine bağlı olarak etkinleştirilebilir. Örneğin, bu hücre zarlarında yanal akışı veya küçük aksamalar onarmak için tıkanma protein yararlanmak olabilir önerilmektedir (&#60; 1 nm). Membran yırtığı hızla yanal alımı dysferlin içeren tamir lateral füzyon modeli öneriyor küçük delikler protein toplamalardan tamir modeli tıkanma protein öneriyor iken membran7, (çoğunlukla annexins) 8. diğer taraftan, daha büyük membran lezyonlar Ca2 +tetik-bağımlı, dysferlin-aracılı vezikül fusion ve onarım yama oluşumu. Onarım yama modelinde, hücre içine hızlı bir Ca2 + akın bir kompleks veya "yama", bir füzyon ile birlikte hücre içi veziküller formu birden fazla protein (dysferlin, annexins, mitsugumin-53 ve EDH proteinler) alımı tetikler veya organellerin membran sitesinde4,9,10,11,12zarar. Bu modeller mutlaka birbirini dışlamaz ve membran onarım kolaylaştırmak için konserde işe yaramayabilir unutmamak gerekir. Düzgün hücre zarının hasar yeniden mühürlemek için başarısızlık Muskuler Distrofi (dysferlinopathy - Miyoshi myopathy, bacak-korse Muskuler Distrofi Tip IIb ve anterior tibial başlangıçlı ile distal myopathy gibi) da dahil olmak üzere birden çok hastalık durumlarında ile ilişkilidir 13, kardiyomiyopati14ve Chediak-Higashi Sendromu (CHS)15.
O uygun hücre zarının bütünlüğü ve oyun yeniden mühürlemeden verilen Sağlık ve hastalığında, önemli bir rol hücre zarı tamir temel moleküler mekanizmaları daha derin bir anlayış roman tedavi stratejileri için arama yararlı olacaktır. Bu, bu nedenle, Kinetik izlemek ve hücre zarının Onarım yeteneğini değerlendirmek için uygun deneysel teknikleri sahip olmak gereklidir. Birkaç vitro yöntemi membran onarım modelleme için tasarlanmıştır. Bir strateji bir pipet/cerrahi bıçaklı/tıraş bıçağı ile veya cam boncuk hücreleri16üzerinde çalışırken tarafından hücre kazıma kolaylaştırılabilir mekanik yaralanma içerir. Ancak, bu tür mekanik yaralanma daha büyük lezyonlar oluşturur ve hücre yaralanmalarında, içinde ve kültürler arası değişim yüksek derecede oluşturur.
Membran yaralar üreten başka bir lazer ablasyon İki fotonlu mikroskobu tarafından yöntemdir. Tek foton uyarma kullanan geleneksel lazer confocal mikroskobu aksine, İki fotonlu lazer aynı anda bir yüksek enerjili elektron17uyarma kolaylaştırmak için iki uzun dalga boyu, düşük enerjili fotonlar kullanır. Uyarma sadece odak düzlemi içinde ve tüm ışık yolunu17 (şekil 1) boyunca doğrusal olmayan bu işlem sonuçlanır. Bu uyarma birim yardımcı olur duyarlilik canlı hücreleri18,19görüntüleme en alt düzeyde tutmak için azaltılmış. Araştırmacılar bu nedenle hücre zarı ve monitör membran gerçek zamanlı olarak floresan boyalar kullanarak ve floresan yoğunluğu hücre membran yırtığı ve reseals olarak değişiklikler gözlemleyerek yeniden mühürlemeden kesin lezyonlar elde edebilecektir.
Bu yaklaşımı art arda içinde in vitro ve in vivo yaralama membran eğitim için kullanılan ve birden çok hücreye20,21türleri. Örneğin, membran fibroblastlar ve hastaların bu tekniği22,23kullanarak değerlendirildi dysferlinopathy türetilen myotubes hatalarını onarın. Ayrıca, tek kas lifleri fareler izole onarım yama oluşumu13,24,25izlemek için kullanılmıştır. Hareket fluorescently tagged proteinlerin tek kas lifleri9membran onarım sırasında da görülebilir. Ayrıca, Zebra balığı embriyo İki fotonlu lazer yaralama takip sarcolemmal onarım süreci içinde gerçek-zaman içinde vivo26görülebilmektedir.
Bu makalede, biz her ne kadar bu metodoloji plazma zarı yeteneği yeniden mühürlemeden miktarının amacıyla çeşitli hücre tiplerinin uygulanabilir hücre zarı tamir dinamiklerini kullanarak iki fotonlu lazer yaralama, fibroblastlar değerlendirmek için bir metodoloji anahat vitro. Bu yöntemde, hücreleri FM4-64 ile inkübe, olumsuz bağlanır gibi hızlı bir şekilde fluoresces lipofilik, hücre geçirimsiz boya fosfolipitler sitoplazma hücre membran lezyon üzerinden girdikten sonra içinde tahsil (Şekil 2&#38; 3). boya Floresans membran lezyon komşu miktar sağlar kendisini yeniden mühürlemek hücre zarı için geçen süre izlemek için. Bu yöntemin yarar örneklemek için biz tam uzunlukta dysferlin (DYSF) GFP Birleşik Plasmid'ler ile transfected dysferlinopathy hastanın fibroblast hücre zarı tamir kurtarma değerlendirmek için kullanın.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM)</td> <td>Thermo Fisher</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1051</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin (10.000 U / mL)</td> <td>Thermo Fisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA (% 0.05), fenol kırmızısı</td><td>Thermo Fisher</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Fosfat Tamponlu Tuzlu</td><td>Salamin Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>35mm kollajen kaplı cam tabanlı tabaklar</td><td>MatTek</td><td>P53GCOL-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Serumdan yoksun ortam</td><td>Thermo Fisher</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>Transfeksiyon reaktifi</td><td>Thermo Fisher</td><td>15338100</td><td></td></tr><tr><td>FM 4-64 Boya</td><td>Invitrogen</td><td>T13320</td><td></td></tr><tr><td>Tyrode' s Tuzlar Çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2397</td><td></td></tr><tr><td>Konfokal lazer tarama mikroskobu</td><td>Carl Zeiss</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Bukalemun İki fotonlu lazer</td><td>Tutarlı</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

İki fotonlu lazer mikroskop kullanarak hücre zarı tamir tahlil

Cell Membrane Repair Assay Using a Two-photon Laser Microscope

Çok sayıda patofizyolojik hakaret hücre zarlarında zarar verebilir ve hücre zarının onarım veya bütünlüğü, doğuştan gelen kusurlar ile birleştiğinde hastalığı neden olabilir. Hücre zarı tamir çevreleyen temel moleküler mekanizmaları anlama, bu nedenle, işlevsel olmayan hücre zarı dynamics ile ilişkili hastalıklar için yeni tedavi stratejilerinin geliştirilmesi için önemli bir amacın var. Hücre zarının çeşitli hastalık bağlamlarda yeniden mühürlemeden anlama amaçlayan birçok içinde in vitro ve in vivo çalışmada İki fotonlu lazer ablasyon fonksiyonel sonuçlar deneysel tedavileri takip belirlemek için standart olarak kullanmaktadır. Bu tahlil, hücre zarlarında hücre membran rüptürü ve hücre sızmaya floresan boya için neden bir iki fotonlu lazer ile yaralama için tabi tutulmaktadır. Hücre içinde floresan yoğunluğu sonra kendisini yeniden mühürlemek için hücrenin yeteneği ölçmek için takip edilebilir. Hücre zarının yanıt yaralanma, yaklaşım kendini yaralama İki fotonlu lazer büyük varyasyon olarak değerlendirmek için birkaç farklı yöntemi var, bu nedenle, hücre yaralama bir tek, birleştirilmiş model beneficially azaltmak için hizmet verecek Bu metodolojileri arasında varyasyon. Bu makalede, basit bir iki fotonlu lazer hücre zarı tamir vitro hem de sağlıklı ve dysferlinopathy hastanın fibroblast hücreleri veya bir tam uzunlukta dysferlin plazmid olmadan transfected değerlendirilmesi için protokol yaralama anahat.

Sağlıklı insan fibroblast, dysferlinopathy olmayan tedavi hasta fibroblastlar ve hasta fibroblastlar tam uzunlukta dysferlin sıra tabi yeteneği yeniden mühürlemeden membran değerlendirmek için iki fotonlu lazer yaralama için içeren bir plazmid transfected gerçek zamanlı olarak. Sağlıklı insan fibroblast hücreleri görüntülenen lazer yaralama takip FM 4-64 Floresans etkinleştirme düzeyi düşük ve sigara tedavi hasta fibroblastlar sergilenen yaralanma takip göreli floresan yoğunluğu yüksek de...

Hücre zarının iki fotonlu lazer ile yaralama membran yeniden mühürlemeden yeteneği değerlendirmek için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir ve birden çok hücre türü için uygulanabilir. Burada, vitro canlı İki fotonlu lazer ablasyon takip dysferlinopathy hasta hücrelerde membran yeniden mühürleme, görüntüleme için bir protokol açıklayın.

Numerous pathophysiological insults can cause damage to cell membranes and, when coupled with innate defects in cell membrane repair or integrity, can ...

Bu prosedürün genel amacı, kas distrofisi hasta hücrelerinde plazma zarının onarılabilirliğini ölçmektir. Bu yöntem, belirli bir mutasyon ile zarın yeniden kapatılması kinetiği arasındaki ilişki gibi kas distrofisindeki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, canlı hücrelerde zar yeniden mühürleme kinetiğinin gerçek zamanlı olarak ölçülmesine izin vermesidir.Fibroblast hücrelerini, 37 santigrat derecede bir karbondioksit inkübatöründe 40 mililitre büyüme ortamı içeren bir T225 şişesinde kültürleyerek başlayın. Kültür% 70 ila% 80 birleşmeye ulaştığında, hücreleri yıkama başına 40 mililitre PBS ile iki kez durulayın, ardından 37 santigrat derecede beş dakika boyunca beş mililitre% 0.05 tripsin ilave edin. Hücreler ayrıldığında, 40 mililitre taze büyüme ortamı ile reaksiyonu durdurun ve mililitre başına 100.000 hücre konsantrasyonunda iki mililitre hücreyi, 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte bir gece inkübasyon için 35 milimetre kollajen kaplı cam tabanlı plakalara tohumlayın.Transfeksiyon kültürü başına 1.5 mililitrelik bir tüpe 150 mikrolitre taze serumdan yoksun ortam ekleyin. Daha sonra, her tüpe üç mikrolitre transfeksiyon reaktifi ekleyin v

cell-membrane-repair-assay-using-a-two-photon-laser-microscope

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bütün hayvanlar MG53-aracılı hücre zarı tamir ve hücresel seviyede dinamik bir süreç görselleştirmek için kullanılan protokoller burada nitelendirdi. Bu yöntemler, plazma zarı mühürlenirken ve rejeneratif tıp ve hücre biyolojisi araştırmak için uygulanabilir.

MG53-aracılı Hücre Zarı Tamiri Görselleştirme In vivo Ve In vitro Sistemleri

Bu videoda, bir Drosophila melanogaster larvasındaki aksonların iki fotonlu lazer ablasyonu ve yaralanmayı indüklemek ve yaralanma bölgesini görüntülemek için örnek bir protokol açıklanmaktadır.

İki Foton Lazer Kaynaklı Nöral Yaralanma: Drosophila Larvalarında Akson Dejenerasyonu ve Rejenerasyonunu Gözlemlemek İçin Bir Yöntem

Bu video, memeli hücrelerinde plazma zarının yeniden kapatılma verimliliğini incelemek için bir testi göstermektedir. Hücreler, hücre zarında gözenekler oluşturan bakteriyel gözenek oluşturan bir toksine maruz kalır. Hücre dışı kalsiyum iyonlarının varlığında, gözenek kalsiyum akışına neden olur ve zarın yeniden kapanması olaylarına neden olur. Yeniden mühürleme verimliliği, hücrelere yalnızca yeniden kapatılmış bir zar olmadan giren DNA bağlayıcı propidyum iyodür boyası kullanılarak...

Plazma Membranının Yeniden Sızdırmazlık Verimliliğini Ölçmek için İn Vitro Floresan Bazlı Bir Test

Lipofilik boya FM1-43 maruz kalan hücrelerin canlı görüntüleme gözenek oluşturucu toksinler plazma membran kaldırılır hangi kinetiği tam belirlenmesini sağlar. Bu Ca 2 + gereksinimleri, sfingomiyelinaz ve plazma membranı onarım diğer faktörler değerlendirmek için kullanılabilecek bir hassas bir deneydir.

Ca Rolleri değerlendirilmesi için Görüntüleme Testi Canlı<sup&gt; 2 +</supGözenek oluşturucu Toksin yaraların tamiri&gt; ve sfingomiyelinaz

Iyileşme yaralı hücrelerinin hücre zarı gibi bir işlem yaralanma siteye özgü protein ve hücre içi bölmeler kaçakçılığı içerir. Bu protokol, bu süreçleri izlemek için deneyleri açıklar.

Görüntüleme Hücre Membran Hasarı ve Onarımı ilgilendim hücrealtı Süreçleri

Lazerler sıklıkla DNA hasarına hücre tepkisinin çalışmada kullanılır. Bununla birlikte, normal koşullar altında, aralık, sıklık, ve çarpışmalar çoğaltma çatal nadiren karakterize lezyonlar üretir. Burada, lazer lokalize kol içi çapraz bağlar ile bu parametrelerin belirlenmesini sağlayan bir yaklaşım açıklar.

Lazer Lokalize Psoralen adüktlerinin Tek Molekül Analizi

Bu protokol lazer microirradiation DNA hasar, nispeten basit kırılmalara ve DNA hasar sinyal ve onarım faktör montaj hasar sitelerde içinde vivo çalışmaya karmaşık hasarı gibi farklı türde ikna etmek için nasıl kullanılacağını açıklamak için hedeftir .

Vivo hücresel yanıt-e doğru basit ve karmaşık DNA hasarı incelemek için lazer Microirradiation

DNA hasar inducing ve DNA onarım proteinler seçili alt nükleer alanlarda yanıt izlemek confocal floresan mikroskopi ve lazer mikro-ışınlama teklif araçları. Bu teknik, hasar tespiti, sinyal ve işe alım ile ilgili bilgilerimizi önemli ölçüde ilerlemiştir. Bu el yazması tek ve Çift Kişilik strand sonu onarım incelemek için bu teknolojilerin gösterir.

Lazer mikro-ile kullanma için tek incelenmesi ve çift Strand Break onarım memeli hücrelerinde

DNA hasar onarım Kinetik eğitim lezyonlar tanımlanmış alt nükleer bölgeler itibariyle ikna etmek için bir sistem gerektirir. Biz bir yöntem bir 405 nm lazer ile donatılmış lazer tarama confocal mikroskop kullanarak yerelleştirilmiş çift iplikçikli kesmeleri oluşturmak ve tamir faktörler bu lezyonlar, dinamikleri ölçmek için otomatik yordamlar sağlar açıklar.

Soruşturma 405 Nm lazer mikro-ile kullanarak DNA lezyonlar için Protein alımı

Burada biz verimliliği Fluorometrik ve görüntüleme analizleri canlı hücreler aracılığıyla yeniden mühürlemeden plazma zarı ölçer yüksek üretilen iş floresans tabanlı bir tahlil tanımlamak. Bu tahlil uyuşturucu ya da plazma zarı memeli hücrelerinde yeniden mühürlemeden düzenleyen hedef genlerin eleme için kullanılabilir.

Plazma zarı verimliliği memeli hücrelerinde yeniden mühürlemeden yüksek üretilen iş ölçümü

Termoplazmonik delme yöntemi, hücrelerde ve dev unilameller veziküllerde plazma membran onarımı sırasında protein tepkilerini incelemek için konfokal mikroskopi, optik cımbız ve altın nanopartikülleri entegre eder. Teknik, hızlı ve lokalize membran delinmesini mümkün kılarak, anahtar proteinlerin ve bunların karmaşık plazma membran onarım mekanizmasındaki fonksiyonel rollerinin tanımlanmasına izin verir.

Canlı Hücrelerde ve Model Membranlarda Plazma Membran Onarımını Araştırmak İçin Termoplazmonik Bir Yaklaşım

Öğrenin, iki fotonlu lazer mikroskop kullanarak disferlinopati hastası fibroblast hücrelerinde hücre zarı tamir yeteneğini canlı görüntüleme ve niceliksel analiz yöntemini.

İki fotonlu lazer mikroskop kullanarak hücre zarı tamir tahlil

Daha fazla video keşfet