İki fotonlu lazer mikroskop kullanarak hücre zarı tamir tahlil

Bu prosedürün genel amacı, kas distrofisi hasta hücrelerinde plazma zarının onarılabilirliğini ölçmektir. Bu yöntem, belirli bir mutasyon ile zarın yeniden kapatılması kinetiği arasındaki ilişki gibi kas distrofisindeki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, canlı hücrelerde zar yeniden mühürleme kinetiğinin gerçek zamanlı olarak ölçülmesine izin vermesidir.

Fibroblast hücrelerini, 37 santigrat derecede bir karbondioksit inkübatöründe 40 mililitre büyüme ortamı içeren bir T225 şişesinde kültürleyerek başlayın. Kültür% 70 ila% 80 birleşmeye ulaştığında, hücreleri yıkama başına 40 mililitre PBS ile iki kez durulayın, ardından 37 santigrat derecede beş dakika boyunca beş mililitre% 0.05 tripsin ilave edin. Hücreler ayrıldığında, 40 mililitre taze büyüme ortamı ile reaksiyonu durdurun ve mililitre başına 100.000 hücre konsantrasyonunda iki mililitre hücreyi, 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte bir gece inkübasyon için 35 milimetre kollajen kaplı cam tabanlı plakalara tohumlayın.

Transfeksiyon kültürü başına 1.5 mililitrelik bir tüpe 150 mikrolitre taze serumdan yoksun ortam ekleyin. Daha sonra, her tüpe üç mikrolitre transfeksiyon reaktifi ekleyin ve tüpleri oda sıcaklığında en az beş dakika inkübe edin. Tüpler inkübe edilirken, plaka başına 1.5 mililitrelik ek bir tüpe 175 mikrolitre serum türevi ortam ve 3.5 mikrogram disferlin plazmit DNA ekleyin.

Daha sonra, oda sıcaklığında 20 dakikalık bir inkübasyon için 150 mikrolitre plazmit DNA çözeltisini, 150 mikrolitre transfeksiyon reaktifi ile plaka başına bir yeni tüpe birleştirin. Ertesi sabah, büyüme ortamını iki mililitre serum türevi ortamla değiştirin. İnkübasyonun sonunda, 300 mikrolitre plazmit çözeltisinin tamamını her bir plakaya eşit olarak dağıtın ve plakaları 37 santigrat derecede karbondioksit inkübatöründe 24 saat inkübe edin.

Ertesi gün, plazmid süpernatanı taze büyüme ortamı ile değiştirin ve plakaları 24 saat daha inkübatöre geri koyun. Hücreleri iki fotonlu bir yaralama testine hazırlamak için, transfekte edilmiş kültürleri bir mililitre Tyrode çözeltisi ile bir kez durulayın. Daha sonra hücrelere bir mikrolitre 2.5 milimolar FM4-64 boya ile desteklenmiş bir mililitre taze Tyrode çözeltisi ekleyin.

Daha sonra, ters çevrilmiş bir konfokal mikroskop kullanarak, mikroskobun yazılımında 0,2'ye iki mikronluk bir hedef oluşturun ve hedefi, hedef çizgi üst üste gelecek ve hücre zarına dik olacak şekilde hücre zarının kenarına yerleştirin. FM boya sinyalini uyarmak için 543 nanometre helyum neon lazer ve GFP sinyalini uyarmak için 488 nanometre argon lazer seçin ve algılama aralığını sırasıyla 600 ila 760 nanometre ve 500 ila 550 nanometre olarak ayarlayın. Ardından, ardışık görüntü taramalarından oluşan beş dakikalık bir zaman serisi oluşturun.

Bir membran lezyonu oluşturmak için, zaman serisinin başlangıcından 25 saniye sonra hücreleri ağartmak için 10 yineleme ile% 15 lazer gücünde 820 nanometreye kadar iki fotonlu bir lazer kullanın. FM4-64 boya floresansını ölçmek için, yazılımı altı x altı mikronluk bir ilgi alanı çizmek için kullanın ve ilgilenilen bölgeyi hücre içindeki yaralama yerinin yanına yerleştirin. Ardından, her bir zaman noktası için bağıl floresan değerlerini hesaplamak için arka plan değerini çıkarın ve net artışı sıfır zamanındaki floresan değerine bölün.

Sağlıklı insan fibroblast hücreleri, lazer yaralanmasını takiben düşük seviyelerde FM4-64 floresan aktivasyonu gösterirken, tedavi edilmeyen hasta fibroblastları, yaralanmayı takiben yüksek derecede nispi floresan yoğunluğu sergiler. Tam uzunlukta disferlin plazmidi ile transfekte edilen hasta hücreleri, tedavi edilmeyen hasta kontrollerine kıyasla azalmış bir nispi FM4-64 floresan yoğunluğu gösterir, ancak sağlıklı kontrollerde gözlenen floresan değerlerine benzer. Bu prosedürü denerken, hücrelerin tampon çözeltisinde yavaş yavaş öleceğini hatırlamak önemlidir, bu nedenle hızlı çalışın ve düzenli aralıklarla yeni hücrelere geçin.

Bu videoyu izledikten sonra, iki fotonlu bir mikroskop kullanarak zar lezyonlarının nasıl rejenere edileceğini ve membranın yeniden sızdırmazlığını gerçek zamanlı olarak nasıl ölçeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.