Name: Lökosit işe kültürlü damar hücreleri ve yapışık trombositler üzerinde araştırmak için Laminar akış tabanlı deneyleri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Keşfedin lökositlerin damar hücreleri ve trombositlerle etkileşim mekanizmalarını laminar akış deneyleriyle. Bu maliyet etkin yöntem, immünoloji ve hücre yapışması araştırmalarında çeşitli deney koşulları sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz Drs. Martin M. Schmitt ve satır Fraemohs teşekkür ederim. Bu eser bilimsel araştırma (ZonMW VIDI 016.126.358, Landsteiner Vakfı kan nakli araştırma (LSBR Nr. 1638) ve Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB1123/A2) R.R.K. için ödül için Hollanda Vakfı tarafından desteklenmiştir

Tüm yöntem tanımlamak burada tıbbi etik ve Maastricht University of hayvan etik kurulları tarafından onaylanmıştır.
1. akış tabanlı tahlil insan hücreleri ile
<ol><li>
İnsan kanı düşük trombosit yalıtım
	<ol>
<li>Venöz kan sitrat (% 3,2) antikoagülan çizin.</li>
		<li>Asit sitrat dekstroz hacmi 1/15 ekleyin (ACD: 80 mM TRISODYUM sitrat, 52 mM sitrik asit ve 183 mM glikoz) kan.</li>
		<li>350 x g fren trombosit zengin plazma (PRP) elde etmek 15 dakika olmadan, santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>15 mL konik tüp süpernatant nakletmek ve eklemek ACD hacmi 1/20.</li>
		<li>1110 g fren trombosit zavallı plazma (PPP) elde etmek 15 dakika olmadan, santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>Süpernatant atmak. Damlalıklı ipucu (P 1000) sonunda kesti, yapım o geniş, hangi AIDS önleme trombosit aktivasyon delik ve dikkatle trombosit tampon pH 6,6 PRP olarak aynı birimindeki trombosit Pelet askıya (PB: 136 mM NaCl, 10 mM Hepes 2.7 mM KCl, 2 mM MgCl2, % 0,1 sığır serum albümin ve % 0.1 glikoz). ACD hacmi 1/20 ekleyin ve karışımı yavaşça.</li>
		<li>Trombosit 1110 g fren 15dk için olmadan, cips.</li>
		<li>Süpernatant atın ve dikkatli olarak trombosit yukarıda 1 mL trombosit arabellek (pH 7.5) askıya alma.</li>
		<li>Bir otomatik Hematoloji analyzer ile 1/10 seyreltme trombosit konsantrasyon ölçmek.</li>
		<li>2 x 107/mL sayısını elde etmek için trombosit arabelleği (pH 7.5) ile ses düzeyini ayarlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Yalıtım polimorfonükleer hücre insan kanı (uyarlama Brinkmann vd. 11 )
	<ol>
<li>Kan 24 mL heparin (10 U/mL) antikoagülan olarak çizin.</li>
		<li>1.077 g/mL yoğunluk polysucrose sodyum diatrizoate orta 6 mL ekleyin ( Tablo malzemelerigörmek) 15 mL konik tüp ve dikkatle üst katmanı 5-6 mL tam kan.</li>
		<li>Santrifüj fren olmadan 800 x g de 20 dk için.</li>
		<li>Aspire edin ve açık sarımsı üst tabaka atmak ve granülosit taze 15 mL konik tüpler içine içeren alt kırmızımsı faz transfer. Hücreleri son hacmi 14 mL ve santrifüj fren olmadan 300 x g de 10 dakika için 2 mM EDTA içeren PBS ekleyerek yıkayın.</li>
		<li>Bu arada, bir yoğunluk gradient orta hazırlamak (örneğin, percoll, bkz: Malzemeler tablo) PBS hisse senedi çözüm x 2 mL 10 ile 18 mL yoğunluk gradient orta karıştırma tarafından çalışma çözüm. Bu çalışma çözüm PBS ile seyreltik (1 x 4.25 mL her biri % 85, % 80'i, % 75, % 70 ve % 65 degrade orta çözümler elde etmek için).</li>
		<li>2 konik tüpler yoğunluğu gradyan ile üst üste orta her yüzde 2 mL katman tarafından hazırlayın. En yüksek konsantrasyon ile başlarlar ve azalan düzende. Tüp katmanları bir su geçirmez marker ile işaretleyin.</li>
		<li>Dikkatli bir şekilde her iki hazır degradeler hücre süspansiyonlar 2 mL katman.</li>
		<li>Santrifüj vasıl 800 x g dikkatli bir şekilde dengeli bir santrifüj fren olmadan 20 dk için.</li>
		<li>Üst katmanı ve % 65 çoğunu Santrifüjü sonra Kaldır katman (ilk halka) ile PBMCs ve interphases % 85 katman kadar kalan beyaz yeni tüpler içine toplamak (ikinci halka, PMN).</li>
		<li>Hücreleri PBS 2 mM EDTA ile tüplerin ve santrifüj fren olmadan 300 x g, 10 dk kadar doldurarak yıkayın.</li>
		<li>Hank'in arabelleği (pH 7,45), içeren 10 mM Hepes ve % 0,2 insan albumini (tahlil arabellek) 1 mL posalı hücrelerde (genellikle ≥95% olan PMN) askıya alma ve süpernatant çıkarın.</li>
		<li>Bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak ve 1 x 106/mL hücreleri askıya alma.</li>
		<li>Floresan etiketleme ve perfüzyon lökositlerin (Adım 3.3) ile devam.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Yapisan trombosit - ve vasküler hücre-monolayers hazırlanması
	<ol>
<li>
Hücre kültür yemek hazırlama (kültürlü hücreleri)
		<ol>
<li>35 mm hücre kültür yemekleri 1 mL sulandırılmış sıçan kuyruk kollajen (30 µg/PBS 0.2 µm filtre filtre içinde seyreltilmiş mL) ile önceden kat.</li>
			<li>37 ° C'de 30 dk için kuluçkaya, kollajen çözüm atın ve bir kez PBS ile çanak yıkama.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Kültür vasküler hücre kültür yemekleri
		<ol>
<li>İlköğretim (örneğin, HUVEC, HAoEC, HAoSMC) veya (örneğin, EA. ölümsüzleştirdi damar hücreleri ayırma Hy926, SVEC) izdiham içinde bir T75 şişesi 1.5 mL hücre dekolmanı çözümü (örneğin, accutase) ile büyüdü. Hücre dekolmanı çözüm nötralize ve odası sayma bir hücreyle hücre konsantrasyonu belirlemek için uygun büyüme orta 4.5 mL ekleyin. Senaryo Özeti 105 hücre/mL uygun büyüme orta (örneğin, tam endotel hücre büyüme orta) x 0.5 askıya alma.</li>
			<li>Hücre süspansiyon 2 mL her 35 mm çanak ekleyin. Oksijen kuluçka %5 CO2 37 ° C'de hücreler (hücre türüne bağlı olarak 24-48 h alarak) izdiham kadar kültür.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Cam coverslip hazırlık (yapışık trombosit)
		<ol>
<li>Bir kez içinde HCl-alkol cam coverslip bırakın (1, 2 M / % 50 v/v).</li>
			<li>Coverslip 2 kez ultrasaf su içinde yıkayın.</li>
			<li>Coverslip altında N2kuru.</li>
			<li>Öncesi kat cam coverslip ile seyreltilmiş sıçan kuyruk kollajen perfüzyon TMMOB kanal konumunu uygun olarak 100 µL tip ı (30 µg/PBS 0.2 µm filtre filtre içinde seyreltilmiş mL).</li>
			<li>RT, 30 dk için kuluçkaya, kollajen çözüm atmak ve coverslip 3 yıkama x PBS ile.</li>
			<li>Blok kolajen kaplı coverslip HEPES RT. 0,5 h için % 1 BSA ile</li>
			<li>Yıkama ve coverslip kuru ve perfüzyon odasına monte edin. Trombosit insan üzerinden veya adım 1.1 ya da 2.1, sırasıyla belirtildiği gibi fare kan ayırma.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Trombosit immobilizasyon
		<ol>
<li>Kanal başına 2 x 107/mL trombosit süspansiyon, 70 µL ekleyin ve 37 ° C ve % 5 CO21,5 saat için kuluçkaya.</li>
			<li>Dikkatle yapışık olmayan trombosit engelleme çözüm (HEPES %5 BSA) için en az 30 dk RT. devam, floresan etiketleme ve perfüzyon lökositlerin (Adım 3.3) ile değiştirin.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Vasküler hücre monolayer uyarılması
		<ol>
<li>Vasküler hücre 10 ng/mL tümör nekrozis faktör α (TNFα) içeren taze medya ile medya değiştirerek CO237 ° C ve %5 4 h için teşvik etmek.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. akış tabanlı tahlil fare hücreleri ile
<ol><li>
Trombosit fare kandan yalıtım
	<ol>
<li>Kardiyak delik üzerinden 21 G iğne (~ 1 mL) kullanarak çizmek kan anestezi (ketamin 80 mg/kg ve medetomidine 0.3 mg/kg) 6-8 hafta-yaşlı fareler (C57Bl/6) sitrat (% 3,2) antikoagülan olarak.</li>
		<li>ACD hacmi 1/6 ekleyin.</li>
		<li>220 x g, santrifüj, trombosit zengin plazma (PRP) elde etmek 5 min için orta fren.</li>
		<li>Süpernatant (~ 600 µL) 1/3 kırmızı kan hücrelerinin yeni bir tüp transferi</li>
		<li>95 x g 6 min için fren olmadan, santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>Süpernatant (PRP) aktarmak ve trombosit konsantrasyon Tyrode'nın tampon 1/10 seyreltme ölçmek (TH arabellek: 136 mM NaCl, 5 mM Hepes, 2.7 mM KCl, 0,42 mM NaH2PO4* H2O, 2 mM MgCl2, % 0,1 sığır serum albümin ve % 0.1 glikoz) bir otomatik Hematoloji analyzer ile.</li>
		<li>Trombosit ACD + 0.1 U/mL apyrase 1/25 hacmi ekleyerek yıkama ve 2,870 g, 2 min için orta fren de santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>Süpernatant atın ve 600 µL TH arabellek, ACD hacmi 1/10 ve 0.1 U/mL apyrase ekleyin. Damlalıklı ipucu (P 1000) off kesmek, yapım o geniş, trombosit aktivasyon önlenmesinde yardımcı olur ve yavaşça Pelet askıya taşıyordu.</li>
		<li>Santrifüj 2,870 g de, 2 min için orta fren</li>
		<li>Süpernatant atın ve yavaşça trombosit TH arabellekte askıya alma.</li>
		<li>2 x 107/mL sayısını elde etmek için TH arabelleği ile ses düzeyini ayarlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Yapisan trombosit monolayers hazırlanması
	<ol>
<li>Cam coverslip (yapışık trombosit) 1.3.3 göre hazırlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Trombosit immobilizasyon
	<ol>
<li>Kanal başına 2 x 107/mL trombosit süspansiyon, 100 µL ekleyin ve 37 ° C ve % 5 CO21,5 saat için kuluçkaya.</li>
		<li>Dikkatle yapışık olmayan trombosit engelleme çözüm (HEPES %5 BSA) için en az 30 dk RT. devam, floresan etiketleme ve perfüzyon lökositlerin (Adım 3.3) ile eski yerine koymak ile</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Fare trombosit monolayer uyarılması
	<ol>
<li>Önce perfüzyon lökositlerin (Adım 3,3), trombosit Trombin perfüzyon tarafından teşvik (0.5 nM) HHHSA arabelleği için 37 ° C'de 3 dk.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. floresan etiketleme ve perfüzyon lökositlerin (PMN veya THP-1 insan ve RAW264.7 için veya birincil fare monosit fare akış tabanlı tahlil için)
<ol><li>
Floresan etiketleme
	<ol>
<li>Lökosit (1 x 106/mL) hücre permeant yeşil flüoresan nükleik asit leke (1 µM) ile etiketleyin. 37 ° C'de 30 dk için hücreleri kuluçkaya</li>
		<li>PBS ile hücreleri tarafından Santrifüjü 300 x g 5 min için de yıkama ve 0.5 x 106 hücre/mL (5 mL test durumuna bağlı olarak akış hızı başına) tahlil arabellekte bir konsantrasyon hücrelere askıya alma.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Akış odası tahlil hazırlık
	<ol>
<li>Lökosit yapışma hücre monolayer Tarih için çanak hücre kültür ortamından atın ve akış odasına topla. Boru şırıngaya takın. İmmobilize trombositler üzerinde lökosit yapışma için mikro slayt şırıngaya takın. Önceden bir su banyosu ile 37 ° c sıcak</li>
		<li>Bir perfüzyon şırınga (50 mL), yükleme şırınga tenkıye tutucusu ve pompa çekilme kümesi modu almak. Pompa birimi için 0 mL ve 50 mL şırınga için 26.70 mm çapı ayarlayın.</li>
		<li>Tüp tek bir amaç için bir dirsek radarı konektörüne takın. Radarı kilit bağlantı için belgili tanımlık tenkıye yerleştirin ve tüp radarı kilit coupler dirsek radarı konektörüne bağlayın. Ücretsiz tüp ucunu akışı odasına bağlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Lökosit perfüzyon ve yapışma
	<ol>
<li>Lökosit yapışma hücre monolayer Tarih için çanak hücre kültür ortamından atın ve akış odasına topla. Boru şırıngaya takın. İmmobilize trombositler üzerinde lökosit yapışma için mikro slayt şırıngaya takın.</li>
		<li>Lökosit perfüzyon ve üzerinde bir vasküler adezyon için-ya da trombosit monolayer, ikinci tüp tahlil tampon ve 1 mL damlalıklı ile boru dolgu içeren bir 50 mL konik tüp içine yerleştirin sonra tüp sıkmak ve akış odasına bağlayın.</li>
		<li>Lökosit perfüzyon önce 3 mM CaCl2 ve 2 mM MgCl2 hücre süspansiyon ekleyin ve 37 ° C'de 5 min için kuluçkaya</li>
		<li>Tahlil arabellek perfüzyon olası hava odası ve kablo kanalları kaldırmak için hücre önce sıvı.</li>
		<li>Onları sıkı sıkarak tüp biter kapatın ve hücre süspansiyon, tuzağa üzerinden hava kabarcıkları önlenmesi için tahlil arabellek üzerinden tüp geçiş. İlk hücreleri gelene kadar uygun akış hızı/makaslama stres içeren hücreler sıvı.</li>
		<li>Uygun akış hızı/makaslama stres 2 min için hücrelerle sıvı ve 2-6 dk bir ters faz kontrast/Floresans mikroskobu (örneğin, EVOS-FL) ile çalışırken ve yapışık hücrelerinin arasında en az 6 resim yakalama 100 X büyütme kullanarak bağlı bir CCD veya CMOS kamera için. Not: Akış odası boyutları ve perfusate viskozite akış hızı/makaslama stres bağlıdır. Burada kullanılan perfüzyon odası için (bkz. Tablo malzeme): Τη= * 97.1*Φ Τ: yamultma stres (1 dyn/cm2) Η: viskozite (0,015 dyn * s/cm2) Φ: akış hızı (0.67 mL/dk)</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Lökosit de-yapışma
	<ol>
<li>De-adhesion için tahlil arabelleğine hücre süspansiyon gelen tüp hava kabarcıkları sıkışmış olma engelleyen Borulama, sıkarak geçin.</li>
		<li>Hücreleri tarafından perfüzyon ile tahlil arabellek uygun akış hızı/makaslama stres (bkz: 3.3.7 Not) ile bağlantısını kesin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Lökosit hicret
	<ol>
<li>Lökosit hicret için lökosit (Adım 3) sıvı yeterli bir miktar lökositlerin uygun kadar (~ 50 hücreler/görünüm alanı).</li>
		<li>Lökosit süspansiyon tahlil arabellek ile değiştirin.</li>
		<li>Transmigrating hücreleri zaman atlamalı tarafından her 10-15 s 37 ° C'de 30-60 dk kayıt</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Dinauer, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+immune+deficiencies+with+defects+in+neutrophil+function%5BTitle%5D)+AND+%22American+Society+of+Hematology%22%5BJournal%5D)">Primary immune deficiencies with defects in neutrophil function.</a> American Society of Hematology. 2016 (1), Hematology / the Education Program of the American Society of Hematology. Education Program 43-50 (2016).</li>
<li>Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte-endothelial+cell+recognition%3A+three+%28or+more%29+steps+to+specificity+and+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Leukocyte-endothelial cell recognition: three (or more) steps to specificity and diversity.</a> Cell. 67 (6), 1033-1036 (1991).</li>
<li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traffic+signals+for+lymphocyte+recirculation+and+leukocyte+emigration%3A+the+multistep+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm.</a> Cell. 76 (2), 301-314 (1994).</li>
<li>Nourshargh, S., Alon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+migration+into+inflamed+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Leukocyte migration into inflamed tissues.</a> Immunity. 41 (5), 694-707 (2014).</li>
<li>Legein, B., Temmerman, L., Biessen, E. A. L., Lutgens, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+immune+system+interactions+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Inflammation and immune system interactions in atherosclerosis.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 70 (20), 3847-3869 (2013).</li>
<li>Wang, Y., Sakuma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+engagement+of+platelet+glycoprotein+Ibalpha+via+the+integrin+Mac-1+is+critical+for+the+biological+response+to+vascular+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Leukocyte engagement of platelet glycoprotein Ibalpha via the integrin Mac-1 is critical for the biological response to vascular injury.</a> Circulation. 112 (19), 2993-3000 (2005).</li>
<li>Zhao, Z., Vajen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+of+junctional+adhesion+molecule+A+from+platelets+increases+early-stage+neointima+formation+after+wire+injury+in+hyperlipidemic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cellular+and+molecular+medicine%22%5BJournal%5D)">Deletion of junctional adhesion molecule A from platelets increases early-stage neointima formation after wire injury in hyperlipidemic mice.</a> Journal of cellular and molecular medicine. , (2017).</li>
<li>Wang, Y., Gao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+integrin+Mac-1+regulates+thrombosis+via+interaction+with+platelet+GPIb%CE%B1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+communications%22%5BJournal%5D)">Leukocyte integrin Mac-1 regulates thrombosis via interaction with platelet GPIbα.</a> Nature communications. 8, 15559(2017).</li>
<li>Fujii, T. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S016793170200494X">PDMS-based microfluidic devices for biomedical applications.</a> Microelectronic Engineering. 61-62, 907-914 (2002).</li>
<li>Son, Y. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0032386106013061">Determination of shear viscosity and shear rate from pressure drop and flow rate relationship in a rectangular channel.</a> Polymer. 48 (2), 632-637 (2007).</li>
<li>Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps%3A+how+to+generate+and+visualize+them%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (36), e1724(2010).</li>
<li>Swamydas, M., Lionakis, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+purification+and+labeling+of+mouse+bone+marrow+neutrophils+for+functional+studies+and+adoptive+transfer+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (77), e50586(2013).</li>
<li>Schmitt, M. M. N., Megens, R. T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+junctional+adhesion+molecule-a+guides+monocytes+into+flow-dependent+predilection+sites+of+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Endothelial junctional adhesion molecule-a guides monocytes into flow-dependent predilection sites of atherosclerosis.</a> Circulation. 129 (1), 66-76 (2014).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu vitro tahlil vasküler enflamasyon sırasında lökosit alımı temel mekanizmaları araştırmak için basit bir yöntemdir, ancak dikkat edilmesi gereken bazı kritik nokta. Bu tahlil başarıyla gerçekleştirmek için ilk perfüzyon lökosit bir sağlam ve Konfluent vasküler veya trombosit monolayer gereksinimdir. Bu önceden kaplama kollajen türü olan yüzeylerin tarafından ben elde edilebilir. Genel olarak, birincil damar hücreleri ile çalışırken, yavaşça önerilen collagenase içeren dekolmanı çözüm kullanarak hücreleri ayırm...

Yaralanma, iltihap veya enfeksiyon lökosit hızlı patojen veya hasar-ilişkili için moleküler desen (PAMPs, DAMPs), aktif bir duruma değiştirmek ve inflamasyon ve doku hasarı sitelere kan akışı dışarı hareket yanıt. Onların hücresel ve moleküler çevre ile etkileşim olanağı lökositlerin lökosit yapışma eksikliği1gibi genetik bozukluklar tarafından vurgulanmış olarak bağışıklık hücreleri olarak onların doğru işlevi için esastır. Lökosit yapışma son on yıl boyunca yoğun soruşturma konusu olmuştur ve bu erken 1990'larda2,3lökosit yapışma cascade kavramı sonuçlandı. Lökosit yapışma lökositlerin endotel vasküler yüzey üzerinde rulo için hücreleri neden selektin-aracılı yakalama tarafından başlatılır. Bu inişli çıkışlı lökositlerin endotel bağımlı göçmen cues, örneğin, integrinler aktivasyonu teşvik kemokinler için taramak sağlar. Daha sonra aktif integrinler firma lökosit durması sonucu bağlama endotel ligandlar için aracılık. Lökosit daha sonra tarama ve endotel monolayer delici ve temel dokusuna transmigrating önce yayarak extravasate hazırlayabilirsiniz. Kurallı lökosit cascade temel kavramı sunulmasından bu yana büyük ölçüde değişmeden kalmıştır, bazı ara adımlar ile4ekledi. Yine de, tam moleküler mekanizmaları ve lökosit işe dahil birçok oyuncu rollerini şu ana kadar açıklık olmuştur değil ve lökosit işe alım enfeksiyon, inflamasyon ve (auto-) bağışıklık alanında önemli bir konu kalır araştırma.
Örneğin, ateroskleroz gibi vasküler inflamatuar hastalıklar sırasında gemi duvar sürücüler plak gelişme içine lökosit işe arttı. Kararsız aterosklerotik plaklar rüptürü, trombosit ve koagülasyon sisteminin büyük harekete geçirmek ve daha sonra5damar tıkanıklığı. Bu kalp krizi veya felç gibi ciddi kardiyovasküler sonuçlara yol açabilir. Buna ek olarak, klinik olarak, olarak endotel denudation oluşur örneğin bir koroner arter uygulaması sonra yol açar lökosit ve trombosit maruz damar duvar iç (örneğin, matris bileşenleri ve pürüzsüz etkileşimler çok sayıda kas hücreleri) ve vasküler yaralanma kapsayan trombosit ile lökositlerin. Bu etkileşimler monosit-trombosit etkileşimleri neointima oluşumu6,7sürücü olarak daha da geliştirilmesi hastalık için önemlidir. Buna ek olarak, trombosit-lökosit etkileşimleri lökosit integrin Mac-1 (αMβ2) aracılı ve trombosit GPIbα trombozu fareler8roman sürücüleri olarak son zamanlarda belirlenmiştir.
İnsan ve hayvan kan geniş durumu lökosit ve trombosit bir kaynak olarak araştırma ve izole matris molekülleri geniş yelpazede ve lökosit ve vasküler kökenli ölümsüzleştirdi hücre hatları için göz önüne alındığında, lökosit benzetimini yapmak için uygun etkileşimler bir laboratuvar ayarı, özel olarak tasarlanmış akışı perfüzyon Chambers'ı kullanarak akış altında. Adl değişik vakum odaklı kendinden yapışkanlı perfüzyon odalarına kadar geçen on yıl boyunca tasarlanmıştır. Tüm türevleri ortak yönü hareketsiz bölümü (örneğin, kültürlü damar hücreleri veya matris proteinler) önceden tanımlanmış bir kanal perfüzyon sıvıların hareketsiz bölümü üzerinde etkinleştirme ile donatılmış büyük bir sızıntı geçirmez odasına monte var. Buna ek olarak, teknoloji kalıp gelişmeler silis polimerler9tarihinde alan ısmarlama çözümler geliştirme etkin. Viskozite ve perfused sıvı akış hızı ve kanal yüksekliği esas olarak akış perfüzyon aygıt10makaslama stres özelliklerini belirlemek. Bu makalede, biz bir temel mekanizmaları yapıştırılması çalışma, de-yapışma için vitro yöntemi ve Hicret Arteryel ve venöz akışı rejimler altında lökositlerin mevcut. Burada sunulan yöntemleri onlar ortak kamera bağlı floresan mikroskop kullanılarak yapılır ve yüksek teknik yeterlilik Uluslararas› bir Denemecileri gerektirmeyen avantajdır. Vitro tahlil (inhibitörleri ekleyerek veya antikor engellemeörneğin,), birçok yönden manipüle edilebilir ve böylece damar iltihabı farklı modellerinde geçerli ve yapışma incelenmesi protein işlevleri sağlar veya belirli bileşikler değerlendirilmesi.

<table><tbody><tr><td>Ters floresan mikroskobu, örneğin EVOS-FL</td><td>Life Technologies Europe bv</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pompa örn. modeli: 210-CE</td><td>&nbsp; dünya hassas aletleri</td><td>78-9210W</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 35 mm TC ile İşlenmiş Kolay Kavrama Tarzı Hücre Kültürü Tabağı</td><td>corning</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>50 mL şırınga</td><td>Becton Dickinson</td><td>300137</td><td></td></tr><tr><td>Silikon boru&nbsp;</td><td>VWR</td><td>228-0700</td><td></td></tr><tr><td>Dirsek Luer Konnektör Erkek</td><td>Ibidi</td><td>10802</td><td></td></tr><tr><td>Dişi Luer Kilit Kuplörü</td><td>Ibidi</td><td>10823</td><td></td></tr><tr><td>Akış odası</td><td>Üniversite Hastanesi RWTH Aachen</td><td></td><td>Patent DE10328277A1: Baltus T, Dautzenberg R, Weber CPD. Str&ouml; mungskammer zur in-vitro-Untersuchung von physiologischen Vorg&auml; ngen an Zelloberfl&auml; Çetin. 2005. &nbsp;</td></tr><tr><td>Ibidi yapışkan slayt VI 0.4</td><td>Ibidi</td><td>80608</td><td></td></tr><tr><td>Yapışkan slaytlar için lameller&nbsp;</td><td>Ibidi</td><td>10812</td><td></td></tr><tr><td>Kollajen Tip I, sıçan kuyruğu</td><td>Life Technologies Europe bv</td><td>A1048301</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant İnsan TNF-&alfa;</td><td>Peprotech</td><td>300-01A</td><td></td></tr><tr><td>Peptid 6 için Trombin Reseptör Aktivatörü (TRAP - 6)</td><td>Anaspec / Eurogentec</td><td>24191</td><td></td></tr><tr><td>SYTO 13 yeşil floresan nükleik asit lekesi</td><td>Life Technologies Europe bv</td><td>S7575</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' Dengeli Tuz Çözeltisi 10x</td><td>Sigma-Aldrich Chemie</td><td>H4641</td><td></td></tr><tr><td>HEPES tampon çözeltisi 1M, sıvı</td><td>Life Technologies Europe bv</td><td>15630049</td><td></td></tr><tr><td>BUMINATE Albümin, %25&nbsp;</td><td>Baxter</td><td>60010</td><td></td></tr><tr><td>Enjeksiyonluk su</td><td>B. Braun</td><td>3624315</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür dihidrat</td><td>Merck</td><td>102382&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum klorür hekzahidrat&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich Chemie</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Apyrase</td><td>Sigma-Aldrich Chemie</td><td>A6535</td><td></td></tr><tr><td>Primer İnsan Umbilikal Ven Endotel Hücreleri (HUVEC)</td><td>Promocell GmbH</td><td>C-12203</td><td></td></tr><tr><td>Endotel Hücre Büyüme Ortamı (Kullanıma Hazır)</td><td>Promocell GmbH</td><td>C-22010</td><td></td></tr><tr><td>Primer İnsan Aort Endotel Hücreleri (HAoEC)</td><td>ATCC</td><td>&nbsp; PCS-100-011</td><td></td></tr><tr><td>Vasküler Hücreli Bazal Ortam&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>PCS-100-030</td><td></td></tr><tr><td>Endotel Hücre Büyüme Kiti-BBE</td><td>ATCC</td><td>PCS-100-040</td><td></td></tr><tr><td>Primer İnsan Aort Düz Kas Hücreleri (HAoSMC)</td><td>ATCC</td><td>PCS-100-012</td><td></td></tr><tr><td>Vasküler Düz Kas Hücresi Büyüme Kiti</td><td>ATCC</td><td>PCS-100-042</td><td></td></tr><tr><td>İnsan endotel hücre hattı, EA.hy926</td><td>ATCC</td><td>CRL-2922</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'lar Modifiye Eagle's Medium (DMEM)</td><td>ATCC</td><td>30-2002</td><td></td></tr><tr><td>Fare endotel hücre hattı, SV 40 dönüştürülmüş (SVEC4-10)</td><td>ATCC</td><td>CRL-2181</td><td></td></tr><tr><td>İnsan Monositik hücre hattı, Ultra-Glutamin ile THP-1</td><td>DSMZ</td><td>ACC-16</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Lonza</td><td>BE12-702F/U1</td><td></td></tr><tr><td>Fare monosit/makrofaj RAW264.7</td><td>ATCC</td><td>TIB-71</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Eagle's Medium (DMEM), yüksek glikozlu</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Promocell GmbH</td><td>C-41310</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma-Aldrich Chemie</td><td>P1644</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque 1119</td><td>Sigma-Aldrich Chemie</td><td>11191</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Life Technologies Europe bv</td><td>14200075</td><td></td></tr><tr><td>BD&nbsp; Sodyum Heparinli Vacutainer Plastik Kan Alma Tüpleri</td><td>Becton Dickinson</td><td>367876</td><td></td></tr><tr><td>VACUETTE TUBE 9 ml 9NC Pıhtılaşma sodyum sitrat %3.2 &nbsp;</td><td>Greiner Bio</td><td>455322</td><td></td></tr><tr><td>HCl/EtOH karışımı (1.2 mol/L HCl ve %50 etanol) su içinde</td><td>Sigma-Aldrich Chemie</td><td>Çeker ocakta 0.3L HCl (4 mol/L) ile 0.7L %70 v/v etanolü karıştırarak hazırlayın</td><td></td></tr></tbody></table>

lökosit işe kültürlü damar hücreleri ve yapışık trombositler üzerinde araştırmak için laminar akış tabanlı deneyleri

Laminar Flow-based Assays to Investigate Leukocyte Recruitment on Cultured Vascular Cells and Adherent Platelets

Lökosit yaralanma veya iltihap sitelerine yaralanma veya doku hasarı üzerine alımı son yıllarda incelenmiş ve lökosit yapışma cascade kavramında sonuçlandı. Ancak, lökosit işe dahil tam moleküler mekanizmalar henüz tam olarak tespit edilmiştir değil. Lökosit işe alım enfeksiyon, inflamasyon ve (auto-) bağışıklık araştırma alanında önemli bir konu kalır bu yana, biz temel mekanizmaları yapıştırılması çalışma, de-yapışma için basit bir laminar akış tabanlı tahlil mevcut ve hicret Arteryel ve venöz akışı rejimler altında lökositlerin. Vitro tahlil lökosit ve damar iltihabı farklı modellerde hücresel eşleri arasındaki etkileşimler altında yatan moleküler mekanizmaları incelemek için kullanılabilir. Bu iletişim kuralı, lökosit ve endotel hücreleri veya görüntülenir ve sonra kaydedilen trombosit etkileşimleri çalışmaya paralel akış odası ve bir ters faz kontrast mikroskobu bir kameraya bağlı kullanarak bir laminar akış tabanlı tahlil açıklar çevrimdışı analiz. Endotel hücreleri, trombosit veya lökosit inhibitörleri veya bu işlem sırasında belirli molekülleri rolünü belirlemek için antikorlar ile pretreated. Kesme koşulları, Yani atardamar veya toplardamar kesme stres, kolayca viskozite ve perfused sıvı akış hızı ve kanal yüksekliği tarafından adapte edilebilir.

Endotel lökosit yapışma çalışmaya fluorescently etiketli THP-1 hücreleri üzerinde 3 din/cm22 min için TNFα - veya sigara-uyarılmış endotel monolayer periosteum. Yapisan Monositik hücre toplam sayısı perfüzyon 2 dk sonra 6 bağımsız alan 2-6 dk bir süre içinde yakalama tarafından tespit edilmiştir. Yapışık hücreleri en az 6 resimleri bir ters faz kontrast/Floresans mikroskobu (örneğin, EVOS-FL) ele quantified bağlantılı CCD veya CMOS kamera 10 X büyütme kullanarak ve ort...

Lökosit heyecanla damar hücreleri ve trombositlerin damar duvar yaralanma sonra veya enflamasyon sırasında etkileşim. Burada, lökosit ve hücresel eşleri arasındaki etkileşimler altında yatan moleküler mekanizmaları karakterize etmek için basit bir laminar akış tabanlı tahlil açıklayın.

Lökosit işe kültürlü damar hücreleri ve yapışık trombositler üzerinde araştırmak için Laminar akış tabanlı deneyleri

The recruitment of leukocytes upon injury or inflammation to sites of injury or tissue damage has been investigated during recent decades and has resulted ...

Bu deneyin genel amacı, lökositlerin akış koşulları altında yapışık vasküler hücrelere veya trombositlere etkileşimlerinin arkasındaki mekanizmaları araştırmaktır. Bu yöntem, lökositlerin iltihaplanma bölgelerine nasıl alındığı gibi immünoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, uygun maliyetli, kullanıcı dostu olması ve çok çeşitli deneysel koşulların araştırılmasına izin vermesidir.Bu yöntem, lökosit yapışması hakkında fikir verebilir. Tümör hücrelerinin akış koşulları altında hareketsiz hücrelere veya substratlara yapışması gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Prosedürü gösteren, laboratuvarımda çalışan bir mühendis ve doktora öğrencisi olan Annemiek Dickhout olacak.Kan örnekleri alındıktan sonra kana 1/15 hacimde asit sitrat dekstroz ilave edilir. Daha sonra, trombositten zengin plazma elde etmek için frenleri 15 dakika boyunca 350 kez g'ye ayarlayarak kan örneğini santrifüjleyin. Daha sonra elde edilen süpernatanı 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve üzerine 1 / 10 hacimde asit sitrat dekstroz ekleyin.Yine, trombositten fakir plazma elde etmek için frenleri 15 dakika boyunca 1.120 kez g'ye ayarlayarak süspansiyonu sa

laminar-flow-based-assays-to-investigate-leukocyte-recruitment-on

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Trombosit adezyon kaskad kayma akışı varlığında yer alır, konvansiyonel (statik) iyi plaka deneyleri için bir faktör değildir. Bu makale, fizyolojik kesme akış koşulları taklit etmek için iyi bir mikroakışkan plaka formatı kullanan bir trombosit agregasyonu tahlil raporları.

Mikroakışkan Akış Hücreler kullanarak Akış altında Trombosit Yapışma ve toplama

Steril bir sürekli akış devresi, laminer akış kayma gerilmesi tabi yapışık hücrelere için bir yöntem tarif. Hücrelerin yapışma, morfoloji, şeffaf oda ile devre metaboliti analizi ve gelecek deneyler ya da kültür için kayma maruz kaldıktan sonra hasat hücreleri için alınan numuneler incelenmiştir olabilir.

Laminer Akış Kesme Stres altında endotel progenitör hücrelerin değerlendirin Paralel plakalı Akış Odası ve Sürekli Akış Devre

Source: Claes, J., et al, In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates a method for studying host-pathogen interactions using a micro-parallel plate flow chamber seeded with human primary endothelial cells. Following endothelial cell activation by an ionophore and perfusion with fluorescently labeled bacteria, the cells release von Willebrand factor (VWF), which binds bacterial adhesins under shear...

Micro-Parallel Plate Flow Chamber Model for Studying Bacterial Adhesion to Human Endothelial Cells

Bu video, lökositlerin ve endotel hücreleri gibi hücresel ortakların etkileşimini karakterize etmek için laminer akış tabanlı bir testi göstermektedir. Bu yöntem, sağlam ve birleşik bir vasküler hücre tabakası üzerine perfüze edildiğinde lökositlerin yapışması, adezyonu ve transmigrasyonu hakkında dinamik bilgiler sağlar.

Lökositler ve endotel hücreleri arasındaki etkileşimleri incelemek için laminer akış tabanlı bir test

Video, stromal hücrelerin lökosit alımı üzerindeki etkisini araştırmak için bir yöntem göstermektedir. Paralel bir plaka akış odası modelinde, pro-inflamatuar sitokinler, endotel hücreleri tarafından adezyon reseptörlerinin ekspresyonunu indükleyerek nötrofil alımını ve göçünü kolaylaştırır. Stromal hücreler ve endotel hücreleri arasındaki çapraz konuşma, endotel hücrelerine nötrofil alımını azaltır.

Stromal Hücrelerin Lökosit Alımı Üzerindeki Etkisinin İn Vitro Flow Araştırması

Karaciğer lökosit işe özgü karaciğer sinüzoidal endotel hücreleri ile kaplı olan hepatik sinüzoidler özel kanallar içinde gerçekleşir. Fizyolojik kesme stresi koşulları altında, insan karaciğer sinüzoidal endotelyumda lökosit işe faz kontrast mikroskopisi bu işlemi altında yatan moleküler mekanizmaların açıklanması kolaylaştırabilir.

Kayma Stres İnsan Karaciğer Sinüzoidal Endoteline altında Koşullarına Lökositer İşe Alım Eğitim için Bir Akış Adezyon Deneyi

Burada, biz araştırmacı bir fare dolaşım sistemine endotel kaynaklı yapışma molekülleri ile kaplanmış bir odayı bağlayarak lökosit işe dinamikleri ex vivo değerlendirmek için izin veren bir protokol mevcut. Göreceli biyolojik şartlar altında lökosit değerlendirme sağlar, bu yöntem önemli avantajlar sunar.

Bir Flow Koşullarında lökosit-endotel Etkileşimleri değerlendirilmesi Ex vivo Autoperfused Microflow Odası Deneyi

akışından lökositleri için iltihaplı endotel kabiliyeti mezenkimal stromal hücreler tarafından düzenlenir. Biz akışından nötrofil işe değerlendirmek ve mezenkimal stromal hücreler bu süreci düzenleyen oynadığı rolü incelemek için kullanılabilir birincil insan hücreleri içeren iki in vitro model tarif.

Akış adlı lökositlerin üzerine Stromal hücreler Etkilerinin İncelenmesi

Bu çalışma, trombosit yapışması, yayılması ve akış altında salgı çalışması için bir floresan mikroskopi tabanlı yöntem açıklanmaktadır. Bu çok yönlü platform tromboz ve hemostaz üzerine mekanik araştırma için trombosit fonksiyonunun araştırılmasını sağlar.

Akım altında Trombosit Degranülasyonu ve Salgılamanın Canlı Hücreli Görüntüleme

Burada, monosit subpopulation altında akış tüp bebek belirli yüzey işaretleyicileri ve confocal floresan mikroskopi kullanımı ile ticareti ölçer entegre bir iletişim kuralı mevcut. Bu iletişim kuralı diğer belirli yüzey işaretçileri kullanarak diğer lökosit alt türlerinden profil olarak sıralı işe alma adımları de keşfetmek için kullanılabilir.

Monosit altgrupları Vitro akışında altında alımı eş zamanlı çalışma

Adım adım bu iletişim kuralı deneysel kurulum ve inflamatuar hiPSC ECs yanıt-e doğru değerlendirilmesi için veri analizi ve lökosit yapışma fizyolojik akış altında analiz ayrıntılı açıklamasını sağlar.

Mikrosıvısal tahlil endotel hücrelere (hiPSC-ECs) insan indüklenen Pluripotent kök hücre kaynaklı lökosit yapışma değerlendirme için

Keşfedin lökositlerin damar hücreleri ve trombositlerle etkileşim mekanizmalarını laminar akış deneyleriyle. Bu maliyet etkin yöntem, immünoloji ve hücre yapışması araştırmalarında çeşitli deney koşulları sunar.

Lökosit işe kültürlü damar hücreleri ve yapışık trombositler üzerinde araştırmak için Laminar akış tabanlı deneyleri

Daha fazla video keşfet