Tek hücreli çözünürlük Floresans canlı görüntüleme Drosophila sirkadiyen saatler larva beyin kültür

Bu prosedürün genel amacı, çok günlü hızlandırılmış floresan mikroskobu için Drosophila larva beyinlerini kültürlemektir. Bu yöntem, belirli nöronal popülasyonlarda meydana gelen gen ekspresyonu değişiklikleri gibi Drosophila nörogenetiği alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, floresan probların canlı beyinde tek hücre çözünürlüğünde saatler ila günler boyunca görüntülenmesini sağlamasıdır.

Bu prosedür için reaktifleri hazırlarken, bir kültür başlığı altında çalışın. Başlamak için hem SAM besiyerinin hem de trombinin bir alikotu çözülmelidir. Trombini bir kenara koyun.

2,5 mililitrelik bir SAM alikotu alın ve kalan SAM'ı buzun üzerine koyun ve bir kenara koyun. Daha sonra penisilin streptomisini aliquoted SAM'a koyun ve oda sıcaklığında tutun. Uzun süreli görüntüleme deneyleri için, bir hayal odası hazırlayın, bir cam alt tabağın etrafındaki plastik bölgelere otoklavlanmış vakum gresi uygulayın.

Daha sonra yağlanmış kabı davlumbazın altında UV ışığı ile sterilize edin. Şimdi, fibrinojene bir SAM alikotu karıştırın ve karışımı iki saat boyunca polimerize olmayacağı 37 santigrat dereceye aktarın. Diseksiyon için, forsepsleri iki adet üç oyuklu cam diseksiyon kabında% 70 etanol ile temizleyin.

Daha sonra 400 mikrolitre DSS ile dört kuyu ve 400 mikrolitre SAM ile bir kuyu yükleyin. Diseksiyon kaplarını soğuk bir tabakta saklayın. Çoğalan sineklerden oluşan bir şişeden, dolaşmayan üçüncü instar larvaları içeren bir miktar ortam çıkarın ve forseps ile yediye kadar soğuk bir DSS kuyusuna aktarın.

Ardından, larvaları temizlemek için DSS yüklü dört kuyudan üçünden geçirin. Onları disseke olana kadar son kuyuda bırakın. Larva beyinlerini bir çift temiz ince forseps ile incelemek için DSS'nin dördüncü kuyusunu kullanın.

İyi kurulmuş içten dışa yöntemini kullanın. Yeterlilik ile her larva yaklaşık 30 saniye içinde işlenebilir. Her diseksiyondan sonra, beyni yaklaşık üç mikrolitre DSS'de SAM dolu kuyuya aktarmak için DSS ile önceden durulanmış 20 mikrolitrelik bir pipet ucu kullanın.

Gömme prosedürü için yedi adede kadar beyin hazırlayın. Beyni çalışma solüsyonuna aktardıktan sonra, beyni ve ortamı steril bir petri kabının kapağına dağıtın. Ardından, antibiyotikli 3,5 mikrolitre SAM daha ekleyin ve fibrinojenli 3,5 mikrolitre ılık SAM ekleyin.

İşlem boyunca fibrinojen içeren SAM ortamının 37 derecede tutulması önemlidir. Daha sonra, aynı pipet ucuyla hafifçe pipetleyerek çözeltiyi beynin etrafında karıştırın ve bir cam tabanlı tabak için bir lamel üzerine biriktirmek üzere çözeltiden iki mikrolitre aspire edin. Daha sonra damlacığa 0.8 mikrolitre trombin ekleyin ve beyaz görünecek olan polimerizasyonu başlatmak için çok hızlı bir şekilde karıştırın.

Ardından, beyni nazikçe almak için forseps kullanın ve polimerize edici fibrin matrisine yerleştirin. Sanırım trombin, beyin damlacığa aktarıldıktan sonra, prosedürün çoğunu karmaşıklaştırdığı için önerilmez. Beyni gerektiği gibi yönlendirin ve beyni çok nazikçe lamel üzerine mümkün olduğunca yaklaştırın.

Daha sonra bir polimerize fibrin tabakası seçin ve matrisi ayırmayan küçük ve yumuşak hareketler kullanarak beynin üstüne katlayın. Beyni stabilize etmek için pıhtının farklı bölgelerinden beynin üzerine polimerize fibrin katmanlarını katlamayı devam ettirin. Daha sonra trombin aktivitesini durdurmak için gömülü beynin üzerine antibiyotikli 20 mikrolitre SAM bırakın.

Bu prosedürü kullanarak, cam tabanlı bir tabağa beş ila altı beyin gömmeye devam edin. Uzun süreli görüntüleme için, gömülü beyinleri antibiyotikli 600 mikrolitre SAM'a daldırın. Daha sonra ortamın üzerine bir parça PTFE membran yerleştirin ve membranın kenarlarını tabağın yağlanmış kısımlarına yapıştırın.

Kısa tahliller için, tabağı iki mililitre SAM ile antibiyotiklerle doldurun, beyinleri daldırın ve PTFE zarının kullanımını atlayın. Tarif edilen prosedürler kullanılarak, bir saat nöron sürücüsü tarafından yönlendirilen bir moleküler saat raportörünü ifade eden beyinler, aydınlık-karanlıkta sürüklendi ve ardından eksplant kültürleri olarak hazırlandı. Uzun vadeli kültürler, hava kararmadan hemen önce, aydınlık evrede kuruldu.

Nörona karşılık gelen alanın ortalama floresan yoğunluğunda ilgilenilen nöronu içeren bir SUM yığını oluşturuldu, arka plan çıkarılmasından sonra ölçüldü. Raportör ifadesinin ritmikliğini belirlemek için hem maksimum entropi spektral analizi hem de manuel inceleme kullanıldı. Daha sonra, aynı genotipteki larvalar ya öznel şafaktan bir saat sonra ya da öznel alacakaranlıktan bir saat sonra diseke edildi.

Beyinler, bir temel elde etmek için bir saat içinde iki kez görüntülendi. Daha sonra, kültür ortamına PDF veya araç eklendi ve beyinler altı saat boyunca saatlik olarak görüntülendi. Hava karardıktan kısa bir süre sonra hasat edilen beyinlerde, LNvs'deki PER-TDT ekspresyon profili, PDF ilavesi üzerine floresan yoğunluğunda günün zamanına bağlı bir artış gösterdi.

Bu aynı zamanda DN1'lerde ve daha az ölçüde DN2'lerde de meydana geldi. Bu videoyu izledikten sonra, 3 boyutlu bir fibrin matrisi kullanarak Drosophila larvalarından ex vivo beyin kültürünün nasıl yapıldığını iyi anlamış olmalısınız. Bir kez ustalaştıktan sonra, tüm prosedür diseksiyondan gömmeye kadar yaklaşık 30 dakika sürer.

Diseksiyonlara başlamadan önce, görüntüleme kurulumunu hazırlayın, böylece beyin gömüldükten hemen sonra görüntülenebilir. Bu prosedürü takiben, ek soruları yanıtlamak için yetişkin Drosophila beyinleri de floresan hızlandırılmış görüntüleme için kültürlenebilir.