Yaşam sağlam Zebra balığı tek hücreli Photoconversion

Bu fotokonversiyon tekniğinin genel amacı, tek bir hayvandaki tek hücreleri diğer floresan hücre popülasyonlarından ayırt etmektir. Bu yöntem, alandaki temel gelişimsel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir ve zaman içinde tek hücre göçünü görselleştirmemize izin verebilir. Bu tekniğin ana avantajı, minimal invaziv olması ve tek hücreleri veya daha büyük popülasyonları etiketlemek için kullanılabilmesidir.

Ek olarak, kullanıcı belirli bir ilgi alanını seçebilir ve istenen hedefi fotoğraflayabilir. Fotokonvertibl bir proteini eksprese eden erkek ve dişi transgenik zebra balıklarını çiftleştirdikten ve yumurtaları metin protokolüne göre topladıktan sonra, 24 hpf embriyoyu taramak için 488 nanometre ışık kaynağı ve GFP filtre setleri ile bir diseksiyon mikroskobu kullanın. Bir iğne veya cımbız kullanarak embriyoları manuel olarak dekoryonlayın.

Mikrodalgada, beş mililitre% 0.8 düşük erime noktalı agaroz çözeltisi hazırlayın. Agaroz dokunulamayacak kadar soğuduktan sonra, on milimetrelik cam kapaklı kayma tabanlı Petri kabının ortasına üç ila dört anestezi uygulanmış transgenik sox10 eos pozitif 48 hpf balığı yerleştirin. Kapak kaymasının yüzeyini kaplamak için yaklaşık bir milimetre veya yeterli agaroz ekleyin.

Ardından, balıkları yanlarına yerleştirmek için bir prob iğnesi kullanın, gerektiği gibi ayarlayın, agaroz katılaşır, bu da yaklaşık iki dakika sürecektir. Agaroz iki dakika katılaştıktan sonra, agar ve tabağın alt yüzeyi suya batırılana kadar% 0.02 aminobenzoik asit ester trikain içeren embriyo ortamını yavaşça tabağa ekleyin. Konfokal mikroskopi yapmak için konfokal yazılımı açın ve yakalama ve odaklama pencerelerini seçin.

Dönüştürme öncesi görüntüleme gerçekleştirmek için, yakalama penceresi ve yakalama ayarı açılır sekmesi altında görüntüleme parametrelerini seçin. İşte laboratuvara özel yığın ayarı, balık görüntüleme olarak adlandırılır. Numuneyi konfokal mikroskoba yerleştirin ve odaklamak için kaba ve ince ayar düğmelerini kullanın.

Ardından odak penceresini açın ve dorsal kök gangliyonu gibi istenen ilgi bölgesini bulun. Filtre seti menüsünde c488 lazeri seçin, pozlamayı 300 milisaniyeye, lazer gücünü beşe ve yoğunlaştırmayı 75'e ayarlayın. Ardından, yakalama türü bölümünün altında 3B kutusunu işaretleyin.

3D yakalama bölümünde, geçerli konumu kullan'ı seçin ve mevcut aralığı kontrol edin. Aynı bölümde aralığı 35, düzlem sayısını 36 ve adım boyutunu bir olarak ayarlayın. Geçerli konumu seçin, ardından bir görüntü elde etmek için yakalama penceresinin altındaki başlat'ı tıklayın.

Fotodönüştürme işleminden önce, lazer parametrelerini iki ve üç kez kontrol ettiğinizden emin olun. Bazen, dönüştürme penceresi açıkken dönüştürme ayarlarını yeniden düzenlemek gerekir. Yakalama penceresinde, yakalama penceresi ayarı açılır sekmesinin altında, laboratuvara özel dönüştürme görüntüleme ayarını seçin.

Burada laboratuvara özel ayar, balık ablate tam çip olarak adlandırılır. Filtre menü seti altında c488 ve c541 lazerleri seçin. Pozlamaları 300 milisaniyeye, lazer gücünü beşe ve yoğunlaştırmayı 75'e ayarlayın, bu da fotoağartma veya toksisiteye neden olmadan yeterli floresan sinyali üretecektir.

Odak penceresinde, fotomanipülasyon sekmesine tıklayın ve lazer yığını gücünü ikiye değiştirin ve ardından git'e tıklayın. Raster blok boyutunu bir olarak değiştirin ve ayarla'ya tıklayın. Ardından çift tıklama boyutunu dört ve lazer çizgisini v405 olarak değiştirin.

Ardından, yakalama penceresinde gelişmiş yakalama ayarlarını açın. Fotomanipülasyon sekmesini seçin ve çift tıklama tekrarlarını iki olarak değiştirin, ardından Tamam'ı tıklayın. Odak penceresinde xy sekmesini seçin.

Fotomanipülasyon sekmesinde, lazer parametrelerini iki kez kontrol edin. Ardından, çevredeki hücrelerin fotodönüşümü olmadan ilgilenilen hücreyi fotoconvert etmek için lazer ayarlarını ayarlayın. Yakalama türü altında, zaman atlamalı çekim kutusunu işaretleyin ve ardından başlat'ı tıklayın.

Canlı timelapse penceresi açıldığında, üst araç çubuğundaki daire aracını seçin. Hücrenin en orta bölgesine bir daire çizin, ardından çizilen daireye sağ tıklayın, FRAP Bölgesi'ni seçin ve üç saniye bekleyin. Seçilen alan, tıklamayı durdurduğunda daha sönük hale gelmelidir.

Birden fazla hayvanı görüntülüyorsanız, odak menüsündeki xy sekmesine geri dönün ve ikinci konumu seçin. Ardından, fotoğraf dönüştürmeyi tekrarlayın. Bir hücre popülasyonunu dönüştürmek için, timelapse penceresini açarak protokolü ve lazer perametreleri izleyin.

Şimdi, ilgilenilen bölgeyi FRAP yapmak için bir daire çizmek yerine, ilgilenilen bölgeye bir çizgi çizmek için çizgi aracını kullanın. Ardından, az önce gösterilen aynı parametreleri kullanarak bölgeyi FRAP. Tüm noktalar fotoğrafa dönüştürüldükten sonra, yakalama penceresindeki yakalama ayarı açılır sekmesinin altında, bu videoda daha önce açıklanan laboratuvara özgü standart yığın ayarını seçin.

C488 lazeri seçin ve pozlamayı 300 milisaniyeye, lazer gücünü beşe ve yoğunlaştırmayı 75'e ayarlayın. c541 lazeri seçin ve pozlamayı 500 milisaniyeye, lazer gücünü on'a ve yoğunlaştırmayı 75'e ayarlayın. Yakalama türü bölümünün altında, 3D kutusunu işaretleyin.

3D yakalama bölümünde, geçerli konumu kullan'ı seçin ve mevcut aralığı kontrol edin. Aynı bölümde, aralığı 35, düzlem sayısını 36 ve adım boyutunu bir olarak ayarlayın. İstenen görüntüleme derinliğine uyum sağlamak için aralık numarası artabilir veya azalabilir.

xy odak sekmesinde çarpma noktaları varsa, yakalama penceresinde çok noktalı liste seçeneğini seçin. Değilse, geçerli konumu seçin. Son olarak, yakalama penceresinin alt kısmında, bir görüntü elde etmek için başlat'a tıklayın.

Bu paneller, sox10 düzenleyici dizisinin kontrolü altında, fotokontrayl eos proteinini ifade eden, transgenik bir zebra balığından alınan bir ganglion içinde tek bir ön foto dönüşüm hücresini gösterir. Fotodönüşümü takiben, eos ilgilenilen bölgede belirgin bir şekilde mevcuttu, ancak hiçbir komşu hücre etiketlenmedi. Bu fotokonversiyon tekniğinin faydasını göstermek için, omuriliğin ventral tarafındaki bir hücre popülasyonu, bir çizgi kullanılarak UV ışığına maruz bırakıldı.

Daha sonra, hattın bölgesinde fotokonvertize eos proteinini gösteren görüntüler çekildi. Fotokonversiyon olmayan eos proteini diğer tüm alanlarda görüldü. Fotokonversiyondan birkaç saat sonra, hem dorsal hem de ventral konumlarda, omurilik bölgesi boyunca dağılmış fotokonvertif eos pozitif hücreleri gösteren aynı görüntüler alındı.

Bu bulgu, ventral spinal hücrelerin dorsal bölgelere yer değiştirdiği hipotezi ile tutarlıdır. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa 30 ila 45 dakika içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, ilgilendiğiniz bölgenin foto dönüşümü yaşadığını doğrulamak için dönüşüm sonrası bir resim çekmeyi unutmamanız önemlidir.

Bu prosedürü takiben, zaman içindeki hücresel göçü ve dinamikleri gözlemlemek için timelapse görüntüleme gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, bir floresan hücre popülasyonu içindeki tek hücreleri nasıl ayırt edeceğinizi iyi anlamış olmalısınız. Ultraviyole ışıkla çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken her zaman gerekli önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.

Örneğin, asla doğrudan ışığa bakmayın.