Name: Yaşam sağlam Zebra balığı tek hücreli Photoconversion (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Öğrenin, yaşam sağlam zebra balığında tek hücreli fotokonversiyon yöntemiyle hücre göçünü görselleştirmeyi. Bu minimal invaziv teknik, gelişimsel biyolojideki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bernard Kulemaka ve onların yararlı yorumlar ve reaktif rehberlik, Sam Connell ve Brent Redford, Zebra balığı bakımı için görüntüleme sorular ve Deborah Bang, Karen Heed ve Kay Stewart fielding için 3i Smith laboratuara üyeleri teşekkür ederiz. Bu eser Zebra balığı araştırma Üniversitesi Notre ve kök hücre Merkezi ve Notre Üniversitesi, Rejeneratif Tıp Üniversitesi, Notre Dame, Elizabeth ve Michael Gallagher aile, Alfred P. Sloan Vakfı, Merkezi tarafından desteklenmiştir Dame. Tüm hayvan çalışmaları Notre Dame Üniversitesi ile uyumlu IACUC Dr Cody Smith için yapıldı.

Tüm hayvan çalışmaları Üniversitesi Notre Dame kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi tarafından kabul edildi.
1. Zebra balığı numune hazırlanması
<ol><li>Bir yetişkin erkek ve bir yetişkin kadın Tg (Cabrio protein) Standart prosedürler13başına bir çiftleşme odasına koyun. Bu makale, access ancak photoconvertible proteini transgenic diğer çizgilerle nedeniyle balık9 -ebilmek var olmak kullanılmış aynı derecede Tg(sox10:eos) kullanın. Balık yatıyor musun diye birden fazla odasını ayarlayın. Balık odasında gece kalmak izin verir.</li>
	<li>Ertesi sabah, 100 mm Petri yemeklerinde yumurta toplamak. 24 saat sonrası döllenme (hpf) olgun yumurta daha önce tarama sağlar.</li>
	<li>Hayvanlar yukarıdaki heterozygotes transgene için olsaydı, diseksiyon mikroskop setlerinde Ekran 24 hpf yemekleri Tg(sox10:eos) + embriyo 488 nm ışık kaynağı ve GFP için filtre. TG(sox10:EOS) + embriyolar izole ve 48 olarak olgun için izin hpf.</li>
	<li>Dechorionate embriyo bir iğne veya cımbız ile elle.</li>
	<li>Hazırlamak ve 5 mL % 0.8 düşük erime noktası özel çözüm de mikrodalga.<ol>
<li>Özel soğukluk kez 3-4 imzalat Tg (sox10:eos) + 48 yerleştirin hpf balık bir 10 mm cam-coverslip merkezinde alt Petri kabına.</li>
		<li>Coverslip, yaklaşık 1 mL yüzey karşılamak için yeterli özel ekleyin. Bir sonda iğne balık üzerinde yan yana düzenlemek için kullanın. Hayvanların montaj sağlamak için kuvvetlendirmek özel izin. Sürekli Zebra balığı agar14katılaşır kadar yeniden düzenlemek için gerekli olabilir. Katılaşma yaklaşık 2 dakika sürer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Özel için 2 dk katılaşmış sonra yavaş yavaş %0.02 aminobenzoic asit ester agar ve çanak alt yüzeyinin batık kadar yemek için (Tricaine) içeren embriyo orta ekleyin. Bu yaklaşık 3 mL olmalıdır.</li>
</ol>2. mikroskop montaj ve öncesi dönüşüm görüntüleme
<ol><li>Confocal yazılımını açın ve yakalama ve odak windows [şekil 1] seçin. Yakalama penceresi altında laboratuvar özgü dönüşüm görüntüleme ayarı sekmesi [şekil 1] açılır ayarlama yakalama altında seçin. Burada, laboratuvar özgü ayarı "balık Imaging." denir</li>
	<li>Numune confocal etki alanına yerleştirin ve ders ve hassas ayar düğmeleri kullanarak odak haline getirmek.</li>
	<li>Odak penceresini açın ve istediğiniz bölgenin ilgi (yani dorsal kök gangliyon) bulun.</li>
	<li>C488 lazer filtresi ayarla menüsünden seçin. 300 MS pozu ayarlamak, 5 güç lazer ve 75 [Şekil 2] yoğunlaştırmak.</li>
	<li>Türü yakalama bölümünün altında 3D kutuyu işaretleyin. 3D yakalama bölümünde geçerli konumu kullan ' ı seçin ve çevresinde geçerli aralığınıdenetleyin. Aynı bölümünde, 35, 36 uçak ve adım boyu 1 sayısı aralığı ayarlayın. Aralığın artırılması veya azaltılması için görüntüleme alanını derinliği karşılamak için. Omurilik için 35-40 yığınları arasında bir aralık değeri genellikle yeterli [şekil 5] ' dir.</li>
	<li>Geçerli konumunu [şekil 5] seçin.</li>
	<li>Görüntü elde etmek için yakalama penceresinin altındaki Başlat'ı tıklatın.</li>
</ol>3. tek hücreli Photoconversion
<ol><li>Confocal yazılımını açın ve yakalama ve odak windows [şekil 1] seçin. Yakalama penceresi altında laboratuvar özgü dönüşüm görüntüleme ayarı sekmesi [şekil 1] açılır ayarlama yakalama altında seçin. Burada, laboratuvar özgü ayarı "Balık tam çip ablate." denir</li>
	<li>C488 ve c541 lazer filtresi ayarla menü altında seçin. Değil istimal aynı mikroskop bilgisayar yazılımı farklı lazerler ve seçin 488 nm ve 541 nm lazerler seçmek için menüyü bulun. 300 MS Etkilenmeler ayarla, 5 güç lazer ve 75 [Şekil 2] yoğunlaştırmak. Bu lazer ayarları photobleaching ya da toksisite neden olmadan floresan yeterli sinyal üreten göre seçilir. Toksisite veya photobleaching görselleştirildiği, lazer güç veya pozlama azaltın.</li>
	<li>Odak penceresini açın ve odak penceresindeki photomanipulation sekmesinde tıklatın. Lazer parametreleri uygun şekilde ayarlayın. Lazer yığın güç 2 olarak değiştirin ve sonra devam' ı tıklatın. Raster blok boyutu 1 olarak değiştirin ve ayarla' yı tıklatın. Çift tıklatma boyutu 4 olarak değiştirin. Lazer çizgi v405 için değiştirmek [şekil 3].</li>
	<li>Gelişmiş yakalama ayarlarını Yakalama penceresi içinde açın. Photomanipulation sekmesini seçin ve çift tıklatma tekrar 2 olarak değiştirin. [Şekil 4] Tamam'ı tıklatın.</li>
	<li>XY sekme odağı penceresinde seçin. Çift lazer parametreleri adım 2 [şekil 3, şekil 4] photomanipulation sekmesinde kontrol edin. Photoconvert hücre photoconversion çevreleyen hücre olmadan ilgi için lazer ayarlarını ayarlayın.<ol>
<li>Photoconversion bitişik hücre varsa, lazer gücü düşür. Photoconversion hücre oluşmazsa, lazer gücü arttırılabilir. En iyi şekilde, lazer güç photoconvert faiz ve çevresinde değil yalnızca bölgenin ayarlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Türü yakalamakaltında timelapse kutuyu işaretleyin. Sonra [şekil 6A] Başlat ' ı tıklatın.</li>
	<li>Bir kez canlı timelapse pencere açık, üst araç çubuğunda [Şekil 7] daire aracını seçin</li>
	<li>Hücrenin ortasındaki bölgede bir daire çizin. Doğru tıkırtı çizilmiş daire, sıkı BAĞLAMAK bölgeyiseçin ve 3 saniye bekleyin. Seçili alanı dimmer olacaktır [şekil 8]. Yakalama durdur' u tıklatın.</li>
	<li>Eğer birden fazla hayvan Imaging, geri odak menüsü ve seçme pozisyonu 2 XY sekmesine gidin. Daha sonra adımları 4.1-4,6 yineleyin.</li>
	<li>Hücreleri nüfusu dönüştürmek için bölgenin ilgi sıkı BAĞLAMAK, Çizgi aracını kullanmak için bir daire çizim yerine adımları 4.1-4.4 Protokolü ve lazer parametrelerini izleyin. Faiz bölge üzerinde bir çizgi çizin ve yukarıda listelenen aynı parametreleri kullanarak bölge sıkı BAĞLAMAK.</li>
</ol>4. mesaj-photoconversion görüntüleme
<ol><li>Bir kez tüm noktaları photoconverted. Adım 3 görüntüleme precoversion açıklanan ayarlama laboratuvar özgü standart görüntü yığını seçin. Bu yakalama Yakalama penceresinde [şekil 5] sekmesi açılır ayarlama altında bulunur.</li>
	<li>C488 lazer seçin ve 300ms maruz ayarla, 5 güç lazer ve 75 [Şekil 2] yoğunlaştırmak.</li>
	<li>C488 lazer olarak aynı menü altında bulunan c541 lazer seçin. 500 MS pozu ayarlamak, güç 10 lazer ve 75 [Şekil 9] yoğunlaştırmak.</li>
	<li>Türü yakalama bölümünün altında 3D kutuyu işaretleyin. 3D yakalama bölümünde geçerli konumu kullan ' ı seçin ve çevresinde geçerli aralığını denetleyin. Aynı bölümünde, 35, 36 uçak ve adım boyu 1 sayısı aralığı ayarlayın. Aralık sayı istediğiniz görüntüleme derinliği [şekil 5] karşılamak için azaltabilir veya artırabilirsiniz.</li>
	<li>XY odak sekmesinde birden çok nokta varsa, çok noktalı Listele seçeneğini yakalama penceresinde seçin. Eğer değilse, geçerli konumunu seçin.</li>
	<li>Görüntü elde etmek için yakalama penceresinin altındaki Başlat'ı tıklatın.</li>
</ol>

<ol><li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263 (5148), 802-805 (1994).</li>
<li>Livet, J., Weissman, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).</li>
<li>Goins, W. F., Krisky, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+vectors+for+gene+transfer+to+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurovirol%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus vectors for gene transfer to the nervous system.</a> J Neurovirol. 3 Suppl 1, S80-S88 (1997).</li>
<li>Boevink, P., Cruz, S., Hawes, C., Harris, N., Oparka, K. J. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1046/j.1365-313X.1996.10050935.x/abstract">Virus-mediated delivery of the green fluorescent protein to the endoplasmic reticulum of plant cells.</a> Plant J. 10 (5), 935-941 (1996).</li>
<li>Day, R. N., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fluorescent+protein+palette%3A+tools+for+cellular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Soc+Rev%22%5BJournal%5D)">The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging.</a> Chem Soc Rev. 38 (10), 2887-2921 (2009).</li>
<li>Wiedenmann, J., Ivanchenko, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EosFP%2C+a+fluorescent+marker+protein+with+UV-inducible+green-to-red+fluorescence+conversion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (45), 15905-15910 (2004).</li>
<li>Maurel, D., Banala, S., Laroche, T., Johnsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivatable+and+Photoconvertible+Fluorescent+Probes+for+Protein+Labeling%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Photoactivatable and Photoconvertible Fluorescent Probes for Protein Labeling.</a> ACS Chem Biol. 5 (5), 507-516 (2010).</li>
<li>Terskikh, A., Fradkov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%26%2334%3BFluorescent+timer%26%2334%3B%3A+protein+that+changes+color+with+time%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">&#34;Fluorescent timer&#34;: protein that changes color with time.</a> Science. 290 (5496), 1585-1588 (2000).</li>
<li>McGraw, H. F., Snelson, C. D., Prendergast, A., Suli, A., Raible, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postembryonic+neuronal+addition+in+Zebrafish+dorsal+root+ganglia+is+regulated+by+Notch+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Postembryonic neuronal addition in Zebrafish dorsal root ganglia is regulated by Notch signaling.</a> Neural Dev. 7 (23), (2012).</li>
<li>Smith, C. J., Morris, A. D., Welsh, T. G., Kucenas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contact-Mediated+Inhibition+Between+Oligodendrocyte+Progenitor+Cells+and+Motor+Exit+Point+Glia+Establishes+the+Spinal+Cord+Transition+Zone%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+biology%22%5BJournal%5D)">Contact-Mediated Inhibition Between Oligodendrocyte Progenitor Cells and Motor Exit Point Glia Establishes the Spinal Cord Transition Zone.</a> PLoS biology. 12 (9), e1001961(2014).</li>
<li>Ravanelli, A. M., Appel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+neurons+and+oligodendrocytes+arise+from+distinct+cell+lineages+by+progenitor+recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Motor neurons and oligodendrocytes arise from distinct cell lineages by progenitor recruitment.</a> Genes Dev. 29 (23), 2504-2515 (2015).</li>
<li>Smith, C. J., Johnson, K., Welsh, T. G., Barresi, M. J. F., Kucenas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radial+glia+inhibit+peripheral+glial+infiltration+into+the+spinal+cord+at+motor+exit+point+transition+zones%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Radial glia inhibit peripheral glial infiltration into the spinal cord at motor exit point transition zones.</a> Glia. , (2016).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8589427">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).</li>
<li>Kirby, B. B., Takada, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+time-lapse+imaging+shows+dynamic+oligodendrocyte+progenitor+behavior+during+zebrafish+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo time-lapse imaging shows dynamic oligodendrocyte progenitor behavior during zebrafish development.</a> Nat Neurosci. 9 (12), 1506-1511 (2006).</li>
<li>Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+gene+activity+in+mouse+embryos+in+utero+by+a+tamoxifen-inducible+form+of+Cre+recombinase%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase.</a> Curr Biol. 8 (24), 1323-1326 (1998).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Karmaşık dokularda, farklı hücre tipleri belirli etki alanlarına düzenleyin. Son zamanlarda teknikleri bu büyük doku yapıları1,2,3içinde etiket tek tek hücreler için kullanılması. Burada benzer şekilde tek hücre etkileşimleri ve karmaşık dokularda hücre nüfus etkileşimleri görselleştirmek için kullanılması gereken iki teknikleri göstermektedir. Photoconversion tekniği belirgin bir hücre etiketlemek için bilim adamı vardır kayma ...

Birden çok farklı hücre oluşturmak ve karmaşık hayvan ve bitki dokularında korumak için etkileşim. Bu hücrelerin çoğu kez ara ve yüksek çözünürlüklü mikroskobu olmadan bir tek hücre düzeyinde doku fiksasyon gerektiren komşulardan ayırt etmek zor. Ancak, nasıl bu doku formu anlamak, muhafaza ve hastalıklı olmak için nasıl tek içinde doku hücreleri araştırmak için gerekli oldu zaman içinde etkileşim vardır. İdeal olarak, bu deneyler tek hücre içinde bir doku fiksasyon zorunluluğu olmadan non-invaziv bir şekilde etiketleme gerektirir. Bilim adamları şimdi bu görev1,2,3,4gerçekleştirmek için çeşitli teknikler geliştirdik.
Keşif ve denizanası yeşil flüoresan protein (GFP) uygulanması ayrı hücre doku çevre1etiketleme için izin verilen bir heyecan verici bir yaklaşım oldu. Hücre özel Organizatör kullanarak, genetik olarak1etiketli hücre alt grubunu seçmek mümkündür. Alternatif olarak, GFP viral indüklenen ifade-ebilmek var olmak kullanmak için kullanıcı tarafından seçilen ifade GFP3,4. Her ne kadar tamamen yararlı, GFP genetik aracılı ifade kullanıcı tarafından seçilen ifade içinde bir alt doku hücrelerinin izin vermez; ve her ne kadar avantajlı, GFP, viral ifade invaziv olabilir. GFP türevleri ve farklı floresan proteinler doku içinde daha seyrek hızlı Brainbow gibi akıllı teknikleri ortaya çıkmasıyla, tek hücre ve karmaşık doku2, aralarında etkileşimleri görselleştirmek mümkün oldu 5. ancak, bu yaklaşımların bir rasgele moda hücrelerde etiket. İstenen deney görüntülenmesini tek bir hücre veya hücre deneyci tarafından tanımlanan nüfus gerektiriyorsa, bu nedenle sınırlıdır. Bu tür deneyler, bu, bir tek hücre biçimde ayırt etmek için manipüle edilebilir bir genetik olarak ifade edilen floresan protein için avantajlı olur diğer ve floresan floresan hücreleri ondan.
Bu hedefe ulaşmak için ve hücre biyolojisi karmaşık canlı bir doku içinde tek hücre görselleştirmek için tek hücre photoconversion farklı floresan proteinler6,7,8bilimsel topluluk kullanır. Genetik olarak kullanarak kontrol ifade bir yeşilden için UV maruz kalınca kırmızı floresan durumu geçişleri photoconvertible protein (Yani, eos, kaede, vb) (488 nm) ışık, biz tek bir hücre fluorescently etiketli ayırt edebilirsiniz Komşular6,7,8. Bu yaklaşım bizim confocal mikroskop lazer yığın ışıktan ilgi bir kırınım-sınırlı bölgesine doğrudan bağlı bir aparat kullanır. Bu teknik ile biz de tek hücre veya bir kullanıcı tarafından tanımlanan şekilde9,10,11daha büyük nüfus etiketleyebilirsiniz. Viral GFP tek hücre enjeksiyonlari karşılaştırıldığında minimal invasif tekniktir. Kavramının bir kanıtı olarak, biz bir gangliyon periferik sinir sistemi ve spinal kord9,10ventral tarafında bulunan hücreler gibi photoconvert daha büyük nüfus içindeki photoconvert tek hücreleri elimizden göstermek, 11,12. O zaman onların hareket ve farklılaşma geliştirme sırasında bir anlayış kazanmak için bu photoconverted hücre popülasyonlarının 24 saat sonra görselleştirebilirsiniz.

<table><tbody><tr><td>Tg(sox10:eos) zebra balığı hayvanları</td><td></td><td></td><td>Balıklar, Notre Dame Üniversitesi'ndeki balık tesisinden elde edildi ve çaprazlandı</td></tr><tr><td>100 X 15 mm petri kabı</td><td>VWR</td><td>25384-302</td><td></td></tr><tr><td>Embriyo ortamı</td><td></td><td></td><td>Embriyo ortamı haftalık olarak yapılır ve 5L RO su, 30uL metilen mavisi ve 200 mL tuz stoğu içeren Notre Dame Üniversitesi'ndeki balık tesisi tarafından sağlanır.</td></tr><tr><td>% 0.8 Düşük Erime Noktası Agaroz</td><td>nokta scientific inc</td><td>9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>35 X 10 mm cam lamel alt petri kabı</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>14021-20</td><td></td></tr><tr><td>İğne diseksiyon probu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>%0.002 3-aminobenzoik asit esteri (Trikain)</td><td>Fluka analitik</td><td>A5040-250G</td><td></td></tr><tr><td>GFP filtreli Floresan Diseksiyon Mikroskobu</td><td>Zeiss Axiozoom</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kongocal mikroskop, GFP ve RFP filtre setlerini uyarmak için lazerli</td><td>3i eğirme diski konfokal</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fotodönüşüm için UV ışık kaynağı (lazer)</td><td>405 nm lazer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slidebook yazılımı</td><td>3i</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metilen mavisi</td><td>Kordon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

yaşam sağlam zebra balığı tek hücreli photoconversion

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Hayvan ve bitki dokusu hücrelerinin farklı nüfus oluşur. Bu hücreler oluşturmak ve doku korumak için zaman içinde etkileşim ve bozulduğu zaman hastalığa neden olabilir. Bilim adamları özellikleri ve bu hücreler sağlam doku içinde doğal dinamikleri floresan proteinler hücre alt kümeleri arasında ifade ederek araştırmak için akıllı teknikleri geliştirdik. Ancak, zaman zaman, deneyler hücreleri tek hücre veya hücreleri nüfus şekilde, bazen doku içinde daha fazla seçili görselleştirme gerektirir. Bunu başarmak ve hücreleri nüfusu içindeki tek hücreleri görselleştirmek için bilim adamları tek hücreli photoconversion floresan proteinlerin kullanılan. Bu tekniği göstermek için biz burada nasıl UV ışığı bozulmamış bir ilgi bir Eos ifade hücreye doğrudan için Zebra balığı yaşayan gösteriyor. O zaman doku nasıl değiştirdiler belirlemek için bu photoconverted Eos+ hücreleri 24 saat sonra görüntü. Biz iki teknik tarif: tek hücre photoconversion ve hücre nüfusun photoconversions. Bu teknikler hücre-hücre etkileşimleri, hücre-kader ve farklılaşma ve hücre geçişleri, yapım o çok sayıda biyolojik sorularda uygulanabilir bir teknik görselleştirmek için kullanılabilir.

Photoconversion floresan proteinlerin bir doku6farklı hücrelerde etiketlemek için kullanılabilir. Bunu göstermek için Tg(sox10:eos) balık9 kullanılan sox10düzenleyici dizileri altında photoconvertible protein Eos ifade etmek için. Tg(sox10:eos) hayvanların 48 hpf olduğunu ilk monte edilmiş ve daha sonra oluşmuş olabilir herhangi bir non-spesifik photoconversion tespit etmek için yansıma. Dönüştürülmeyen floresan kü...

Burada, nasıl hücre photoconversion floresan protein, Eos, yaşayan hayvanlarda ifade belirli alanlara UV Işınlarına maruz kalma yoluyla elde edilir göstermek için bir iletişim kuralı mevcut.

Yaşam sağlam Zebra balığı tek hücreli Photoconversion

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Bu fotokonversiyon tekniğinin genel amacı, tek bir hayvandaki tek hücreleri diğer floresan hücre popülasyonlarından ayırt etmektir. Bu yöntem, alandaki temel gelişimsel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir ve zaman içinde tek hücre göçünü görselleştirmemize izin verebilir. Bu tekniğin ana avantajı, minimal invaziv olması ve tek hücreleri veya daha büyük popülasyonları etiketlemek için kullanılabilmesidir.Ek olarak, kullanıcı belirli bir ilgi alanını seçebilir ve istenen hedefi fotoğraflayabilir. Fotokonvertibl bir proteini eksprese eden erkek ve dişi transgenik zebra balıklarını çiftleştirdikten ve yumurtaları metin protokolüne göre topladıktan sonra, 24 hpf embriyoyu taramak için 488 nanometre ışık kaynağı ve GFP filtre setleri ile bir diseksiyon mikroskobu kullanın. Bir iğne veya cımbız kullanarak embriyoları manuel olarak dekoryonlayın.Mikrodalgada, beş mililitre% 0.8 düşük erime noktalı agaroz çözeltisi hazırlayın. Agaroz dokunulamayacak kadar soğuduktan sonra, on milimetrelik cam kapaklı kayma tabanlı Petri kabının ortasına üç ila dört anestezi uygulanmış transgenik sox10 eos pozitif 48 hpf balığı yerleştirin. Kapak kaymasının yüzeyini kaplamak için yaklaşık bir milimetre veya yeterli agaroz ekleyin.Ardından, balıkları yanlarına yerleştirmek için bir prob iğnesi kullanın, gerektiği gibi ayarlayın, agaroz katılaşır, bu da yaklaşık iki dakika sürecektir. Agaroz iki dakika katılaştıktan sonra, agar ve tabağın alt yüzeyi suya batırılana kadar% 0.02 aminobenzoik asit ester trikain içeren embriyo ortamını yavaşça tabağa ekleyin. Konfokal mikroskopi yapmak için konfokal yazılımı açın ve yakalama ve odaklama pencerelerini seçin.Dönüştürme öncesi görüntüleme gerçekleştirmek için, yakalama penceresi ve yakalama ayarı açılır sekmesi altında görüntüleme parametrelerini seçin. İşte laboratuvara özel yığın ayarı, balık görüntüleme olarak adlandırılır. Numuneyi konfokal mikroskoba yerleştirin ve odaklamak için kaba ve ince ayar düğmelerini kullanın.Ardından odak penceresini açın ve dorsal kök gangliyonu gibi istenen ilgi bölgesini bulun. Filtre seti menüsünde c488 lazeri seçin, pozlamayı 300 milisaniyeye, lazer gücünü beşe ve yoğunlaştırmayı 75'e ayarlayın. Ardından, yakalama türü bölümünün altında 3B kutusunu işaretleyin.3D yakalama bölümünde, geçerli konumu kullan'ı seçin ve mevcut aralığı kontrol edin. Aynı bölümde aralığı 35, düzlem sayısını 36 ve adım boyutunu bir olarak ayarlayın. Geçerli konumu seçin, ardından bir görüntü elde etmek için yakalama penceresinin altındaki başlat'ı tıklayın.Fotodönüştürme işleminden önce, lazer parametrelerini iki ve üç kez kontrol ettiğinizden emin olun. Bazen, dönüştürme penceresi açıkken dönüştürme ayarlarını yeniden düzenlemek gerekir. Yakalama penceresinde, yakalama penceresi ayarı açılır sekmesinin altında, laboratuvara özel dönüştürme görüntüleme ayarını seçin.Burada laboratuvara özel ayar, balık ablate tam çip olarak adlandırılır. Filtre menü seti altında c488 ve c541 lazerleri seçin. Pozlamaları 300 milisaniyeye, lazer gücünü beşe ve yoğunlaştırmayı 75'e ayarlayın, bu da fotoağartma veya toksisiteye neden olmadan yeterli floresan sinyali üretecektir.Odak penceresinde, fotomanipülasyon sekmesine tıklayın ve lazer yığını gücünü ikiye değiştirin ve ardından git'e tıklayın. Raster blok boyutunu bir olarak değiştirin ve ayarla'ya tıklayın. Ardından çift tıklama boyutunu dört ve lazer çizgisini v405 olarak değiştirin.Ardından, yakalama penceresinde gelişmiş yakalama ayarlarını açın. Fotomanipülasyon sekmesini seçin ve çift tıklama tekrarlarını iki olarak değiştirin, ardından Tamam'ı tıklayın. Odak penceresinde xy sekmesini seçin.Fotomanipülasyon sekmesinde, lazer parametrelerini iki kez kontrol edin. Ardından, çevredeki hücrelerin fotodönüşümü olmadan ilgilenilen hücreyi fotoconvert etmek için lazer ayarlarını ayarlayın. Yakalama türü altında, zaman atlamalı çekim kutusunu işaretleyin ve ardından başlat'ı tıklayın.Canlı timelapse penceresi açıldığında, üst araç çubuğundaki daire aracını seçin. Hücrenin en orta bölgesine bir daire çizin, ardından çizilen daireye sağ tıklayın, FRAP Bölgesi'ni seçin ve üç saniye bekleyin. Seçilen alan, tıklamayı durdurduğunda daha sönük hale gelmelidir.Birden fazla hayvanı görüntülüyorsanız, odak menüsündeki xy sekmesine geri dönün ve ikinci konumu seçin. Ardından, fotoğraf dönüştürmeyi tekrarlayın. Bir hücre popülasyonunu dönüştürmek için, timelapse penceresini açarak protokolü ve lazer perametreleri izleyin.Şimdi, ilgilenilen bölgeyi FRAP yapmak için bir daire çizmek yerine, ilgilenilen bölgeye bir çizgi çizmek için çizgi aracını kullanın. Ardından, az önce gösterilen aynı parametreleri kullanarak bölgeyi FRAP. Tüm noktalar fotoğrafa dönüştürüldükten sonra, yakalama penceresindeki yakalama ayarı açılır sekmesinin altında, bu videoda daha önce açıklanan laboratuvara özgü standart yığın ayarını seçin.C488 lazeri seçin ve pozlamayı 300 milisaniyeye, lazer gücünü beşe ve yoğunlaştırmayı 75'e ayarlayın. c541 lazeri seçin ve pozlamayı 500 milisaniyeye, lazer gücünü on'a ve yoğunlaştırmayı 75'e ayarlayın. Yakalama türü bölümünün altında, 3D kutusunu işaretleyin.3D yakalama bölümünde, geçerli konumu kullan'ı seçin ve mevcut aralığı kontrol edin. Aynı bölümde, aralığı 35, düzlem sayısını 36 ve adım boyutunu bir olarak ayarlayın. İstenen görüntüleme derinliğine uyum sağlamak için aralık numarası artabilir veya azalabilir.xy odak sekmesinde çarpma noktaları varsa, yakalama penceresinde çok noktalı liste seçeneğini seçin. Değilse, geçerli konumu seçin. Son olarak, yakalama penceresinin alt kısmında, bir görüntü elde etmek için başlat'a tıklayın.Bu paneller, sox10 düzenleyici dizisinin kontrolü altında, fotokontrayl eos proteinini ifade eden, transgenik bir zebra balığından alınan bir ganglion içinde tek bir ön foto dönüşüm hücresini gösterir. Fotodönüşümü takiben, eos ilgilenilen bölgede belirgin bir şekilde mevcuttu, ancak hiçbir komşu hücre etiketlenmedi. Bu fotokonversiyon tekniğinin faydasını göstermek için, omuriliğin ventral tarafındaki bir hücre popülasyonu, bir çizgi kullanılarak UV ışığına maruz bırakıldı.Daha sonra, hattın bölgesinde fotokonvertize eos proteinini gösteren görüntüler çekildi. Fotokonversiyon olmayan eos proteini diğer tüm alanlarda görüldü. Fotokonversiyondan birkaç saat sonra, hem dorsal hem de ventral konumlarda, omurilik bölgesi boyunca dağılmış fotokonvertif eos pozitif hücreleri gösteren aynı görüntüler alındı.Bu bulgu, ventral spinal hücrelerin dorsal bölgelere yer değiştirdiği hipotezi ile tutarlıdır. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa 30 ila 45 dakika içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, ilgilendiğiniz bölgenin foto dönüşümü yaşadığını doğrulamak için dönüşüm sonrası bir resim çekmeyi unutmamanız önemlidir.Bu prosedürü takiben, zaman içindeki hücresel göçü ve dinamikleri gözlemlemek için timelapse görüntüleme gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, bir floresan hücre popülasyonu içindeki tek hücreleri nasıl ayırt edeceğinizi iyi anlamış olmalısınız. Ultraviyole ışıkla çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken her zaman gerekli önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.Örneğin, asla doğrudan ışığa bakmayın.

single-cell-photoconversion-in-living-intact-zebrafish

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Multiphoton mikroskobu optik derin penetrasyon ve azaltılmış fototoksisite düşük enerjili fotonların kontrol sağlar. Biz zebrafish embriyolar canlı hücre etiketlenmesi için bu teknolojinin kullanımını anlatmayacağız. Bu protokol fotoğraf indüksiyonu için çeşitli ışık duyarlı moleküllerin kolayca adapte edilebilir.

Canlı Zebra balığı Embriyolar iki-Foton-Tabanlı fotoaktivasyon

Bu video, çok renkli konfokal zaman atlamalı görüntüleme ve hedeflenen hücre ablasyon teknikleri verilmektedir. Time-lapse görüntüleme ilgi birden fazla hücre tiplerinin davranışlarını izlemek için...

Transgenik Zebra balığı Multicolor Time-lapse Görüntüleme: Hedefli Nöronal Hücre Ablasyon aktifleşir görselleştirme Retina Kök Hücreler

Safir femtosaniye lazer osilatör: Ti bir yöntem olup, bir iki-fotonlu emme ile bir kafes floresan proteini içeren tek bir hücre photoactivate için tarif edilmiştir. Kader haritası için fotoaktive hücre, immunohistokimya kullanılır. Bu teknik, her hücre tipi için de uygulanabilir.

Zebra balığı Tek Hücre Kader Haritalama

Burada, canlı zebra balığı embriyosunda fotokonverte edilebilir floresan proteinlerin (PCFPs) fotoaktive anahtarlaması ve fotokonverte edilmiş proteinin gelişim sırasındaki belirli zaman noktalarında takibi için bir yöntem sunmaktayız. Bu metodoloji, canlı bir omurgalı organizmadaki farklı gelişimsel süreçlerin temelini oluşturan hücre biyolojik olaylarının izlenmesine olanak tanır.

Zebra balığı Geliştirme Sırasında Photoconvertible Proteinler kullanma Cep Takip

Bu video, fotokonvertibl yeşil floresan proteini eksprese eden transgenik zebra balığı larvaları kullanılarak lökosit alımının izlenmesini göstermektedir. Kırmızı floresan boya etiketli bakterilerin otik veziküle önceden enjekte edilmesi ve fotokonversiyonun indüklenmesi, lökositlerin göçünün, fagositozunun ve vücut boyunca dağılmasının gözlemlenmesini sağlayarak bağışıklık tepkisi dinamikleri hakkında değerli bilgiler sağlar.

Bakteriyel Enfekte Transgenik Zebra Balıklarında Fotokonversiyon Tabanlı Lökosit Takibi

Preneoplastik hücre ilerlemesi ve doğuştan gelen bağışıklık hücre etkileşim erken olayları incelenmesi anlamak ve kanser tedavisinde çok önemlidir. Burada şartlı epitel hücre dönüşümleri ve HRAS G12V zebra balığı larvası deri hücreleri ile doğuştan gelen bağışıklık hücre etkileşiminin daha sonra canlı görüntüleme uyarılması için bir yöntem tarif eder.

Larva Zebra balığı Skin bir İndüklenebilir Gal4 / UAS İfade Sisteminin Kullanılması doğuştan gelen bağışıklık ve preneoplastik Hücre Etkileşimleri Canlı Görüntüleme

Organellerin ve diğer hücre altı yapıların dinamik davranışlarını in vivo olarak görüntülemek, fizyolojik ve hastalık durumlarındaki işlevlerine ışık tutabilir. Burada, iki organeli, sentrozomları ve mitokondriyi genetik olarak etiketlemek ve dinamiklerini geniş alan ve konfokal mikroskopi kullanarak canlı zebra balığı embriyolarında görüntülemek için yöntemler sunuyoruz.

Yaşayan Zebra balığı Embriyo Hücre alt yapıları görüntüleme

GFP transgenik arka planlarında in vivo hücre takibi için güçlü, basit ve uygun maliyetli bir araç olarak fotoconvertible PSmOrange sistemini kurduk. Bu protokol, zebra balığı model sistemindeki uygulamasını açıklar.

Photoconvertible PSmOrange Sistemi kullanılarak GFP transgenik zebrafish hücreleri izleme

Zebra balığı retina rejenerasyon çoğunlukla sabit retina kullanılarak incelenmiştir. Ancak, bu tür interkinetic nükleer göç gibi dinamik süreçler rejeneratif tepki sırasında meydana gelen ve altında yatan mekanizmaları araştırmak için canlı hücre görüntüleme gerektirir. Burada, biz multiphoton mikroskopi kullanılarak Interkinetic Nükleer Göç (INM) gerçek zamanlı olarak izlemek için kültür ve görüntüleme koşulları açıklar.

Multiphoton Mikroskopi Canlı hücre Görüntüleme için Yetişkin Transgenik Zebra balığı Retina Eksplantlarından Kültür

Bu iletişim kuralı Kaede yaşayan endocardial hücreleri floresan proteinin photoconversion için bir yöntemi açıklar endocardial hücreleri izleme Atriyoventriküler kanal ve Atriyoventriküler kalp kapak geliştirme sırasında sağlar Zebra balığı embriyo .

Zebra balığı embriyo hücre Photoconversion ile aşağıdaki Endocardial doku hareketleri

Biz birincil hücre kültürleri zebra balığı embriyo transfection ve canlı hücre görüntüleme gibi primer hücre--dan yetişkin zebra balığı beyin hazırlamak için bir protokol için hazırlanması için etkili ve kullanımı kolay bir protokol mevcut.

Kültür ve zebra balığı primer hücre Transfection

Öğrenin, yaşam sağlam zebra balığında tek hücreli fotokonversiyon yöntemiyle hücre göçünü görselleştirmeyi. Bu minimal invaziv teknik, gelişimsel biyolojideki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olur.

Yaşam sağlam Zebra balığı tek hücreli Photoconversion

Daha fazla video keşfet