Name: Vitro ve In Vivo yaklaşımlar Bağırsak epitel hücre geçirgenliği belirlemek için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: Keşfedin bağırsak epitel hücre geçirgenliğini in vitro ve in vivo yöntemlerle. Bu teknik, inflamatuar bağırsak hastalıkları ve gastrointestinal hastalıkların tedavisi için değerli bilgiler sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışmada tamamlanmasında cömert yardım için Dr Jerrold R. Turner, Brigham ve kadın Hastanesi, Harvard Tıp Okulu, teşekkür ederim. Bu eser desteklenen (grant numarası 81470804, 31401229 ve 81200620) Çin'in ulusal doğal Bilim Vakfı, Doğa Bilimleri Vakfı, Jiangsu Province (grant numarası BK20180838 ve BK20140319), araştırma Innovation programı için Jiangsu Province, üniversite mezunları (grant numarası KYLX16-0116), ileri araştırma projeleri Soochow Üniversitesi (grant sayı SDY2015_06) ve Crohn ve kolit Vakfı Araştırma Bursu Ödülü (sayı 310801 vermek).

Bu çalışmada hayvan bakım ve kullanım iletişim kuralı, Cambridge-Suda genomik Kaynak Merkezi (CAM-SU), Soochow Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.
1. kaplama ve Caco-2bbe gözenekli Polikarbonat membranlar üzerinde bakım
<ol><li>Bir T75 şişesi ile kitle iletişim araçları içinde hücrelerin büyümesine (% 10 içeren DMEM FBS). Şişeler düzenli olarak, hücre yoğunluğu bağlı olarak beslenmeleri gerekir. Not: optimum kaplama için hücreleri hızla Böl ve hücre büyüme aşamasında olduğunu gösterir bir düz "kızarmış yumurtalı" şekil var.</li>
	<li>Hücrelerin % 80 birleşmesi olduğunda, kuluçka makinesi dışında şişesi ve medya sökün. 1-2 mL steril PBS (olmadan Ca2 +) ile kalan herhangi bir medya durulayın. Damlalıklı 1,5 mL tripsin-EDTA balonun içine ve yavaşça şişeye; kaya o zaman, şişeye 20 dk 37 ° C kuluçka sallanan olmadan yer.</li>
	<li>Hücreleri trypsinizing iken, yer gözenekli Polikarbonat membranlar (gözenek boyutu, 0.4 µm; Malzemeler tablobkz: yüzey alanı, 0,33 cm2;) 24-şey kalıplara içeren ekler. Kültür medya 1.0 mL bazal odası (membran alt boşluk) ekleyin.</li>
	<li>Medya şişesi ve şiddetle damlalıklı 5 mL damlalıklı şişeye tarafına hücreleri 5 - 10 kat gevşek, tek tek hücreler veya 2-3 hücre elde etmek için kümeler.</li>
	<li>
0,166 mL (1:8 seyreltme oranı elde) hücrelerinin apikal odasına (membran üst boşluk) plaka. 37 ° C'de 3 haftaya kadar kuluçkaya.
	<ol>
<li>Hücreleri üç kez haftalık dikkatle her şey bir basınç pompa kullanarak bazal yuvası ortamdan aspirating tarafından beslenir. Yavaşça medya 1 mL her ekleme apikal odanın içine damla.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. TER ölçme epitel metre (Volt/Ohm) kullanımı
Not: kültür Polikarbonat membranlar üzerinde yaklaşık 3 hafta sonra Caco-2BBe hücreler TER ölçüm için hazırsınız demektir.
<ol><li>Sitokin çalışmaları için bir gün önce ölçüm, IFNγ 10 ng/mL içeren medya ile bazal ortamı değiştirin. Deneme günü, ortamı 2.5 veya 7.5 ng/mL TNF içeren HBSS ile değiştirin. Not: IFNγ tedavi TNF reseptör 2 (TNFR2) ifade artırır16.</li>
	<li>Belgili tanımlık ölçme aygıtı düzeltmek için düzeltme elektrot giriş portuna takın ve "Ohm" modunu seçin. 1000 Ω bir okuma metre görüntüleyinceye kadar R Adj vida bir tornavida ile ayarlayın.</li>
	<li>% 70 etanol için 15-30 dakika yerleştirerek elektrotlar sterilize ve onları hava kuru 15 s. durulama için deneysel hücre kültür medya elektrot bekleyin.</li>
	<li>Kapatın ve güç kablosunu ve "Ohm" modunu seçin. Dikkatle bazal odası ve apikal odasına kısa uç elektrot köprüler uzun sonuna yerleştirin. Uzun elektrotlar medya ama doku kültürü ekler yukarıda yüzeyden daha kısa elektrot tutarak çanak alt dokunmak emin olun. Elektrotlar dikey tutun.</li>
	<li>Örnek ekler ve boş ekler (hücre olmadan ama HBSS ile kültür ekleryani ) dayanıklılığını ölçmek, 0, 1, 2, 3, 4 h sitokin tedaviden sonra. Direniş kaydedin.</li>
	<li>Farklı plaka biçimleri arasında tutarlılık sağlamak için ürün direnci ve etkili membran alanı hesaplamak: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/57032/57032eq1.jpg"> 24-şey ekler için 0,33 cm2etkili membran alandır.</li>
</ol>3. fare modeli Dextran sülfat sodyum (DSS)-kolit indüklenen
<ol><li>DSS %3.5 (wt/vol) son bir konsantrasyon autoclaved su ekleyin.</li>
	<li>% 3,5 yönetmek DSS 7 gün olmak üzere toplam 8-hafta-yaşlı erkek C57BL/6 fareler için. Normal içme suyu DSS olmadan kontrol fareler için vermek.<ol>
<li>DSS içeren su normal içme suyu için 7 gün sonra geçin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fareler tartmak ve klinik puanları her fare her gün değerlendirmek. Vücut ağırlığı, ilk vücut ağırlığının her fare ile normalleştirmek. Puanları tarafından dört parametre hastalık şiddeti göre tanımlanır: Rektal prolapsus (0-2), dışkı tutarlılık (0-2), kanama (0-2) ve aktivite (0-2)5. Bu parametreler için bir final klinik skoru gelen puanları toplamak.</li>
	<li>İki nokta üst üste doku histopatolojik durumunu analiz etmek için %1,2 (vol/vol) Avertin (0.6 mL/10 g vücut ağırlığı) 7 gün sonrası-DSS tedavi ile mayi (IP) enjeksiyonla fareler ötenazi. % 100 avertin bir hisse senedi hazırlamak için 2,2,2-tribromoethanol 10 g tert-amil alkol 10 ml ile karıştırın.  Karanlıkta 4 ° C'de depolayın Kullanmak için % 100 hisse senedi suda % 2 oranında seyreltin.</li>
	<li>Çekum ve iki nokta üst üste ayırma ve iki nokta üst üste5uzunluğunu ölçmek.</li>
	<li>0.5 cm kesimleri distal kolon ve düzeltme 15 mL şahin tüp 10 mL % 10 formalin gecede içeren kesti. Kademeli etanol sabit kurcalayarak yıkayın (75, 95 ve % 100) ve Ksilen. Parafin içinde belgili tanımlık doku katıştırmak ve 6 mm bölümleri Hematoksilen ve eozin8boyama için kesti.</li>
</ol>4. DSS kaynaklı kolit farelerde epitel bariyer geçirgenliği ölçüm
<ol><li>Bariyer geçirgenliği DSS yönetim başladıktan sonra 7 gün ölçmek.</li>
	<li>Tahlil günü, fareler 3 h için hızlı.</li>
	<li>Otoklav bir sonda ile besleme kısırlık, sonra sonda ile besleme fareler 150 µL 80 mg/mL 4 kDa FITC-dextran steril su ile emin olmak için iğne ve serum toplandıktan sonra standart eğri ölçmek için kullanılmayan FITC dextran tutmak. Fareler geçirgenliği hesaplama için tartmak. Not: Suda FITC dextran çözüm yapılmalıdır.</li>
	<li>Makas kullanarak, kuyruk 1 cm parçası küçük ve 100 µL kan serum koleksiyonu tüpler içine kuyruk toplamak. 10.000 x g oda sıcaklığında 10 dakika için toplanan kana spin.</li>
	<li>Serum 1:4 su oranında seyreltin. Eğri, 1:300, 1:1, 000, 1:3, 000, su ile kullanılmayan FITC dextran seyreltik bir standart hale getirmek için 1:10, 000, 1:30, 000, 1: 100, 000, 1:300, 000, 1:1, 000, 000 ve 1:3, 000, 000. 100 µL/iyi serum ve standart eğri örnekler 96-şey kalıplara ekleyin.</li>
	<li>Bir plaka okuyucu 485 uyarma/528 emisyon ile floresan okuyun. Standart eğri dayalı geçirgenlik değerleri hesaplamak ve seyreltme için düzeltmek için 4 tarafından çarpın.</li>
	<li>FITC dextran konsantrasyonu (Bu fareler hasta iseniz ve kilo kaybettim FITC dextran teslim farklılığı normale yardımcı olur) değerleri normalize etmek ağırlık tarafından bölün.</li>
</ol>

<ol><li>Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+mucosal+barrier+function+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Intestinal mucosal barrier function in health and disease.</a> Nature reviews. Immunology. 9, 799-809 (2009).</li>
<li>Odenwald, M. A., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intestinal+epithelial+barrier%3A+a+therapeutic+target%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Gastroenterology+%26+hepatology%22%5BJournal%5D)">The intestinal epithelial barrier: a therapeutic target?</a> Nature reviews. Gastroenterology & hepatology. 14, 9-21 (2017).</li>
<li>Clarke, H., Soler, A. P., Mullin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+C+activation+leads+to+dephosphorylation+of+occludin+and+tight+junction+permeability+increase+in+LLC-PK1+epithelial+cell+sheets%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Protein kinase C activation leads to dephosphorylation of occludin and tight junction permeability increase in LLC-PK1 epithelial cell sheets.</a> J. Cell Sci. 113 (Pt 18), 3187-3196 (2000).</li>
<li>Clayburgh, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+differentiation-dependent+splice+variant+of+myosin+light+chain+kinase%2C+MLCK1%2C+regulates+epithelial+tight+junction+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22J.Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A differentiation-dependent splice variant of myosin light chain kinase, MLCK1, regulates epithelial tight junction permeability.</a> J.Biol. Chem. 279, 55506-55513 (2004).</li>
<li>Su, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNFR2+activates+MLCK-dependent+tight+junction+dysregulation+to+cause+apoptosis-mediated+barrier+loss+and+experimental+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">TNFR2 activates MLCK-dependent tight junction dysregulation to cause apoptosis-mediated barrier loss and experimental colitis.</a> Gastroenterology. 145, 407-415 (2013).</li>
<li>Su, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+epithelial+tight+junction+dysfunction+causes+immune+activation+and+contributes+to+development+of+experimental+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Targeted epithelial tight junction dysfunction causes immune activation and contributes to development of experimental colitis.</a> Gastroenterology. 136, 551-563 (2009).</li>
<li>Zha, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+isoform+expression+and+subcellular+distribution+of+MYPT1+in+intestinal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Characterization of isoform expression and subcellular distribution of MYPT1 in intestinal epithelial cells.</a> Gene. 588, 1-6 (2016).</li>
<li>He, W. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+contractile+phenotypes+of+intestinal+smooth+muscle+in+mice+deficient+in+myosin+phosphatase+target+subunit+1%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Altered contractile phenotypes of intestinal smooth muscle in mice deficient in myosin phosphatase target subunit 1.</a> Gastroenterology. 144, e1451-e1455 (2013).</li>
<li>He, W. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+light+chain+kinase+is+central+to+smooth+muscle+contraction+and+required+for+gastrointestinal+motility+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Myosin light chain kinase is central to smooth muscle contraction and required for gastrointestinal motility in mice.</a> Gastroenterology. 135, 610-620 (2008).</li>
<li>Li, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+regulatory+light+chain+phosphorylation+is+associated+with+leiomyosarcoma+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Myosin regulatory light chain phosphorylation is associated with leiomyosarcoma development.</a> Biomed. Pharmacother. 92, 810-818 (2017).</li>
<li>Clayburgh, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+myosin+light+chain+kinase-dependent+barrier+dysfunction+mediates+T+cell+activation-induced+diarrhea+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Epithelial myosin light chain kinase-dependent barrier dysfunction mediates T cell activation-induced diarrhea in vivo.</a> J. Clin. Invest. 115, 2702-2715 (2005).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-gamma+and+tumor+necrosis+factor-alpha+synergize+to+induce+intestinal+epithelial+barrier+dysfunction+by+up-regulating+myosin+light+chain+kinase+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha synergize to induce intestinal epithelial barrier dysfunction by up-regulating myosin light chain kinase expression.</a> Am. J. Pathol. 166, 409-419 (2005).</li>
<li>Ye, D., Ma, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+mechanisms+that+mediate+basal+and+tumour+necrosis+factor-alpha-induced+regulation+of+myosin+light+chain+kinase+gene+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular mechanisms that mediate basal and tumour necrosis factor-alpha-induced regulation of myosin light chain kinase gene activity.</a> J. Cell Mol. Med. 12, 1331-1346 (2008).</li>
<li>Turner, J. R., Buschmann, M. M., Romero-Calvo, I., Sailer, A., Shen, L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25263012">The role of molecular remodeling in differential regulation of tight junction 300 permeability.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 36, 204-212 (2014).</li>
<li>Srinivasan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TEER+measurement+techniques+for+in+vitro+barrier+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lab.+Autom%22%5BJournal%5D)">TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems.</a> J. Lab. Autom. 20 (2), 107-126 (2015).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFN-gamma-induced+TNFR2+expression+is+required+for+TNF-dependent+intestinal+epithelial+barrier+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">IFN-gamma-induced TNFR2 expression is required for TNF-dependent intestinal epithelial barrier dysfunction.</a> Gastroenterology. 131, 1153-1163 (2006).</li>
<li>Peterson, M. D., Mooseker, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+enterocyte-like+brush+border+cytoskeleton+of+the+C2BBe+clones+of+the+human+intestinal+cell+line+Caco-2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Characterization of the enterocyte-like brush border cytoskeleton of the C2BBe clones of the human intestinal cell line Caco-2.</a> J. Cell Sci. 102 (Pt 3), 581-600 (1992).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+determine+intestinal+permeability+and+bacterial+translocation+during+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Methods to determine intestinal permeability and bacterial translocation during liver disease.</a> J. Immunol. Methods. 421, 44-53 (2015).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının bildirin.

Protokolünde çeşitli kritik adımlar vardır. Caco-2BBe (fırça sınır-ifade) hücreler her zaman TER ölçüm, Caco-2 hücre kültürünü ifade sınır ötesi fırça proteinlerin için seçildiği için kullanılır. Caco-2BBe hücreleri villus dinsel fenotip var ne zaman tam-Ayrıştırılan (kültür sonrası izdiham yaklaşık 3 hafta sonra)17. Ölçüm sırasında kontaminasyon ve elektrot sterilize etmek için gereklidir. Yordamı non-steril olduğundan, ölçümleri yalnızca en fazla 8 saat çoğu durumda için gerçekleştirilebilir. Öl...

Bağırsak epitel hücreleri sadece besin emilimi için sorumlu değildir, ama aynı zamanda patojen mikroorganizmaların ve mikrobiyal toksinler karşı savunmak için önemli bir bariyer oluşturmak. Bu bağırsak bariyer fonksiyonu sıkı kavşak geçirgenliği ve epitel hücre bütünlüğü1,2,3tarafından düzenlenir ve epitel bariyer fonksiyonunun disfonksiyon iltihabi bağırsak ile ilişkilidir hastalığı (IBD). Perijunctional actomyosin yüzük (PAMR) sıkı kavşak yakından bitişik hücre içinde yatıyor. Myosin hafif zincir (MLC) tarafından düzenlenir, PAMR daralma sıkı kavşak geçirgenliği4,5,6,7,8düzenlenmesi için önemlidir, 9,10. Tümör nekroz faktör (TNF) bağırsak bariyer kaybı etkinleşmiş Bağırsak epitel MLC kinaz (MICK) ifade ve occludin içselleştirilmesi11,12,13inducing için merkezi bir noktada bulunuyor.
İyonlar Na+ ve Cl- gibi gözenek veya sızıntı yolu14tarafından paracellular alan çapraz. "Sızan" bir epitel içinde TER değişiklikleri öncelikle değişmiş sıkı kavşak geçirgenliği yansıtmak. TER ölçüm hücre monolayers empedans göre sıkı Kavşağı geçirgenliği, Na+ ve-, Cl için öncelikle ölçmek için yaygın olarak kullanılan bir elektrofizyolojik yaklaşımdır. Farklı hücre tipleri, Bağırsak epitel hücreleri, pulmoner epitel hücreleri ve vasküler endotel hücreleri, gibi TER ölçülerini bildirilmiştir. Bu yöntemin avantajları, TER ölçümleri non-invaziv ve canlı hücreleri gerçek zamanlı olarak izlemek için kullanılan vardır. Buna ek olarak, TER ölçüm tekniği uyuşturucu toksisite çalışmaları15için yararlıdır.
Caco-2BBe hücreleri insan epitel kolorektal adenokarsinom hücre yapısı ve farklılaştırılmış küçük bağırsak epitel hücrelere benzer işlev vardır: Örneğin, microvilli ve küçük bağırsak fırça ile ilişkili enzimler bu hücreler var sınır. Bu nedenle, kültürlü Caco-2BBe monolayers bariyer fonksiyonu test etmek için bir vitro model olarak kullanılmaktadır.
Farelerde, kana lümen geçmeye FITC dextran yeteneği ölçerek bağırsak paracellular geçirgenliği çalışmaya yollarından biridir. Böylece, bağırsak geçirgenliği gavaging FITC dextran doğrudan içine fare ve kan içinde floresans ölçme tarafından tespit edilebilir. Aşağıdaki iletişim kuralı Bağırsak epitel geçirgenliği değerlendirmek için iki basit yöntem açıklanır vitro ve içinde vivo.

<table><tbody><tr><td>22 G gavaj iğnesi</td><td>VWR</td><td>20068-608</td><td></td></tr><tr><td>4 kDa FITC-dextran</td><td>Sigma</td><td>46944</td><td></td></tr><tr><td>Avertin</td><td>Sigma</td><td>T48402</td><td></td></tr><tr><td>Siyah Floresan için 96 oyuklu plakalar</td><td>Fisher</td><td>14-245-197A</td><td></td></tr><tr><td>C57/B6 fareler</td><td>Nanjing Üniversitesi Caco-2BBe hücreleri Nanjing Biyomedikal</td><td></td><td></td>Araştırma Enstitüsü</tr><tr><td></td><td>ATCC</td><td>CRL-2102</td><td></td></tr><tr><td>Dekstran sülfat sodyum</td><td>MP Biyomedikal,</td><td></td> yüksek glikoz ve sodyum piruvat ile DMED 2160110 <td></td></tr><tr><td></td><td>Hiplon</td><td>SH30243.01B</td><td></td></tr><tr><td>Epitel (Volt/Ohm) Metre</td><td>Millicell-ERS</td><td>MERS00002</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sinopharm Kimyasal Reaktif</td><td>10009218</td><td></td></tr><tr><td>Falcon tüpü (15 mL)</td><td>Corning</td><td></td><td></td>430791</tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Floresan mikroskobu</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Florometre</td><td>Biotek</td><td>Synergy 2</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td></td><td></td><td>138 mM NaCl, 0.3 mM Na2HPO4, 0.4 mM MgSO4, 0.5 mM MgCl2, 5.0 mM KCl, 0,3 mM KH<alt>2< / alt>PO<alt>4</alt>, 15,0 mM HEPES, 1,3 mM CaCl<alt>2</alt>, 25 mM glikoz ve nbsp;</td></tr><tr><td>IFNg</td><td>PeproTech</td><td>315-05-20</td><td></td></tr><tr><td>Modüler Doku Gömme Merkezi</td><td>Leica</td><td>EG1150H</td><td></td></tr><tr><td>Serum toplama tüpleri</td><td>Sarstedt</td><td>41.1378.005</td><td></td></tr><tr><td></td><td>430641</td><td></td><td>TNF</td></tr><tr><td></td><td>PeproTech</td><td>315-01A</td><td></td></tr><tr><td>Parraffin</td><td>Sigma</td><td>A6330-1CS</td><td></td></tr><tr><td>Polikarbonat membranlar (Transwell)</td><td>Costar</td><td>3413</td><td></td></tr><tr><td>Basınç pompası</td><td>AUTOSCIENCE</td><td>AP-9925</td><td></td></tr><tr><td>Döner Mikrotomi</td><td>Leica</td><td>RM2235</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Ksilen</td><td>Sinopharm Kimyasal Reaktif</td><td>10023418</td><td></td></tr></tbody></table>

vitro ve in vivo yaklaşımlar bağırsak epitel hücre geçirgenliği belirlemek için

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

Bağırsak bariyer patojen mikroorganizma ve mikrobiyal toksin karşı savunur. İşlevi sıkı kavşak geçirgenliği ve epitel hücre bütünlük tarafından düzenlenir ve bağırsak bariyer fonksiyonu bozulma gastrointestinal ve sistemik hastalık ilerleme katkıda bulunur. Burada Bağırsak epitel geçirgenliği ölçmek için iki basit yöntem anlatılmaktadır. Vitro, Caco-2BBe hücreleri bir monolayer doku kültürü wells kaplama ve transepithelial elektrik direnci (TER) bir epitel (volt/ohm) metre ile ölçülür. Bu yöntem olan Kullanıcı dostu işlem ve tekrarlanabilirlik nedeniyle ikna edici. İçinde vivo fareler 4 kDa floresein isothiocyanate (FITC) ile gavaged-dextran ve FITC dextran konsantrasyonları epitel geçirgenliği belirlemek için fare üzerinden toplanan serum örneklerinde ölçülen. Oral gavaj doğru bir doz sağlar ve bu nedenle bağırsak geçirgenliği vivoölçmek için tercih edilen yöntemdir. Birlikte ele alındığında, bu iki yöntem bağırsak epitel içinde in vitro ve in vivogeçirgenliği ölçüm yapabilir ve bu nedenle hastalıklar ve bariyer fonksiyonu arasındaki bağlantıyı çalışmaya kullanılması.

Kültür, Caco-2BBe hücreleri bir monolayer büyümek ve yavaşça fırça kenarlıklara sahip olgun dinsel enterositler ayırt etmek. Bu iletişim kuralı, Caco-2BBe hücreleri yüksek yoğunluklu Polikarbonat membranlar üzerinde kaplama ve hücrelerin % 100 confluency bir gün tohum sonra ulaştı. Ancak, bu aşamada farklılaşmamış hücreleri olan: tam hücreleri ayırt etmek için medya her 2-3 gün 3 hafta için değiştirilir. Hücre çekirdeği ile lekeli ve farklılaşmamış ve farklılaşmış hücreler arasındaki fark...

İki yöntem burada bağırsak bariyer fonksiyonunu belirlemek için sunulmuştur. Bir epitel metre (volt/ohm) doku kültürü kuyu içinde doğrudan kültürlü epiteli transepithelial Elektrik direniş ölçümler için kullanılır. Farelerde, FITC dextran sonda ile besleme yöntemi bağırsak geçirgenliği vivobelirlemek için kullanılır.

Vitro ve In Vivo yaklaşımlar Bağırsak epitel hücre geçirgenliği belirlemek için

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and ...

Bu deneyin genel amacı in vitro ve in vivo bağırsak epitel hücre geçirgenliğini ölçerek epitel bariyer disfonksiyonu neden olduğu hastalıkları incelemektir. Bu yöntem bağırsak bariyeri fonksiyon alanında anahtar sorulara cevap yardımcı olabilir, bu inflamatuar barsak hastalığı ile ilgili olanlar gibi. Bu tekniğin en büyük avantajı bağırsak epitel hücre geçirgenliğinin hem in vitro hem de in vivo olarak değerlendirilebiliyor olmasıdır.Bu tekniğin etkileri gastrointestinal hastalıkların tedavisi veya tanısına kadar uzanır, çünkü intestinal epitel bariyer disfonksiyonu bu hastalıklara katkıda bulunur. Bu yöntem bağırsak bariyer fonksiyonu içine fikir sağlayabilir rağmen, aynı zamanda diğer sistemlere uygulanabilir, ilaç toksisite çalışmaları ve diğer hücre türlerinin bariyer bütünlüğü gibi. Bazı adımları öğrenmek zor olduğundan, bu yöntemin görsel gösterimi önemlidir.Bu yöntemin doğru bir işlem artık metin açıklaması ile anlaşılabilir. Başlamak için, orta ile bir T75 şişesinde Caco-2bbe hücreleri büyümek. Hücre yoğunluğuna bağlı olarak şişeleri düzenli olarak besleyin.Hücreler %80 konca olduğunda, ortayı çıkarın ve 1-2 mililitre steril PBS kullanın. Trypsin-EDTA 1,5 mililitre ekleyin ve yavaşça şişe kaya. Sonra, 37 derece santigrat antiktoruna 20 dakika boyunca, sallanmadan yerleştirin.Hücreler denerken, gözenekli polikarbonat membranlar içeren kesici uçları 24 kuyu plakasına yerleştirin. Daha sonra membranın alt alanı olan bazal odaya 1 mililitre kültür ortamı ekleyin. Şişeye 5 mililitre orta litre ekleyin ve gevşek bireysel hücrelere kültürü ayırmak için, şişenin içine karşı hücreleri 5 ila 10 kez veya iki ila üç hücre kümeleri halinde şiddetle pipet.Plaka 0.166 hücrelerin mililitre membranın üst alanı olan apikal odasına. Sonra plakaları 37 derecede üç haftakadar kuluçkaya yatırın. Her kuyunun bazal bölmesinden ortayı dikkatlice aspire etmek için bir basınç pompası kullanarak hücreleri haftada üç kez besleyin.Daha sonra her kesici uça bir mililitre orta damlatın. Sitokin çalışmaları için, transepitel elektrikdirenci veya TER ölçümlerinden bir gün önce, bazal ortayı, mililitre interferon gama başına 10 nanogram içeren orta ile değiştirin. Deney günü, tnf mililitre başına 2,5 veya 7,5 nanogram içeren HBSS ile orta değiştirin.Sayacı düzeltmek için, düzeltme elektrotunu giriş noktasına takın ve Ohm modunu seçin. Daha sonra sayaç 1.000 ohm'luk bir okuma görüntüleyene kadar R Ayar vidasını ayarlamak için bir tornavida kullanın. Elektrotları 15 ila 30 dakika boyunca %70 etanolile sterilize edin ve 15 saniye boyunca kurumasını bekleyin.Daha sonra elektrotları deneysel hücre kültürü ortamında durulayın. Ardından, gücü açın ve Ohm modunu seçin. Elektrotları dikey tutarken, elektrot köprülerinin uzun uçlarını dikkatlice bazal odaya yerleştirin ve çanağa dokunmalarını sağlar.Daha sonra kısa uçları apikal odaya yerleştirin, ortam yüzeyinin altında kalmalarını sağlamak, ancak doku kültürünün üzerinde ekler. Sitokin tedavisinden sonra numunenin direncini ve boş kesici uçları 0, 1, 2, 3 ve 4 saat ölçün. O zaman direnişi kaydet.Farklı plaka biçimleri arasında tutarlılık elde etmek için, direnç ürün ve etkili membran alanı burada gösterildiği gibi hesaplayın. 24 kuyu kesici uç için etkili membran alanı 0,33 santimetre karedir. Kolitin indüklenebilmek için, otoklavlı suya dss ekleyin ve hacim başına %3,5 ağırlıkta son konsantrasyona ekleyin.Daha sonra 8 haftalık erkek C57 siyah altı fare kafeslerinde içme suyu yerine yedi gün toplam DSS çözeltisi kullanın. Fareleri kontrol etmek için DSS olmadan düzenli içme suyu verin. Yedinci günden sonra, DSS suyunu normal içme suyuna çevirin.Her gün, fareleri tartın ve hastalığın şiddetine göre tanımlanan klinik skorları dört parametre ile değerlendirin: rektal prolapsus, dışkı tutarlılığı, kanama ve aktivite. Son klinik puan için bu parametrelerden puanları toplamı. Kolon dokularının histopatolojik durumunu analiz etmek için yedi gün sonra DSS tedavisi, metin protokolüne göre fareler ötenazi sonra, kolon ve çekum izole, ve kolon uzunluğunu ölçmek.Distal kolondan 0.5 santimetrelik parçalar kesin ve bir gecede 10 mililitre formalin içeren 15 mililitrelik şahin tüpündeki dokuyu düzeltin. Sabit dokuları dereceli etanol ve ksilen ile yıkayın. Sonra parafin dokuları gömmek ve hematoksilin ve eozin boyama için altı milimetrelik kesitler kesti.DSS'ye bağlı farelerde epitel bariyer geçirgenliğini ölçmek için, DSS uygulamasının başlamasından yedi gün sonra, fareleri üç saat boyunca hızlı layın. Otoklav bir gavaj iğne kısırlık sağlamak için, sonra mililitre dört kilodalton FITC dextran steril suda fareler gavage başına 80 miligram 150 mikrolitre kullanın ve serum toplama sonra standart eğriyi ölçmek için kullanılmayan FITC dextran tutmak. Sonra, geçirgenlik hesaplamaiçin fareler ağırlık.Dört saat sonra, IP enjeksiyonu ile fareler anestezi sonra, refleksleri ve bıyık hareketi eksikliği ile uygun anestezi onaylamak. Sonra fareleri beş dakika boyunca bir ısı bloğuna yerleştirin. Bir makas kullanarak, kuyruğun bir santimetrelik parçasını kırpın ve kuyruktan 100 mikrolitre kan toplayıp serum toplama tüpüne yerleştirin.Toplanan kanı 10,000 kez g ve oda sıcaklığında on dakika döndürün. Suyla serumu 1'den 4'e seyrelt. Daha sonra, standart bir eğri yapmak için, kullanılmayan FITC dextran seyreltme hazırlamak için su kullanın.96 kuyu plakası içine serum ve standart eğri örnekleri kuyu başına 100 mikrolitre ekleyin. Bir plaka okuyucu kullanarak, 485 bir uyarma ve 528 bir emisyon floresan okuyun. Standart eğriyi temel alarak geçirgenlik değerlerini hesaplayın ve seyreltme için düzeltmek için dörtle çarpın.Değerleri normalleştirmek için FITC dextran konsantrasyonu ağırlığına bölün. Bu fareler hasta ise FITC dextran teslimat farkı normalleştirmek için yardımcı olur, ve kilo vermiş. Burada gösterilen Caco-2bbe hücreleri, farklılaşmamış ve farklılaşmış hücreler arasındaki farkı göstermek için çekirdek ve F-aktin lekeleri ile etiketlenmiştir.Stres lifleri açıkça farklılaşmamış hücrelerde görülür. Farklılaşmış hücreler, farklılaşmamış hücrelere göre daha küçük hacimli, daha büyük çekirdeklere ve daha az stres liflerine sahiptir. TNF MLCK bağımlı sıkı kavşak regülasyonu ile bağırsak bariyer kaybı merkezidir.Bu şekilde görüldüğü gibi, TNF doza bağımlı bir şekilde Caco-2bbe monolayer TER önemli ölçüde azalır, TNF epitel geçirgenliği artırır düşündürmektedir. İlk vücut ağırlıklarıyla karşılaştırıldığında, DSS ile tedavi edilen fareler önemli miktarda kilo kaybederler. Kolitin şiddeti rektal prolapsus, dışkı tutarlılığı, kanama ve aktivite ile puanlandırılır.Hematoksilin ve eozin ile boyanmış kolon dokularının kesitleri DSS ile tedavi edilen farelerde kolon mukozal hasarı göstermektedir. Buna ek olarak, kolon mahzeninin uzunluğu ve kolon kendisi, DSS ile tedavi farelerde azalır. Son olarak, kontrol fareleri ile karşılaştırıldığında, DSS ile tedavi edilen farelerde FITC dekstran boyama düzeylerinde yaklaşık iki kat artış vardır.Bu yordamı denerken, operasyonel prosedürleri standartlaştırarak ve istatistiksel yöntemler kullanarak hatayı en aza indirmeyi unutmamak önemlidir. Bu teknik, geliştirildikten sonra hem model organizmalarda hem de hücre hatlarında gastrointestinal hastalıkları araştırmak için bağırsak bariyeri fonksiyonu alanında araştırmacıların önünü açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, TER ölçerek, FITC dextran'ı katarak ve morfolojik ve histokimyasal değişiklikleri gözlemleyerek bağırsak epitelyal geçirgenliğini nasıl belirleyebildiğinizi iyi anlamalısınız.

in-vitro-vivo-approaches-to-determine-intestinal-epithelial-cell

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu protokol, eksize edilmiş bağırsak dokusu preparatlarının veya "bağırsak keselerinin" bağırsak bariyer fonksiyonunun ex vivo modeli olarak kullanımını tanımlar. Bu model, sindirim hastalığının hayvan modellerinde belirli bağırsak bölgelerinde hem epitel bariyerinin hem de mukoza jel tabakasının bütünlüğünü değerlendirmek için kullanılabilir.

Ex Vivo Bağırsak Sacs Gastrointestinal Hastalık Modelleri mukozal geçirgenliği Değerlendirmek için

enflamatuvar bağırsak hastalığı (IBD) Mevcut tedaviler, hastalığın semptomlarını hafifletmek amaçlamaktadır, ancak ciddi yan etkilere neden olabilir. Böylece, alternatif stratejiler hayvan kolit modellerinde araştırılmaktadır. Burada, klinik IBD işaretleri diyet takviyeleri yararlı etkileri böyle bir kolit modelinde analiz edilmektedir açıklar.

Deneysel Kolit sırasında Bağırsak epitel Bariyer Fonksiyonları Üzerine Ek Beslenme Faydalı Etkileri Analizi

Bu iletişim kuralı insan bağırsak organoids floresan mikroskopi kullanarak gerçek zamanlı aşağıdaki farmakolojik tedavide epitel bariyer geçirgenliği ölçümü açıklar ve cep mikroskobu canlı.

Gerçek zamanlı insan bağırsak Organoids epitel bariyer geçirgenliği ölçümü

Erişimi besinler, microbiota metabolitleri ve dolaşım için ilaçlar, gut-kan bariyerini (GBB) tarafından denetlenir. Biz hangi sık kullanılan dolaylı yöntemler aksine, karaciğer ve böbrek işlevleri tarafından etkilenmez neredeyse GBB geçirgenliği vivo içindeölçmek için doğrudan bir yöntem açıklanmaktadır.

Gut-kan bariyerini ve karaciğer metabolizması Microbiota ürünlerin değerlendirilmesi için In Vivo yöntemi

İntravital mikroskopiden yararlanan burada sunulan yöntem, canlı hayvanlarda bağırsak epitel hücresi dökülmesinin gerçek zamanlı olarak görüntülenmesidir. Bu nedenle anestezili farelerin topikal lekeli bağırsak mukozası (acriflavine ve rhodamineB-dextran) konfokal mikroskopi kullanılarak tek hücreçözünürlüğe kadar görüntülenir.

İntravital Mikroskopi Tabanlı Bir Yaklaşım Bağırsak Geçirgenliği ve Epitel Hücre Dökülme Performansını Değerlendirmek için

Burada, bağırsak bariyer fonksiyonunu, geçirgenliğini ve taşınmasını incelemek için insan organoid türevi bağırsak epitel monokatmanlarının hazırlanmasını açıklıyoruz. Organoidler dış uyaranlara karşı orijinal epitel dokusu yanıtını temsil ettiğinden, bu modeller hücre hatlarının genişletilebilirliğinin avantajlarını ve birincil dokunun alaka düzeyini ve karmaşıklığını birleştirir.

Organoid Kaynaklı Epitel Tek Katmanlı: Bağırsak Bariyer Fonksiyonu için Klinik Olarak İlgili Bir In Vitro Model

Düzensiz bağırsak epitel bariyer fonksiyonu ve immün yanıtlar, fizyolojik modellerin eksikliği nedeniyle kötü araştırılmaya devam eden enflamatuar bağırsak hastalığının ayırt edici özellikleridir. Burada, mukozal geçirgenliği ve lökosit işe alımını vivo olarak incelemek için iyi vaskülerleştirilmiş ve dışlanmış bir bağırsak segmenti kullanan bir fare bağırsak döngüsü modelini tarif ediyoruz.

Standartlaştırılmış Bağırsak Döngüsü Modeli Kullanılarak Farelerde Bağırsak Geçirgenliği ve Nötrofil Transepithelial Göçün Fonksiyonel Değerlendirmesi

Bu protokol, fetal bağırsak dokusundan üç boyutlu bir bağırsak modeli olan enteroidlerin kurulmasını detaylandırır. Model karakterizasyonunda epitel biyobelirteçlerinin immünofloresan görüntülemesi kullanıldı. Bakteriyel bir endotoksin olan lipopolisakkaritlerin apikal maruziyeti, mikroenjeksiyon tekniği kullanılarak, floresan dekstranın sızıntısı ile ölçülen doza bağımlı bir şekilde epitel geçirgenliğine neden olmuştur.

Fetal Doku Kaynaklı Enteroidlerde Epitel Geçirgenliğinin Test Edilmesi

Mevcut protokol, bağırsak geçirgenliğini belirlemek için apikal-dışarı enteroid modelinde lusifer sarısı kullanan bir yöntemi özetlemektedir. Bu yöntem, nekrotizan enterokolit gibi inflamatuar bağırsak hastalıklarını modelleyen enteroidlerde parasellüler geçirgenliği belirlemek için kullanılabilir.

Apikal-Out Enteroid Modelde Lucifer Sarı Kullanarak Bağırsak Geçirgenliğinin Belirlenmesi

Bütün hayvanlar MG53-aracılı hücre zarı tamir ve hücresel seviyede dinamik bir süreç görselleştirmek için kullanılan protokoller burada nitelendirdi. Bu yöntemler, plazma zarı mühürlenirken ve rejeneratif tıp ve hücre biyolojisi araştırmak için uygulanabilir.

MG53-aracılı Hücre Zarı Tamiri Görselleştirme In vivo Ve In vitro Sistemleri

Keşfedin bağırsak epitel hücre geçirgenliğini in vitro ve in vivo yöntemlerle. Bu teknik, inflamatuar bağırsak hastalıkları ve gastrointestinal hastalıkların tedavisi için değerli bilgiler sunar.

Vitro ve In Vivo yaklaşımlar Bağırsak epitel hücre geçirgenliği belirlemek için

Daha fazla video keşfet