Nükleer silahların yayılmasına karşı ve fare Miyeloid habercisi 32D/G-CSF-R farklılaşma hücre

Bu deneyin genel amacı, ilgilenilen geni aşırı ifade ederek veya susturarak murin myeloid 32D-G-CSF-R hücrelerini genetik olarak modifiye etmek ve bu değişikliklerin hücre hattının proliferasyonu ve nötrofilik farklılaşması üzerindeki etkisini belirlemektir. Bu yöntem, ilgilendiğiniz proteinin myeloid öncül hücrelerin büyüme ve farklılaşmasına nasıl dahil olabileceği gibi hematoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu hücre hattının temel avantajı, sınırsız proliferasyon kapasitesine sahip olması, genetik manipülasyonlara karşı hassas olması, maliyetinin nispeten düşük olması ve belirli deneysel yaklaşımlarda gereken bir derece biyolojik basitleştirmeye izin vermesidir. Prosedürü bugün laboratuvarımdaki doktora öğrencisi Petr Danek gösterecektir.

Isıl işlemle inaktive edilmiş %10 fetal bovin serum ve mililitre başına 10 nanogram murin interlökin-3 ile desteklenmiş 250 mililitre RPMI-1640 Medium hazırlayın. Ardından 50 mililitre diferansiyasyon medyumu hazırlayın.

16 santimetrelik bir Petri kabında, Bosc23 hücrelerinin tek hücre süspansiyonunu %10 fetal bovine serum ile desteklenmiş 18 mililitre DMEM besiyerine ekleyin. Konfluens %80'e ulaşana kadar yaklaşık 24 saat boyunca kültüre edin. Ardından MSCV retroviral konstrüktü, PCL-echo paketleme vektörünü, poli-etilenimin ve antibiyotiksiz düşük serumlu besiyerini birleştirin. Bu karışımı bir Flowbox içerisinde oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. Daha sonra Bosc23 hücre kültürü besiyerini, 37 derece Celsius'ta tutulan %2 fetal bovine serum ile desteklenmiş 16 mililitre önceden ısıtılmış DMEM besiyeri ile dikkatlice değiştirin. Sonrasında, retroviral karışımı Bosc23 hücrelerinin üzerine damla damla ekleyin. Ardından kültürü 37 derece Celsius'ta dört saat boyunca inkübe edin.

İnkübasyon sona erdiğinde, Bosc23 kültür ortamını aspire edin ve 18 mililitre %10 fetal bovine serum içeren önceden ısıtılmış DMEM ortamı ekleyin. Hücreleri 37 derece santigrat sıcaklıkta 48 saat boyunca inkübe edin. Bosc23 virüsü içeren ortamı 50 mililitrelik konik bir tüpe çekmek için 25 mililitrelik serolojik pipet kullanın. Tüpü dört derece santigrat sıcaklıkta saklayın. Ardından Bosc23 hücrelerine 18 mililitre %10 fetal bovine serum içeren önceden ısıtılmış DMEM ortamı ekleyin ve hücreleri 24 saat boyunca kültüre edin.

Viral süpernatantı, 4 °C'de 10 dakika boyunca 1.500 ×g'de santrifüj edin. Ardından virüsü alikotlayın ve -80 °C'de saklamak için sıvı azot ile şok dondurun.

Altı kuyucuklu bir plakadaki her bir kuyucuğa, bir virüsü titre etmek için %10 fetal bovine serum ile desteklenmiş üç mililitre DMEM medyumunda NIH/3T3 hücreleri ekleyin. Hücreleri 37 °C'de gece boyunca kültüre edin. Ertesi gün, viral partikülleri vortekslemeden virüsü önceden ısıtılmış medyum ile seyreltin. NIH/3T3 hücrelerindeki kültür medyumunu aspire edin ve her kuyucuğa bir mililitre seyreltilmiş virüs ekleyin. 37 °C'de gece boyunca inkübe edin. Bir sonraki gün, seyreltilmiş viral medyumu dikkatlice aspire edin ve yerine %10 fetal bovine serum içeren iki mililitre DMEM medyumu ekleyip tekrar 37 °C'de gece boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından, eski medyumları aspire edin ve yerine mililitre başına iki mikrogram puromisin içeren DMEM medyumu ekleyin. Hücreleri her üç günde bir veya medyum sarıya dönene kadar kültüre etmeye devam edin ve puromisin içeren taze medyum ile yenileyin.

Enfeksiyon sonrası 10. ve 12. günler arasında, kuyucuklardaki medyumu aspire edin ve fosfat tamponlu salin ile nazikçe yıkayın. Ardından, oda sıcaklığında iki dakika boyunca bir mililitre kristal viyole çözeltisi ile boyayın. Boyama işleminden sonra, fosfat tamponlu salin ile dikkatlice iki kez yıkayın. Mikroskop altında her bir kuyucukta bulunan toplam mavi koloni sayısını sayın.

32D-G-CSF-R hücrelerini altı kuyucuklu bir plakaya ekleyin. 10 ile 40 arasında bir enfeksiyon multiplicitiesi (MOI) ile virüs ekleyin. Ardından hücrelere final konsantrasyonu 8 µg/mL olacak şekilde polybrene ekleyin ve 37 °C'de altı saat inkübe edin. İnkübasyonun ardından hücreleri 15 mL'lik bir tüpte toplayın ve 4 °C'de, 450 ×g'de beş dakika santrifüjleyin. 32D hücreleri, mL başına bir milyon hücreden daha yüksek konsantrasyonlarda büyütüldüğünde farklılaşma yeteneklerini kısmen kaybedebilirler; bu nedenle, bu hücrelerin zamanında pasajlanması ve kültürlerin aşırı büyümesine izin verilmemesi oldukça önemlidir.

Süpernatantı atın ve hücreleri; ısı ile inaktive edilmiş %10 fetal bovine serum ve 10 nanograms per milliliter murine interleukin-3 ile takviye edilmiş altı mililitre RPMI-1640 Medium içeren bir T25 kültür flaskı içinde yeniden süspanse edin. Hücreleri 37 degrees Celsius'de 48 saat boyunca inkübe edin.

32D-G-CSF-R hücrelerini sitokin içermeyen RPMI-1640 Medium ile iki kez yıkayın. Ardından, sıfırıncı günde hücreleri 24 kuyucuklu bir plakada bir mililitre farklılaşma ortamına ekleyin ve 37 °C'de gece boyunca inkübe edin. Hücrelerin olgun granülositlere farklılaşması yedi ila dokuz gün sürecektir. Daha sonra, ölü hücreleri dışlamak için trypan blue kullanarak hücre sayısını belirleyin.

IL-3 farklılaşma sürecini inhibe edebileceği için, hücreleri GCSF içerisinde kültüre etmeden önce sitokinin tüm izlerinin giderilmesi kritik önem taşımaktadır.

Hücreleri, gerekli adaptörlerin bulunduğu bir santrifüj cihazında, 20 ×g kuvvetinde beş dakika boyunca cam slayt üzerine cytospin yöntemiyle çöktürün. Ardından hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca metanol ile sabitleyin ve kurumaya bırakın. Üretici protokolünü takip ederek May-Grünwald Giemsa boyama yöntemiyle hücreleri boyayın. Boyama işlemi tamamlandıktan sonra, boyayı alan hücreleri 40X büyütme altında görüntüleyin.

Hücresel morfolojiye dayanarak, boyanmış hücrelerdeki blast, ara farklılaşma gösteren hücre ve olgun granülosit sayılarını belirleyin.

Burada, 32D-G-CSF-R hücrelerinin interleukin-3 ve granülosit koloni uyarıcı faktör içeren besiyerlerindeki proliferasyonunu gösteren grafiksel bir gösterim sunulmuştur. x-ekseni tedavi günlerini, y-ekseni ise logaritmik ölçekteki hücre sayısını temsil etmektedir. Siyah grafik, hücrelerin interleukin-3 içeren besiyerinde kültüre edildiğindeki proliferasyonunu göstermektedir. Mavi grafik ise granülosit koloni uyarıcı faktör içeren besiyerinde kültüre edildiğinde hücre proliferasyonunun azaldığını göstermektedir.

Burada, granülosit koloni uyarıcı faktör içeren ortamdaki 32D-G-CSF-R hücrelerinin oranını ve diferansiyasyon morfolojisini gösteren temsili pasta grafikleri ve May-Grunwald Giemsa boyamaları sunulmaktadır. Pasta grafikleri, granülosit koloni uyarıcı faktör tedavisi sonrası sıfır, iki, dört ve altıncı günlerdeki blastların, orta derecede diferansiye olmuş hücrelerin ve nötrofillerin oranını göstermektedir. Sıfırıncı gündeki Giemsa boyalı hücreler, karakteristik büyük çekirdeklere ve koyu sitoplazmaya sahiptir. Altıncı günde, çekirdek boyutu küçülmüş ve sitoplazma genişlemiştir ancak koyu renkli değildir.

Burada, granülosit koloni uyarıcı faktör içeren medyalarda, BCR-ABL füzyon proteinleri ile transdukt edilmeye kıyasla kontrol MSCV vektörü ile transdukt edilenlerde blast hücre oranının daha yüksek olduğunu gösteren temsili pasta grafikleri sunulmuştur. Alt paneldeki Giemsa boyaması, kontrol veya BCR-ABL füzyon proteinleri ile transdukt edilen hücreleri temsil etmektedir.

MSCV kontrol vektörü ile transduksiyon yapıldığında hücreler altıncı günde nötrofilik diferansiyasyona uğramış, ancak BCR-ABL transduksiyonu yapılan hücreler çoğunlukla blast hücreleri göstermiş ve olgun nötrofiller görülmemiştir.

Bu teknik bir kez kavrandığında, uygun şekilde uygulandığı takdirde iki gün içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü gerçekleştirirken, 32D-G-CSF reseptör hücrelerinin belirtilen konsantrasyonlarda kültüre edilmesi gerektiğini hatırlamak önemlidir. Bu prosedürün ardından, ek soruları yanıtlamak amacıyla migrasyon analizleri ve sağkalım deneyleri gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra; lentiviral ve retroviral transduksiyon yoluyla genetik manipülasyon, genişletme, diferansiyasyon ile bu hücrelerin proliferasyon ve diferansiyasyonunun değerlendirilmesini kapsayacak şekilde, 32D-G-CSF reseptör hücre hattının nasıl yönetileceği konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız. Virüslerle çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü uygularken eldiven giymek ve koruyucu gözlük kullanmak gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.