Name: Nükleer silahların yayılmasına karşı ve fare Miyeloid habercisi 32D/G-CSF-R farklılaşma hücre (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: Keşfedin fare miyeloid öncü 32D/G-CSF-R hücre hattında genetik modifikasyon ve farklılaşma analizleri. Bu yöntem, hematoloji alanında miyeloid hücre gelişimini ve gen fonksiyonlarını incelemek için güçlü bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar Prof. Ruud Delwel ve Prof. Ivo bize 32D/G-CSF-R hücre satırıyla sağlamak için Touw ve Prof. Dr. Daniel G. Tenen bize Bosc23 hücre satırıyla sağlamak için teşekkür ederiz. Bu eser hibe MA-J için Çek Cumhuriyeti (GACR 15-03796S ve GACR 17-02177S) Grant ajansı tarafından desteklenen, MA-J, GA İngiltere Bursu (Proje No. 341015) Enstitüsü, moleküler genetik üzerinden çek Bilimler Akademisi (RVO 68378050) desteği MK ve GA İngiltere Bursu (Proje No. 1278217) Prag Charles Üniversitesi PD Prag'a'nden Charles Üniversitesi'nden.

Not: genişleme açıklayan adımları, farklılaşma ve iletim 32D/G-CSF-R hücre aşağıda sunulmuştur.
1. hazırlık
<ol><li>Medyası hazırlama
	<ol>
<li>250 mL kültür ortamı hazırlamak: RPMI (Roswell Park Memorial Enstitüsü) 1640 orta % 10 ısı ile desteklenmiş inaktive FBS (fetal sığır serum) ve fare IL-3 (10 ng/mL).<ol>
<li>Alternatif olarak, ev yapımı IL-3'ü kullanın. Ev yapımı IL-3 üretmek için HEK293 hücreleri ile IL-3 ifade vektör transduce ve IL-3 süpernatant22içeren toplamak. Not: Antibiyotik, penisilin G gibi (100 IU/mL), streptomisin (100 µg/mL) ve gentamisin (40 µg/mL), aksi belirtilmedikçe Protokolü'nün herhangi bir aşamada hücre kültürü için kullanılabilir.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Farklılaşma orta 50 mL hazırlamak: RPMI 1640 orta takıma % 10 ile FBS ve insan G-CSF (100 ng/mL). Not: (Önemli) tüm serum toplu işlemleri desteklemek 32D/G-CSF-R hücrelere farklılaşma. Deney başlamadan önce serum farklı toplu işlemleri test. Bu en az 4 farklı toplu işlemleri test etmek ve en iyi ayırt 32D/G-CSF-R hücre becerisi ilgili seçin tavsiye edilir. Bkz: 32D/G-CSF-R farklılaşma protokolü aşağıdaki.</li>
		<li>Dondurucu orta 10 mL hazırlamak: RPMI 1640 orta FBS ve % 10 DMSO (Dimetil sülfoksit) % 40 ile desteklenmiştir.</li>
	</ol></li>
	<li>Retrovirüs imalatı
	<ol>
<li>Bir tek hücre süspansiyon (6 × 106) Bosc23 hücrelerinin 16 cm Petri kabına plaka ve 18 içeren FBS kültür confluency kadar (24 saat) % 80 ulaşır % 10 mL DMEM (Dulbecco'nın modifiye kartal orta) yetiştirmek. Not: Hücre kültüründe monolayer ve değil form kümeleri içinde yetişen gerekir. Hücre sayımı, farklı yöntemler (kalanı burada sunulan iletişim kuralları için geçerli) kullanılarak gerçekleştirilebilir. Örnekleri düşük dizi durumunda, el ile Bürker odası kullanma mikroskop altında sayma tavsiye edilir. Bu durumda, Trypan mavi ölü hücreleri hariç tutma için kullanın. Mix hücreleri 1:1 ile % 0,4 PBS Trypan mavi. Örnekler çok sayıda sayım gerçekleştirmek için bir otomatik hücre sayaç istihdam edilebilir.</li>
		<li>Birleştirmek retroviral yapı (örneğin MSCV) 40 µg, pCL-eko (ambalaj vektör)2320 µg, 80 µl PEI (polyethylenimine) ve (olmadan antibiyotik) indirimli Serum orta (örneğin Opti-MEM) orta 2 mL. Bu karışımı oda sıcaklığında (RT) 20 dk için kuluçkaya.</li>
		<li>Dikkatle 16 mL %2 ile desteklenmiş DMEM Bosc23 hücreleri orta yerine FBS. Orta kullanmadan önce 37 ° C olarak önceden ısıtmak. Not: transfection etkinliğini azaltmak beri antibiyotik transfection sırasında kullanmayın.</li>
		<li>1.2.2 içinde hazırlanan karışımı ekleyin. dropwise ve dikkatli bir şekilde Bosc23 için kültür ve 37 ° C'de 4 h için kuluçkaya Kuluçka az 6 h PEI toksisite nedeniyle sınırlama.</li>
		<li>Kuluçka sonra Bosc23 orta 18 mL değiştirin önceden ısınmış % 10 içeren DMEM FBS ve 37 ° C'de 48 h için hücre yetiştirmek Yemekler bir biyogüvenlik seviye 2 laboratuarda yerleştirin, burada bu adımı tutmak ve standart güvenlik prosedürleri izleyin.</li>
		<li>50 mL konik tüp 25 mL serolojik pipet kullanarak Bosc23 orta (içeren ecotropic retroviral parçacıklar) toplamak ve 4 ° C'de depolayın Not: (Önemli) Transfection verimliliği yüksek titresi virüs üretmek için % 90 ulaştırılması gerekmektedir.</li>
		<li>18 mL % 10 ön DMEM ısındı eklemek FBS Bosc23 için hücreleri ve 24 saat için yetiştirmek.</li>
		<li>1.2.6 arasındaki adımları yineleyin. Not: bir kez onlar uzanmak viral bütünlüğünün korunması için aynı sıcaklığı (4 ° C) 1.2.6 ve 1.2.8 Retroviral supernatants havuza.</li>
		<li>Viral supernatants Bosc23 kirlenmesini önlemek için toplanan virüs 1500 × g 4 ° C'de 10 dakika için de spin Aliquot virüs, Kuru buz veya sıvı nitrojen kullanarak donma dişlemek ve-80 ° C'de depolayın Ancak, donmuş stokları daha enfeksiyon verimlilik açısından yüksek kalitede taze hazırlanmış bu virüs olduğunu unutmayın. Not: (Önemli) donma/virüs, viral düşmesine yol açar bu yana çözdürme yinelenen kaçının.</li>
	</ol></li>
	<li>Lentivirus imalatı
	<ol>
<li>Bir tek hücre süspansiyon HEK293T (insan embriyonik böbrek 293T) hücre (6 × 106) 16 cm Petri kabına plaka ve 18 mL % 10 FBS kültür confluency kadar (24 saat) % 80 ulaşır içeren DMEM yetiştirmek. Not: Hücre kültüründe monolayer ve değil form kümeleri içinde yetişen gerekir.</li>
		<li>Lentiviral yapısı (gag/pol için 12 µg kodlama) plazmid pCMVdR8.74 ambalaj (örneğin pGhU6), 15 µg birleştirmek ve pMD2.VSVG (VSV-G 1.4 µg kodlama), 85.2 µL PEI ve (olmadan antibiyotik) indirimli serum orta 2 mL. Bu karışım RT., 20 dk için kuluçkaya</li>
		<li>Dikkatle 16 mL %2 ile desteklenmiş DMEM HEK293T orta yerine FBS. Orta kullanmadan önce 37 ° C olarak önceden ısıtmak. Transfection etkinliğini azaltmak beri antibiyotik transfection sırasında kullanmayın.</li>
		<li>Dikkatle 1.3.2 HEK293T hücre kültürü için hazırlanan karışım damla ve 37 ° C'de 4 h için kuluçkaya Kuluçka süresi için PEI toksisite önlemek için 6 h içinde sınırlayın.</li>
		<li>Değişim orta 18 ml % 10 DMEM ısındı önceden FBS ve 37 ° C'de 48 h için hücre yetiştirmek Yemekler bir biyogüvenlik seviye 2 laboratuarda yerleştirin, burada bu adımı tutmak ve standart güvenlik prosedürleri izleyin.</li>
		<li>50 mL konik tüp 25 mL serolojik pipet kullanarak HEK293T orta (içeren amphotropic lentiviral parçacıklar) toplamak ve 4 ° C'de saklayın Not: (Önemli) Transfection verimliliği yüksek titresi virüs üretmek için % 90 ulaştırılması gerekmektedir.</li>
		<li>Dikkatli bir şekilde Önceden ısıtılmış DMEM 18 mL % 10 ekleyin HEK293T hücrelere FBS. 37 ° C'de 24 h için yetiştirmek</li>
		<li>1.3.6 arasındaki adımları yineleyin. Not: bir kez onlar uzanmak viral bütünlüğünün korunması için aynı sıcaklığı (4 ° C) Lentiviral supernatants 1.3.6 ve 1.3.8 havuza.</li>
		<li>Viral süpernatant HEK293T hücreleri ile kontaminasyonu önlemek için toplanan virüs 1500 × g 4 ° C'de 10 dakika için de spin Aliquot virüs, Kuru buz veya sıvı nitrojen kullanarak donma dişlemek ve-80 ° C'de depolayın Ancak, bu virüs taze hazırlanmış donmuş stokları daha yüksek kalitede enfeksiyon verimlilik açısından dikkat edin. Not: (Önemli) donma/virüs, viral düşmesine yol açar bu yana çözdürme yinelenen kaçının.</li>
	</ol></li>
	<li>Titrasyon GFP muhabir içeren virüs
	<ol>
<li>1 × 105 NIH/3T3 hücrelerde DMEM 300 µL % 10 tohum FBS 24-şey plaka kuyuya başına. 7 kuyu titresi bir virüs için istihdam edilecektir.</li>
		<li>Virüs 37 ° C'de erimek ve 1, 5, 10, 50, 100 ve 500 µL virüs NIH/3T3 kültürler için ekleyin. Herhangi bir virüs negatif denetime de eklemeyin. Hücreleri 37 ° C'de 48 h için virüs huzurunda yetiştirmek</li>
		<li>Tripsin/EDTA (ethylenediaminetetraacetic asit) 30 µL kullanarak NIH/3T3 hücre hasat (% 0.25 Tripsin, PBS % 0,01 EDTA) ve hücreleri 250 µL PBS (floresan aktif hücre sıralama) FACS tüp içinde gerçekleşti.</li>
		<li>Her örnek24Akış Sitometresi tarafından GFP+ hücreleri sıklığını belirler. Ölü hücreleri tarafından Höchst 33258 gibi bir canlılık boya ilavesi hariç.</li>
		<li>GFP+ hücre (kaplama hücre sayısı ve yüzdesi GFP+ hücrelerinin göre) toplam sayıları hesaplamak ve onlara karşı virüs enfeksiyonu için kullanılan birim arsa. Not: büyük viral dozlarda uygulandığında bir plato (önemli) verimlilik enfeksiyon ulaşır. Bu nedenle, viral konsantrasyonları hangi enfeksiyon verimliliği doğrusal aralığı ( Tablo 1' de gösterilen örnek) ortaya çıkan temel titresi tahmin etmek önemlidir. GFP+ hücreleri belirli virüs hacmindeki fonksiyonel viral parçacıkların (TU - birimleri dönüştürme) sayısını gösterir. ML başına TU sayısı yeniden hesaplayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Titrasyon puromisindir muhabir içeren virüs
	<ol>
<li>5 × 104 NIH/3T3 hücrelerde DMEM 3 mL % 10 tohum FBS başına iyi bir 6-şey plaka; 6 kuyu titresi bir virüs için istihdam. 37 ° C'de gecede kültür</li>
		<li>Ertesi gün Tablo 2' de gösterildiği gibi virüs oranında seyreltin. Virüs sulandırmak için Önceden ısıtılmış DMEM % 10 kullanın FBS. Değil girdap yapmak.</li>
		<li>Kültür orta NIH/3T3 hücrelerinden kaldırmak ve 1 mL sulandırılmış virüs ekleyin.</li>
		<li>Gecede 37 ° C'de kuluçkaya</li>
		<li>Yavaşça virüs içeren orta yerine Önceden ısıtılmış DMEM 2 mL ile %10 FBS ve gecede 37 ° C'de kuluçkaya</li>
		<li>Yavaşça NIH/3T3 orta Önceden ısıtılmış DMEM % 10 FBS içeren puromisindir (2 µg/mL) 2 mL ile değiştirin.</li>
		<li>Kültür 37 ° C ve puromisindir 3 günde ile dikkatli bir şekilde yenileme orta veya orta sarı döndüğünde.</li>
		<li>10-12 gün sonra enfeksiyon, orta her kuyudan Aspire edin ve yavaşça PBS ile yıkayın.</li>
		<li>1 mL kristal violet çözeltisi (% 0.5 kristal violet % 20 etanol ve dH2O) ile 2 dk RT, leke ve dikkatli bir şekilde iki kez PBS ile yıkayın.</li>
		<li>Sayısı mavi koloniler mikroskop (büyütme X4) altında her şey mevcut. Hiçbir kolonileri negatif denetiminde de dikkat edilmelidir.</li>
		<li>TU/mL seyreltme faktörü göz önünde bulundurarak toplam sayısını hesaplayın.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Genleşme ve bakım 32D/G-CSF-R hücre
<ol><li>32D/G-CSF-R hücreleri donduruldu, bir aliquot alabilir ve 37 ° C su banyosu 1 dk. için hücrelerde çözülme ve doğrudan içine Önceden ısıtılmış RPMI 1640 orta % 10 ile desteklenmiş 10 mL flakon hücrelerden dökün FBS 15mL tüp içinde. Tüp 3 kez ve spin hücreleri aşağı 400 × g. ters çevir süpernatant kaldırmak ve IL-3 içeren kültür Orta 0.3 × 106 hücre/mL bir konsantrasyon, hücrelerde resuspend.</li>
	<li>Optimum hücre büyüme bölgedir 0,25-0,5 × 106 hücre/mL. Her 2 günde bir konsantrasyon 0.1-0.2 × 10 duruma getirmeden hücreleri bölme6 hücre/mL. Not: (Önemli) 32D/G-CSF-R hücreleri kısmen 1 × 106 hücre/mL yüksek konsantrasyonları yetiştirilen Eğer ayırt yeteneğini kaybedebilirsiniz. Bu nedenle, zamanında 32D/G-CSF-R hücreleri bölmek çok önemlidir.</li>
	<li>Gerektiğinde, donma ve cep aliquots uzun bir süre için-80 ° C'de veya sıvı azot depolamak. 3 × 106 hücre aşağı spin, süpernatant kaldırmak ve 1 mL dondurucu orta resuspend. Tüp-80 ° C'de dondurucu bir kapsayıcı yerleştirin Uzun süreli depolama için sıvı azot hücrelere yeniden konumlandırın.</li>
</ol>3. iletim 32D/G-CSF-R hücre
<ol><li>Plaka 32D/G-CSF-R bir konsantrasyon 0.3 × 106 hücre/mL 6-şey plaka hücrelere.</li>
	<li>Virüs 10 ile 40 arasında MOI (enfeksiyon çokluğu) ulaşmak için uygun miktarda ekleyin. Not: Daha yüksek MOI GFP+ hücreleri artan yüzdesi gibi yüksek düzeyde ilgi gen ifade neden olur. Örnek: 10 MOI ile hücreleri 0.3 × 106 bulaştırmak için; 3 × 106 TU 32D/G-CSF-R hücrelere eklenmesi gerekir.</li>
	<li>Polybrene son konsantrasyon 8 µg/mL için eklemek ve 37 ° C'de 6 h için kuluçkaya Alternatif olarak, bir spin-aşı yordamı gerçekleştirmek: santrifüj kapasitesi 1200 × g bir salıncak-kova rotor kullanarak bir kodlamayla plaka 30 ° C'de 90 dk için de ve 37 ° C'de 3 h için kuluçkaya</li>
	<li>Toplamak hücreleri, bir 15 mL tüp aktarmak ve 450 × g 5 min (4 ° C) için de spin.</li>
	<li>Süpernatant atmak, kültür ortamının 6 mL pelleted hücrelerde resuspend, T25 hücre kültür şişesi ve 37 ° C'de kültür yeri</li>
	<li>48 saat sonra hücre hasat ve onlarla 450 × g 5 min (4 ° C) için de spin. Süpernatant atmak.</li>
	<li>GFP muhabir durumunda: PBS ve sıralama GFP+ hücreleri bir Akış Sitometresi sıralayıcısı kullanarak 500 µL içinde hücreleri yerleştirmek. Vektör içeren bir puromisindir muhabir durumunda: hücre kültürü 2 µg/mL puromisindir içeren ortamda yer.</li>
	<li>Hücreleri daha fazla analiz ve deneyler için gerektiği gibi genişletin. Not: (İsteğe bağlı) Transduced hücreleri medya-80 ° C'de dondurucu bir kapta buz gibi donmuş ve daha fazla sıvı azot içinde depolanır.</li>
</ol>4. 32D/G-CSF-R Hücre proliferasyonu tahlil
<ol><li>Nükleer silahların yayılmasına karşı oranı yer 0.2 × 106 hücre kültür orta 1 ml değerlendirmek ve gecede 37 ° C'de kuluçkaya</li>
	<li>Ertesi gün hücreleri saydırmak ve onları bir konsantrasyon 0.2 × 106 hücre/mL kültür ortamı kullanarak için sulandırmak. Gecede 37 ° C'de kuluçkaya Hücre konsantrasyonları ve Tablo 3kullanarak günlük kültürler uygulanan dilutions kayıtlarını tutmak.</li>
	<li>4.2 olarak nükleer silahların yayılmasına karşı değerlendirilmesi gerekiyor günlerdir arasındaki adımları yineleyin. Not: Uzunluğu proliferasyon deneyleri, gene ilgi etkisi bağlıdır. Güçlü bir fenotip durumunda, 8-9 gün önemli bir etkisi (bkz: şekil 3A) gözlemlemek yeterli olabilir. Ancak, hafif bir fenotip durumunda, daha uzun süreler gerekli olabilir.</li>
	<li>Hücre büyümesini Tablo 3' te gösterildiği gibi bir nükleer silahların yayılmasına karşı eğri yaparak değerlendirmek.</li>
</ol>5. 32D/G-CSF-R hücre farklılaşması tahlil
<ol><li>0.2 × 106 32D/G-CSF-R hücreler sitokinler olmadan RPMI orta ile iki kez yıkayın. Not: artık IL-3 varlığı farklılaşma inhibe beri çamaşır G-CSF ilavesi kültür içine önce önemli adımlardır.</li>
	<li>Hücreleri (100 ng/mL G-CSF içeren) 1 mL farklılaşma orta 24 iyi/plaka, 0.2 × 106 hücre/mL (0 gün) bir hücre konsantrasyon kaynaklanan yerleştirin. 37 ° C'de gecede kültür</li>
	<li>Hücre/mL (yukarıdaki adım 1.2.1) belirtildiği gibi sayma.</li>
	<li>Bir santrifüj 20 × g de gerekli adaptörler ile Cytospin 2-5 × 104 hücreleri kullanarak bir cam slayt (76 mm X 26 mm) üzerinde.</li>
	<li>Bir 24 iyi/plaka (gün 1) 0.2 × 105 hücre/mL konsantre farklılaşma orta ve plaka hücreleri yenilemek. Eski plaka atmak ve basamak 5.6 ve yeni plaka ertesi gün devam edin.</li>
	<li>2-7 günlerde tamamlayana 5,5 5,3. Hücre çoğalması G-CSF huzurunda adım 4'te açıklandığı gibi değerlendirmek. Not: (Önemli) hücre çoğalması sırasında farklılaşma, yavaşlar, bu nedenle G-CSF huzurunda 3-4 gün sonra bu daha yüksek konsantrasyonlarda kültür hücrelere yeterli.</li>
	<li>32D/G-CSF-R hücreleri hücre morfolojisi alarak farklılaşma durumu değerlendirmek.<ol>
<li>Metanol RT, 5 min için 5,4 adımda hücrelerden düzeltmek ve slaytlar kurumasını bırakın. Not: 0-7 gün slaytlardan RT depolanan ve aynı anda sabit. Benzer şekilde, onlar da RT fiksasyon sonra uzun süre tutulabilir.</li>
		<li>Mayıs-Grünwald Giemsa aşağıdaki üreticinin iletişim kuralı boyama kullanarak hücreleri leke.</li>
		<li>Lekeli hücrelerin mikroskop ve büyütme X40 kullanarak görselleştirmek.</li>
		<li>Patlamaların, ayda farklılaşmış hücreler ve olgun granülosit şekil 1 ve Tablo 4açıklama açıklayıcı resimleri kullanarak ölçmek.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Deneysel bir model seçimi tek araştırma ana sorunlardan biridir. Birincil hayvan ve insan hücreleri en biyolojik ilgili verileri üretmek inanılan bu modeller etik kaygılar içerebilir ve çoğu kez yalıtım/pahalı ve/veya sofistike kültür yordamları ile ilgili. Primer hücre sayıları sınırlıdır ve genetik olarak onları manipüle etmek zordur. Buna ek olarak, Primer hücre veri yorumu29karmaşık hale çeşitli hücre tiplerinin oluşan heterojen bir nüfus temsil eder. Buna ek olarak, hücre hatları biyolojik ma...

Hematopoetik kök ve yaratıcı nüfus organizma Olgun Hücreler, myeloid silsilesi (nötrofiller, eozinofiller, bazofil ve monosit) hücrelerden de dahil olmak üzere geniş bir dizi sağlar. Hematopoetik kök hücre myeloid hücre üretim sürücüler işlem myelopoiesis bilinir ve değişen taleplerine karşılık olgun myeloid hücrelerin yeterli üretim ile stres organizmanın uygun başa çıkma için bir önkoşuldur koşullar, enfeksiyonlar ve kan kaybı gibi. Olgun myeloid hücrelerin yetersiz üretim yetersizlik patojenler, düşük kan pıhtılaşması ve diğer hayati koşulları1,2ortadan kaldırmak için neden olabilir. Buna ek olarak, değişiklikler Miyeloid lineage gelişiminde de Akut Miyeloid Lösemi (AML)3gibi hematolojik maligniteler ile iliskili olabilir. Değişiklikler myelopoiesis içinde kusurları hücre yüzey reseptörlerinin4, transkripsiyon faktörleri5, değiştirilen ifadeler sinyal yolları6, mutasyonlar oluşumu sonucu Engelli gibi çeşitli nedenlerden dolayı oluşabilir / oncogenes7, ya da Tümör baskılayıcı genler8inactivation aktivasyonu.
Myeloid geliştirme çalışma ve bu süreçte belirli genetik değişiklikler etkisini değerlendirmek için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. Myelopoiesis eğitim için kullanılan yaygın bir yaklaşım Primer hücre ve transgenik fareler içerir. Bu modelleri biyolojik ilgili verileri edinimi izin rağmen bazı kısıtlamalar bulunmaktadır. Primer hücre kullanımı sınırlı sayıda hücre ve gen ekspresyonu ve daha sonraki biyolojik ya da biyokimyasal analiz değiştirmek için olasılıklar daralma kültür, sınırlı bir süre karşılaşır. Transgenik fareler yüksek maliyetlidir ve biyolojik gerekçe makul bir ölçüde gerektirir. Buna ek olarak, vivo içinde modelleri ile çalışma bir ölçüde ilgi belirli bir süreç içinde bir gen rolünün anlaşılması halinde karmaşıklık ekler. Bu nedenle, bu sınırlamaları aşmak için alternatif yaklaşımlar ihtiyaç vardır. Hücre hatları tartışılmaz avantajı var: (1) onlar biyolojik ve biyokimyasal araştırmalar için yeterli malzeme üreten sağlar sınırsız nükleer silahların yayılmasına karşı kapasitesine sahip, (2) genetik manipülasyon (nakavt, nakavt, duyarlı oldukları overexpression), (3) maliyeti nispeten düşüktür, ve (4) biyolojik basitleştirme bazı deneysel yaklaşımlar gerekli bir ölçüde olanak tanır.
Ebeveyn IL-3 (İnterlökin-3) bağımlı 32D hücre kültürünü kurulmuştur 1983'te Greenberger ve meslektaşları tarafından enfeksiyon C3H/HeJ fareler arkadaş fare lösemi virüs9ile kemik iliği hücre tarafından. Birkaç 32D klonlar literatürde tarif edildi: cl-239, cl-310ve cl-1011. 32D cl-3 hücreleri IL-3'te çoğalırlar ve granülosit-koloni stimülasyon faktör (G-CSF)10ile tedavi üzerine Nötrofilik farklılaşma tabi gösterilmiştir. Aksine, olurken IL-3 bağımlı, 32D cl-10 hücreleri aslında yanıt G-CSF tedavisi olarak ayırt değil. 1995 yılında Dr Ivo Touw grup retrovirally bu reseptör11işlevsel olarak önemli bölgeleri tanımlamak için 32D cl-10 hücreleri vahşi türü ve G-CSF reseptör (G-CSF-R), mutasyona uğramış formlar transduced. Bu çalışmada IL-3 üzerinde benzer şekilde bağlıdır, 32D/G-CSF-R hücreler nesilde sonuçlandı ama IL-3 G-CSF ile replasmanı sonrası 6-10 gün içinde hücreleri çoğalırlar ve geri dönüşümsüz olgun nötrofiller ayırt durdurmak. Bu özellikleri 32D cl-3 ve iki iyi tanımlanmış büyüme ve farklılaşma faktörlerden - IL-3 ve G-CSF modülasyonlu fare Nötrofilik farklılaşma 32D/G-CSF-R hücreleri Basitleştirilmiş modelleri yapmak. Son yıllarda birden fazla grup nükleer silahların yayılmasına karşı belirli genlerin rol ve farklılaşma myeloid hücre kültürü12,13,14,15 dakika içinde çalışmaya 32D/G-CSF-R hücreleri kullandık , 16ve G-CSF sinyal17,18çalışmaya. Önemlisi, bu hücre satırı kullanarak elde edilen sonuçları Primer hücre ve transgenik fareler16,19,20,21ile elde edilen verilerle ilişkili. Sonuç olarak, 32D/G-CSF-R hücreleri, yaygın olarak kullanılan ve iyi kurulmuş bir model olmak bu soruyu ele diğer yaklaşımlar ile paralel olarak kullanılan Miyeloid farklılaşma eğitim için değerli bir sistemini temsil inanıyorum.
Burada, 32D/G-CSF-R hücre kullanımı açıklayan ayrıntılı iletişim kuralları, hangi kapak genişleme, farklılaşma ve nükleer silahların yayılmasına karşı değerlendirilmesi ve bu hücreler farklılaşma sunulur. Detaylı bilgi için 32D/G-CSF-R hücrelerinin genetik değişiklik retroviral veya lentiviral iletim gibi virüs titrasyon için iletişim kuralları tarafından sağlanır. Ayrıca, potansiyel uygulamalar 32D/G-CSF-R hücre göstermek birkaç temsilcisi sonuçları temin edilmektedir.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640 toz ortam</td><td>Merck, Kenilworth, NJ, ABD</td> NaHCO3 içermeyen <td>T 121-10</td><td>, L-glutamin</td></tr><tr><td>DMEM</td> ile <td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ABD</td><td>15028</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Azaltılmış Serum Ortamı</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ABD</td><td>31985-047</td><td>L-Glutamin, Fenol Kırmızı</td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu (FBS)</td> <td>PAA Laboratuvarları (GE Healthcare, Chicago, IL, ABD)</td><td>MT35011CV</td><td>32D / G-CSF-R hücrelerinin farklılaşması için</td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu (FBS)</td> <td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ABD</td><td>10270</td><td>HEK293T, NIH3T3, BOSC23 hücrelerini kültürlemek için kullanılır</td></tr><tr><td>Penisilin</td><td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, ABD)</td> <td>P3032</td><td></td></tr><tr><td>Streptomisin</td><td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, ABD)</td> <td>S9137</td><td>Streptomisin sülfat tuzu tozu</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, ABD)</td><td>G1914</td><td></td></tr><tr><td>murin IL-3</td><td>PeproTech, Rocky Hill, NJ, ABD</td><td>213-13</td><td></td></tr><tr><td>insan G-CSF</td><td>PeproTech, Rocky Hill, NJ, ABD</td><td>300-23</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenimin</td><td>Polibilimi, Warrington, PA, ABD</td><td>23966</td><td>Doğrusal, MW 25.000 (PEI 25000)</td></tr><tr><td>Polybren</td><td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, ABD)</td><td>H9268</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin</td><td>VWR Kimyasalları, Radnor, PA, ABD</td><td>0458</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, ABD)</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Kristal viyole</td><td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, ABD)</td><td>C0775</td><td></td></tr><tr><td>Tripan mavisi</td><td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, ABD)</td><td>T6146</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, ABD)</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Mayıs-Gr&uuml; nwald Giemsa</td><td>DiaPath, Martinengo, BG, İtalya</td><td>10802</td><td></td></tr></tbody></table>

nükleer silahların yayılmasına karşı ve fare miyeloid habercisi 32d/g-csf-r farklılaşma hücre

Proliferation and Differentiation of Murine Myeloid Precursor 32D/G-CSF-R Cells

Hematopoetik kök ve progenitör hücre biyolojisi anlayış rejeneratif tıp ve hematolojik patolojiler tedavisi için önemli sonuçları vardır. Vivo modelleri veya birincil kültürler kullanarak elde edilebilir en alakalı verileri rağmen hematopoetik kök ve progenitör hücre düşük bereket önemli ölçüde onların soruşturma için uygun teknikleri havuzu kısıtlar. Bu nedenle, hücre hatları gösterimleri veya büyük hücreli numaraları gerektirir deneyleri için biyolojik malzeme yeterli üretim sağlar. Burada ayrıntılı bir açıklama, okuma ve myelopoiesis ve Nötrofilik farklılaşma gerçekleştirilen işlemlere incelenmesi için kullanılan nükleer silahların yayılmasına karşı ve farklılaşma deneyleri yorumlanması mevcut. Bu deneyler IL-3 huzurunda çoğalırlar ve G-CSF içinde ayırt etmek yeteneği sahip 32D/G-CSF-R sitokin bağımlı fare myeloid hücre kültürünü istihdam. Biz protokolleri 32D/G-CSF-R hücreleri işleme için en iyi duruma getirilmiş sağlamak ve büyük tuzaklar ve açıklanan deneyleri ve beklenen sonuçları tehlikeye atabilir sakıncaları tartışıyorlar. Ayrıca, bu makale için lentiviral ve retroviral üretim, titrasyon ve 32D/G-CSF-R hücre iletim protokolleri içerir. Bu hücrelerin genetik manipülasyon başarılı bir şekilde birincil hematopoetik kök ve progenitör hücre veya vivo içinde modelleri ile elde edilen sonuçlar tamamlayabilir işlevsel ve moleküler çalışmalar gerçekleştirmek için istihdam edilecek göstermektedir.

Nükleer silahların yayılmasına karşı ve 32D/G-CSF-R hücrelere farklılaşma
Pro proliferatif ve yanlısı farklılaşma koşullar altında 32D/G-CSF-R hücrelerin çoğalması değerlendirmek için 32D/G-CSF-R hücreleri IL-3 G-CSF, sırasıyla içeren medyayı ve içinde kültürlü. IL-3 içeren ortamda (10 ng/mL) kültürlü hücreleri yaklaşık her 24 h (şekil 2A) bölmek gözlendi. Yavaş yavaş yavaş aşağı ve 4 gün sonra (<stron...

Burada fare Miyeloid habercisi 32D/G-CSF-R hücre kültürünü kültür, viral enfeksiyonlar gerçekleştirme ve yayılmasını önleme ve farklılaşma deneyleri için detaylı protokol sunulmuştur. Bu hücre kültürünü myeloid hücre gelişimini ve myeloid hücre büyümesi ve Nötrofilik farklılaşma ilgi genlerin rol çalışmak için uygundur.

Nükleer silahların yayılmasına karşı ve fare Miyeloid habercisi 32D/G-CSF-R farklılaşma hücre

Understanding of the hematopoietic stem and progenitor cell biology has important implications for regenerative medicine and the treatment of ...

Bu deneyin genel amacı, ilgilenilen geni aşırı ifade ederek veya susturarak murin myeloid 32D-G-CSF-R hücrelerini genetik olarak modifiye etmek ve bu değişikliklerin hücre hattının proliferasyonu ve nötrofilik farklılaşması üzerindeki etkisini belirlemektir. Bu yöntem, ilgilendiğiniz proteinin myeloid öncül hücrelerin büyüme ve farklılaşmasına nasıl dahil olabileceği gibi hematoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu hücre hattının temel avantajı, sınırsız proliferasyon kapasitesine sahip olması, genetik manipülasyonlara karşı hassas olması, maliyetinin nispeten düşük olması ve belirli deneysel yaklaşımlarda gereken bir derece biyolojik basitleştirmeye izin vermesidir. Prosedürü bugün laboratuvarımdaki doktora öğrencisi Petr Danek gösterecektir.Isıl işlemle inaktive edilmiş %10 fetal bovin serum ve mililitre başına 10 nanogram murin interlökin-3 ile desteklenmiş 250 mililitre RPMI-1640 Medium hazırlayın. Ardından 50 mililitre diferansiyasyon medyumu hazırlayın.16 santimetrelik bir Petri kabında, Bosc23 hücrelerinin tek hücre süspansiyonunu %10 fetal bovine serum ile desteklenmiş 18 mililitre DMEM besiyerine ekleyin. Konfluens %80'e ulaşana kadar yaklaşı

proliferation-differentiation-murine-myeloid-precursor-32dg-csf-r

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Bu video fare kemik iliği myeloid dendritik hücrelerin ayırt etmek için prosedür göstermektedir. İzolasyon fare tibia ve femur, ve kemik iliği işleme göstermiştir. Hücre fenotipi ve CpG IL-12 üretimi takiben olgunlaşma gösteren farklılaşma öncesi ve sonrası hücre morfolojisi gösteren resimler ve rakamlar gösterilmektedir.

Myeloid dendritik hücreler kemik iliği öncüleri Kültür

Bu protokol, fetal spinal kablolarından Glial Yasak Öncüleri derivasyon özetliyor ve transplantasyon için veya oligodendrocytic soyunun çalışma için ya in vitro korunmuştur.

E13 farelerin Glial Yasak Öncüleri türetilmesi

Bu videoda, multipotent kemik iliği stromal hücrelerinden (BMSC'ler) Schwann hücresi benzeri hücreler elde etmek için bir yöntem gösterilmektedir. Başlangıçta, BMSC'ler hipoksi tedavisine tabi tutulur, ardından nöronal progenitör hücrelere yönlendirilmiş farklılaşma gelir. Daha sonra, bu progenitör hücrelerin Schwann hücresi benzeri hücrelere dönüşümünü indüklemek için spesifik ortam ve kültür koşulları kullanılır.

Kemik İliği Stromal Hücrelerinden Schwann Hücresi Benzeri Hücrelerin Üretilmesi

Bu protokol, FACS-aracılı hücre izolasyon hidrodinamik gen transferi, ve Peyer yama bağışıklık alt-akışı analizi içeren teknikleri kullanarak, ortak bir dendritik hücre progenitörlerinden Peyer yama plazmasitoid dendritik hücrelerin farklılaşmasını değerlendirmek için deneysel prosedürler açıklanmaktadır.

Hematopoetik progenitörlerin Evlatlık Transferi kullanarak Peter Parçacıklannda Murin plazmasitoid dendritik hücreleri Gelişimini değerlendirilmesi

Bu çalışmada, Flt3 ligandı varlığında ortak lenfoid progenitörleri AC-6 besleyici hücrelerle birlikte kültürleyerek verimli bir şekilde pDC üretebilen bir in vitro kültür sistemi sunuyoruz.

AC-6 Besleyici Sistemi kullanılarak Ortak Lenfoid progenitörlerin dan Fare plazmositoid dendritik hücreler İn Vitro Nesil

Burada, insan pluripotent kök hücre (hPSC) kültür hPSCs CD34 ayırt etmek için kullanılan iletişim kuralları, mevcut+ hematopoetik ataları. Bu yöntem kurallı WNT ya kesin veya ilkel hematopoetik program sadece hücrelere belirtmek sinyal manipülasyon sahne özgü kullanır.

İlkel ve kesin hematopoetik ataları insan Pluripotent kök hücrelerden farklılaşma yönetmen

Sinirsel potansiyeli olan ilik stromal hücreleri (MSC'ler) kemik iliğinde mevcuttur. Protokolümüz hipoksik ön koşullandırma yoluyla bu hücre popülasyonunu zenginleştirir ve bundan sonra onları olgun Schwann hücreleri haline getirir.

Olgun Schwann Hücrelerinin Üretimi İçin Bir Kaynak Olarak Kemik İçi Türe Göre Progenitör Hücrelerin Hipoksik Ön Koşullandırma

Burada biz belirlenmesi ve GM-CSF myeloid hücrelerin hücre yüksek hızlı sıralama kullanarak tahrik çok sayıda ayırma için bir yöntem sağlar. Beş ayrı nüfus (ortak miyeloid ataları, granülosit/makrofaj ataları, monosit, monosit kaynaklı makrofajlar ve monosit kaynaklı DCs) Ly6C ve CD115 ifade üzerinde göre tespit edilebilir.

Çok sayıda miyeloid ataları ve dendritik hücre öncüleri fare kemik iliği strateji sıralama bir roman hücre kullanarak gelen nesil

Biz nasıl tanımlanmasını ve yalıtılmasını miyeloid ataları fare kemik iliği bir manyetik kombinasyonu ve floresan (MAC'ler ve FACS) sıralama kullanarak üzerinden 6 alt kümelerini göstermek. Bu iletişim kuralı vitro kültürü deneyleri (methylcellulose ya da sıvı kültürleri), in vivo evlat edinen transfer deneyler ve RNA/protein analizleri için kullanılabilir.

Kimlik ve yalıtım Oligopotent ve Lineage için kabul edilen miyeloid ataları fare kemik iliği dan

Burada, dört miyeloid soya immünotipik karakterizasyon ve sitokin kaynaklı cd34+ hematopoetik kök ve ataat hücrelerinin farklılaşması için bir protokol sıyoruz. Bu protokolün uygulamaları cd34+ hücrelerin miyeloid farklılaşması üzerinde miyeloid hastalık mutasyonları veya küçük moleküllerin etkisi üzerine araştırmalar içerir.

İnsan Kordon Kanı Kaynaklı CD34 Pan-miyeloid Farklılaşması+ Hematopoetik Kök ve Progenitor Hücreleri

Keşfedin fare miyeloid öncü 32D/G-CSF-R hücre hattında genetik modifikasyon ve farklılaşma analizleri. Bu yöntem, hematoloji alanında miyeloid hücre gelişimini ve gen fonksiyonlarını incelemek için güçlü bir araç sunar.

Nükleer silahların yayılmasına karşı ve fare Miyeloid habercisi 32D/G-CSF-R farklılaşma hücre

Daha fazla video keşfet