Kombinasyon tedavisi Trichostatin A ve C vitamini fareler somatik hücre nükleer Transfer tarafından klonlama daha etkili olmasını sağlar.

Bu deneyin genel amacı, somatik hücre nükleer transferi kullanarak yeniden yapılandırılmış embriyoların ve klonlanmış farelerin üretim verimliliğini artırmaktır. Bu yöntem, temel biyoloji, gelişim biyolojisi ve nesli tükenmekte olan hayvanları kurtarma alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Embriyonik gelişim, nükleer programlama ve genetik araştırmaların korunması gibi.

Bu yöntem ve tekniğin temel avantajı, basit prosedürlerle pratik bir verimlilik seviyesine sahip klonlanmış fareler üretmenin mümkün olmasıdır. Metin protokolüne göre kültür ortamını hazırladıktan sonra, 10 mL steril oda sıcaklığında su içinde 1.2 gram BSA'yı çözün. Hafifçe karıştırarak oda sıcaklığında BSA çözeltisine yaklaşık 0.12 gram karışık iyon değiştirici reçine boncukları ekleyin.

Boncukların rengi mavi, yeşilden altın rengine döndüğünde, süpernatan çözeltiyi geri kazanmak için bir pipet kullanın, ardından boncukları yeni bir partiyle değiştirin. Taze boncukların renk değiştirmediğini onayladıktan sonra çözeltiyi geri kazanın. Ardından 250 mikrolitre% 10.5 sodyum bikarbonat ekleyin.

0,45 mikronluk bir filtre kullanarak süpernatanı sterilize edin, ardından DBSA stok çözeltisi olarak etiketleyin ve eksi 20 santigrat derecede saklayın. Metin protokolüne göre süperovülasyona maruz kalan dişi farelerde ötenazi yapıldıktan sonra, üreme sistemine erişmek için karnı kesmek için standart diseksiyon teknikleri kullanıldı. Küçük düz makas ve cımbız kullanarak, yumurta kanallarını çıkarın ve yüzeydeki kanı silmek için bir filtre kağıdına aktarın.

Daha sonra, yumurta kanallarını mineral yağa koyun, daha sonra yumurta kanalının ampullasını kesmek için diseksiyon iğneleri kullanın ve ampulladan gelen kümülüs oosit komplekslerini% 0.1 hyaluronidaz ile 200 mikrolitrelik HCZB ortamına taşıyın. Dokuyu bir ısıtma plakasında beş dakika inkübe edin. Bir stereomikroskop altında, kümülüs hücrelerinin kümülüs oosit komplekslerinden salındığını doğrulayın, daha sonra ikinci mayotik veya M2 metafaz evre oositlerini kalan bazı kümülüs hücreleriyle birlikte% 0.3 DBSA içeren MKSOM ortamına aktarın.

Kalan kümülüs hücrelerini ayırmak için M2 evresindeki oositleri ortamda yukarı ve aşağı pipetleyerek dört kez yıkayın. Daha sonra oositleri enükleasyona kadar 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit sıcaklıkta inkübe edin. Denuded oositleri kümülüs oosit komplekslerinden izole etmek için, bir pipet kullanırken stereomikroskop altında, kümülüs oosit komplekslerinden dağılan kalan kümülüs hücrelerinin az bir kısmını% 6 DBSA ile HCZB ortamına aktarın.

Kümülüs hücrelerini, somatik hücre nükleer transferi veya SCNT için gerekli olana kadar 37 santigrat derecede ısıtma plakasına yerleştirin. Metin protokolüne göre PVP besiyeri ve CB stok çözeltilerini hazırladıktan sonra, M20 evresindeki oositleri yıkamak için mililitre CB başına beş mikrogram CB içeren 2 mikrolitre HCZB besiyeri içeren sterilize bir pipet kullanın. Yıkamayı beş kez tekrarladıktan sonra, oositleri ısıtma plakası üzerinde 10 dakika boyunca enükleasyon solüsyonunda inkübe edin.

Daha sonra, enükleasyon odasını hazırlayın, ardından M2 oositlerini odaya aktarmak için bir pipet kullanın. Dört mikrolitre enükleasyon çözeltisi ekleyin ve hazneyi mineral yağ ile kaplayın. Oda sıcaklığında bir mikroskop altında, M2 evresi oositin iğlerini ve kromozomlarını tanımlayın.

Daha sonra bir tutma pipeti ve mikropipet kullanarak, oositi belirgin bir birinci polar cisimle yönlendirin, böylece iğ ve kromozomun konumu 3:00 veya 9:00 konumunda olur. Paizo nabız yoğunluğunu üç ila altıya ayarlayın ve bir mikromanipülasyon pipeti kullanarak zona pellucida'yı delin ve içinde bir delik açın. Daha sonra minimum miktarda sitoplazma ile iğleri ve kromozomları tamamen enüklee edin.

Görünür ışık altında, sitoplazmada kromozomların olmadığını doğrulayın, daha sonra CB içermeyen% 0.3 DBSA içeren MKSOM ortamı ile enükleasyonlu oositleri iyice yıkayın. Çanağı hücre füzyonuna kadar 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. HBJE'yi hazırlamak için, liyofilize HVJ-E'ye 260 mikrolitre buz gibi HBJE süspansiyon solüsyonu ekleyin ve tamamen süspanse olana kadar yukarı ve aşağı pipetleyin.

Çözeltinin beş mikrolitrelik alikotunu hazırlayın ve hücre füzyonuna kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın. Hücre füzyonunu gerçekleştirmek için, beş mikrolitre HVJ-E çözeltisini seyreltmek için 20 mikrolitre hücre füzyon tamponu kullanın. Seyreltilmiş HBJE çözeltisini kullanana kadar buzun üzerine koyun.

Hücre füzyon odasını burada gösterildiği gibi hazırladıktan sonra, enükleasyonlu oositleri odadaki HCZB ortamına aktarmak için bir pipet kullanın. Gösterildiği gibi her çözeltiden dört mikrolitre ekleyin ve hazneyi kaplamak için yaklaşık bir mililitre mineral yağ kullanın. Enükleasyonlu oositlerin bulunduğu odayı oda sıcaklığında, 400x büyütmede mikroskop altına yerleştirin.

Daha sonra mikromanipülasyon pipetini kullanarak donör hücreleri HVJ-E süspansiyon çözeltisine aktarın. Kümülüs hücrelerini birbirinden eşit olarak ayırmak için tek tek aspire edin ve seri hücre füzyonunu sağlayın. Daha sonra bir tutma pipeti ile, enükleasyonlu oositleri HCZB ortamında tutun ve zona pellucida'yı delmek için mikromanipülasyon pipeti ile paizo nabzını kullanın.

Zona pellucida'daki deliği açtıktan sonra, HVJ-E solüsyonunun hacminin yaklaşık beş katı olan bir kümülüs hücresi pipetleyin ve zardan geçmeden oosit zarına sıkıca dışarı atın. Hücre füzyonunun manipülasyonunu takiben, oositleri derhal% 0.3 DBSA içeren MKSOM ortamına aktarın ve bir saat boyunca% 37 santigrat dereceve% 5 karbondioksitte bir inkübatöre taşıyın. Enükleasyonlu oositlerin mikroskop altında HCVB ortamına yerleştirilmesinden inkübatöre geri gönderilmesine kadar geçen 10 dakika içinde bu adımların tamamlanması gerekir.

Hücre füzyonunu takiben, 400x büyütmede mikroskop altında yeniden yapılandırılmış oositlerde erken kromozom yoğunlaşması olup olmadığını kontrol edin. Yeniden yapılandırılmış oositleri trikostatin A veya TSA içeren aktivasyon ortamına aktarın ve altı saat boyunca havada 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. SENT embriyolarında pronükleus oluşumunu gözlemleyin, ardından %0.3 TBSA ile MKSOM besiyerinde iki saat daha TSA tedavisi uygulayın.

C vitamini tedavisini metin protokolüne göre gerçekleştirin. Bu tabloda görüldüğü gibi, klonlanmış farelerde TSA ve C vitamini tedavisi oositler çok yüksek oranda pronükleer oluşum göstermiştir ve her koşulda iki hücre aşamasına kadar gelişmiştir. Kümülüs hücrelerinden türetilen ve iki hücre aşamasına geliştirilen bazı klonlanmış embriyolar, yalancı gebe kadınların yumurta kanallarına aktarıldı.

Bu şekil, TSA ve C vitamininin seri tedavisi ile üç hamile dişiden üretilen 72 transfer edilmiş embriyodan gelişen altı klonlanmış yavruyu göstermektedir.Son olarak, burada gösterildiği gibi, TSA ve VC ile tedavi, in vitro embriyonik gelişimin blastosist aşamasına kadar olan etkinliğini önemli ölçüde artırmıştır. Bu prosedürü denerken, gerekli tüm ortam ve reaktiflerin önceden hazırlandığını hatırlamak önemlidir. Prosedürün kendisi, takip etmesi basit ve iyi hazırlanmış materyaller, beklenen sonuçların elde edilmesini sağlayacaktır.

Bu videoyu izledikten sonra, yeniden yapılandırılmış oositlerin nasıl üretileceğini iyi anlamış olmalısınız.