Farelerden Pankreas Adacık İzolasyon için Basit Bir Yüksek Verimlilik Protokolü
30 Ağustos 2019
Bu adacık izolasyon protokolü ekroz dokuyu sindirmek için kollajenaz enjeksiyonunun yeni bir rotasını ve adacıkları farelerden arındırmak için basitleştirilmiş bir degrade prosedürünü tanımlamıştır. Enzimatik sindirim, degrade ayırma/arıtma ve adacık el toplama içerir. Başarılı yalıtım fare başına 250-350 yüksek kaliteli ve tam işlevsel adacıklar verebilir.
Bu protokol, daha karmaşık konvansiyonel adacık izolasyon yöntemlerine kıyasla önemli ölçüde daha az emek yoğun ve daha uygun maliyetli hale tek bir yoğunluk gradyan kullanımını gerektirir. Bu protokolün ana avantajı enzim pankreas gelişmiş doku sindirim ve artan adacık verimi ile sonuçlanan doğrudan teslim olmasıdır. Supine pozisyonda farenin uzuvları dokunarak ve% 70 etanol ile vücut püskürtme ile başlayın.
Coverglass forceps ve kavisli cerrahi makas kullanarak, yaklaşık üç santimetre yatay karın deri kesi yapmak ve karın duvarı ortaya çıkarmak için cilt açık çekin. Pankreası tamamen ortaya çıkarmak ve fareyi bir diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirmek için abdominal periton üzerinde 3-4 santimetrelik dikey kesi yapın. Soluk pembe bir tüp olarak görünen safra kanalını ortaya çıkarmak için karaciğer lobunu üstün bir şekilde itin ve safra kanalını ve hepatik arteri ortaya çıkarmak için bağırsakları sağ lomber ve iliak bölgesinden karın boşluğunun sağına doğru hafifçe hareket ettirin.
Schwartz mikro serrefines dikkatle mümkün olduğunca karaciğere yakın ortak safra kanalı kelepçe ve duodenal papilla bulunan ve pankreas kanalı ve ortak safra kanalı nın birleşmesi ile oluşturulan Vater ampulla tanımlamak için kullanın. Öğretilen ortak safra kanalını çekmek için mikro Adson forsepsleri kullanarak, üç mililitrelik bir şırıngaya bağlı 30 kalibrelik yarım inçlik bir iğne yerleştirin ve üç mililitrelik taze hazırlanmış kollajenaz P çözeltisi içeren ampulla vater'in iğneyi damarın yaklaşık dörtte biri boyunca damara paralel olarak kolileterek damara paralel olarak sokun. İğne yerleştirildikten sonra, mikro Adson forsepsile iğneyi stabilize edin ve kanala üç mililitre kollajenaz P çözeltisi enjekte edin.
Pankreasın baş, boyun, vücut ve kuyruk bölgeleri tamamen şişirilmiş ise enjeksiyon başarılı olarak kabul edilir. Ampulla doğru giriş ve ortak safra kanalı kanülasyonu başarılı bir sindirim hasat için çok önemlidir. Duktal duvarların delinme izolasyon etkinliğini azaltır.
Kavisli ve mikro Adson forceps kullanarak, dikkatle dalak başlayan ve mide doğru devam ve duodenum boyunca şişirilmiş pankreas çekin. Sonra buz soğuk kollajenaz P çözeltisi üç mililitre içeren bir 50 mililitre sindirim tüpü içinde pankreas yerleştirin. Adacıkları hasat etmek için, ilk 12 ila 13 dakika boyunca dakikada 100 ila 120 rotasyonlar 37 derece santigrat su banyosu tüp yerleştirmeden önce üç ila beş saniye pankreas doğrayın ince cerrahi makas kullanın.
Kuluçka sonunda, yavaşça çözelti ince kum benzeri pankreas dokusu parçacıkları tarafından onaylanan homojen olana kadar doku bozmak için yaklaşık 30 saniye boyunca tüp sallamak. Doku sindirilir sindirilmez, tüpü buza yerleştirin ve enzimatik reaksiyonu sonlandırmak için 40 mililitre buz gibi soğuk dur solüsyonu ekleyin. Peleti hafifçe bozduktan sonra, sindirilmiş dokuyu sallanan bir kova santrifüjünde aşağı doğru döndürün ve ardından yıkama başına 20 mililitre taze durdurma solüsyonu ile iki santrifüj edin.
Son yıkamadan sonra, üç ek yıkama için buz gibi HBSS 40 mililitre pelet resuspend, son yıkamadan sonra oda sıcaklığında degrade çözeltisi beş mililitre pelet resususpend. Çözelti homojenize olana kadar tüpü kısa bir süre düşük hızda girdaplayın ve tüpün içine beş mililitre oda sıcaklığı yoğunluğu degradesi daha eklenebilir. Şimdi yavaşça ve yavaş yavaş bir degrade oluşumunu sağlamak için bir damla akıllıca bir şekilde tüp oda sıcaklığında HBSS 10 mililitre eklemek ve yoğunluk gradyan ayırma hücre popülasyonları izole etmek için sallanan bir kova santrifüj kullanmak için 10 mililitrelik pipet kullanın.
Santrifüjsonunda, yoğunluk gradyanı ile HBSS arasındaki adacık tabakasının 5 ila 10 mililitresini toplamak için soğuk HBSS ile önceden ıslak 10 mililitrelik bir pipet kullanın. Adacıkları 20 mililitre taze buz soğuk HBSS içeren yeni bir 50 mililitrelik tüp içine aktarın ve sallanan bir kova santrifüj içinde santrifüj ile hücreleri toplamak. Peleti bozmadan supernatantın son üç mililitresi hariç hepsini dikkatlice aspire edin ve adacıkları yıkama başına 20 mililitre taze HBSS ile en az üç kez daha yıkayın.
Son yıkamadan sonra, 37 derece Santigrat RMPI 1640 orta dört mililitre ile supernatant değiştirin ve yavaşça pelet çıkarmak için tüp girdap. Adacıkları hemen 100 milimetrelik Petri kabına dökün ve diğer adacıklarla yıkamayı sağlayan kalan adacıkları toplamak için tüpü beş mililitre taze RPMI 1640 orta sıyla yıkayın. Daha sonra bir diseksiyon mikroskobu ve 20 mikrolitrelik pipet ucu kullanın ve 10 mililitre tam RPMI 1640 orta içeren yeni bir Petri kabına aktarmak için Petri kabından pürüzsüz bir yüzeye sahip sağlıklı küresel veya dikdörtgen altın kahverengi adacıkları seçin.
Tüm adacıklar toplandığında, adacıkları steril bir kuluçka makinesine 37 santigrat derece ve nemlendirilmiş havada bir gecede %5 karbondioksit yerleştirin. İyi sağlıklı adacıklar pürüzsüz yuvarlak bir şekle sahip ken kötü hasarlı adacıklar pürüzlü kenarlar sergilerler. Sindirilmemiş ekzonrin doku görünümünde yarı saydam dır ve düzensiz bir şekil gösterir.
Uygun bir kanülasyon ve kollajenaz P enzimdağılımı pankreas Dalakik kısmının bir enflasyon ile teyit edilebilir. Düşük glikoz lu ortamda bir gecede kuluçka adacıkları bir glukoz uyarılmış insülin salgılama tonu için ertesi gün adacıkların insülin salgı kapasitesi hakkında bilgi sağlayan astarlar astarlar olabilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, gelişmiş doku sindirimi ve adaçık verimi için kollagenaz enjeksiyonu kullanan yeni bir adaçık izolasyon protokolü sunmaktadır. Yöntem, gradyan ayırma sürecini basitleştirerek fare başına 250–350 yüksek kaliteli adaçığın başarılı bir şekilde izole edilmesini sağlar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Biyoloji
- Adaçık İzolasyon Teknikleri
Arka Plan
- Adaçık izolasyonu, diyabet araştırmaları için kritik öneme sahiptir.
- Geleneksel yöntemler emek yoğun ve maliyetli olabilir.
- İyileştirilmiş teknikler, adaçıkların verimini ve işlevselliğini artırabilir.
- Kollagenaz enjeksiyonu doğrudan pankreası hedefler.
Çalışmanın Amacı
- Daha az emek gerektiren bir adaçık izolasyon protokolü geliştirmek.
- Fare pankreasından işlevsel adaçık verimini artırmak.
- İzole edilen adaçıkların kalitesini korurken prosedürü basitleştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Adaçık saflaştırması için tek yoğunluklu gradyan.
- Ekzokrin dokunun enzimatik sindirimi.
- İzole edilen adaçıkların elle seçilmesi.
- Pankreası açığa çıkarmak için cerrahi tekniklerin kullanılması.
Ana Sonuçlar
- Gelişmiş doku sindirimi, daha yüksek adaçık verimine yol açar.
- Protokol, fare başına 250–350 yüksek kaliteli adaçık verir.
- Geleneksel yöntemlere kıyasla daha az emek gerektirir.
- Adaçık izolasyonu için uygun maliyetli bir yaklaşımdır.
Sonuçlar
- Yeni protokol, adaçık izolasyon verimini önemli ölçüde artırır.
- Doğrudan enzim uygulaması, genel verimi ve kalitesi artırır.
- Bu yöntem, diyabet konusundaki araştırmaları kolaylaştırabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Pancreatic islet isolation is a critical bottleneck in diabetes research, where low yield and labor-intensive protocols limit throughput for target validation and mechanistic studies. This protocol enhances predictive confidence by delivering collagenase P directly to the ampulla of Vater, enabling more complete enzymatic and mechanical digestion of exocrine tissue. The resulting increase in islet yield and quality supports reliable ex vivo insulin secretion assays, directly informing lead identification and preclinical model selection for diabetes therapeutics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of β-cell function and insulin secretion pathways through high-yield islet recovery.
- Operational Value: Reduces technical barriers to islet access, supporting consistent target validation across multiple mouse strains or disease models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces islets suitable for glucose-stimulated insulin secretion assays, providing quantitative readouts for compound screening.
- Operational Value: Simplifies purification via a single density gradient, improving assay standardization and reproducibility across screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant systems by providing primary islets that maintain endocrine function for preclinical efficacy testing.
- Operational Value: Enables continuity from discovery to preclinical work by delivering islets ready for functional validation in diabetic models.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum by supplying validated primary islets for downstream applications in lead identification and preclinical validation, particularly for diabetes-focused programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of insulin secretion mechanisms through access to functional islet populations.
- Screening: Delivers standardized islet preparations enabling reliable compound evaluation in secretion assays.
- Analytics: Generates quantitative dependent variable measurements (e.g., insulin release) that help compare experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by providing disease-relevant islets for validation in diabetic models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable isolation capability that reduces dependency on external suppliers and increases internal assay throughput.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through reduced mechanistic ambiguity in islet function.
- Operational Value: Standardization and scalability via simplified single-gradient purification and direct enzyme delivery.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions in diabetes programs by improving success rates of islet-based assays.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of compounds based on reliable insulin secretion data from high-yield islet preparations.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgical techniques for pancreatic duct cannulation and tissue handling.
- Depends on access to dissection microscopes, centrifuges, and temperature-controlled water baths for enzymatic digestion.
- Necessitates standardization of collagenase P concentration and incubation timing across operators to ensure consistent islet quality.
- Requires adaptation of gradient volumes and wash protocols when scaling to different mouse strains or ages.
- Practical limitations include potential islet damage from over-digestion, which can be mitigated by optimizing enzymatic exposure time as described in the protocol.
