Çoğaltılmış izotermal amplifikasyon Zika, Chikungunya ve dang 1 tespit etmek için teşhis platformu dayalı

Bu prosedürün genel amacı, kapsamlı numune hazırlama ve pahalı enstrümantasyon gerektirmeyen ve çeşitli biyolojik numunelerde kullanılan çoğullanmış bir bakım noktası teşhis platformunun kullanımını göstermektir. Bu yöntem, tek bir reaksiyon tüpünde farklı hedeflerin tespiti gibi bakım noktası teşhisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Hedefe özgü iplikçik yer değiştirme probları ile birleştirilmiş döngü aracılı izotermal amplifikasyon kullanılarak, üç farklı virüs verimli bir şekilde tespit edilebilir.

Bu tekniğin temel avantajı, PCR yerine izotermal amplifikasyon kullanması ve minimum numune hazırlığı gerektirmesi ve bir dizi klinik numuneye uygulanabilmesidir. Q-kağıt tabakalarını bir kağıt zımbası kullanarak üç milimetreye dört milimetrelik küçük dikdörtgenler halinde keserek başlayın. Ardından, her bir kağıda potansiyel olarak Zika ile enfekte olmuş Aedes aegypti dişi sivrisineklerini ezmek için bir mikro havaneli kullanın.

Her bir kağıt parçasına 20 mikrolitre bir molar sulu amonyak çözeltisi pipetleyin. Beş dakika sonra, her kağıdı 20 mikrolitre% 50 etanol ve ardından 20 mikrolitre nükleaz içermeyen su ile yıkayın. Kağıdı bir BSL-2 biyogüvenlik kabininde yaklaşık bir saat havayla kurutun.

Kuruduktan sonra, her bir kağıdı 100 mikrolitre RT-LAMP reaksiyon karışımına tamamen batırmak için cımbız kullanın ve 65 ila 68 santigrat derecede 45 dakika inkübe edin. Zika virüsünden kaynaklanan floresansı, bir LED ışık kaynağı ve turuncu veya sarı bir filtre ile 3D baskılı bir gözlem kutusu kullanarak okuyun ve kaydedin. Liyofilize RT-LAMP reaktifleri içeren her reaksiyon tüpüne 90 mikrolitre 1.1 kat rehidrasyon tamponu ekleyerek başlayın ve çalkalayarak çözün.

Sonra kısaca yerçekiminin 1.000 katı ile aşağı doğru döndürün. Santrifüjlemeyi takiben, viral RNA ile çivilenmiş 10 mikrolitre idrar örneğini reaksiyon tüplerine ekleyin ve pipetleme ile karıştırın. Sivrisinekleri test ediyorsanız, idrar yerine 10 mikrolitre arıtılmış su ile birlikte sivrisinek leşlerini tutan bir dikdörtgen Q-kağıdı ekleyin.

Kapalı tüpleri 65 ila 68 santigrat derece arasında önceden ayarlanmış bir ısı bloğuna yerleştirin ve 30 ila 45 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, gelecekteki tahlillerin kontaminasyonunu önlemek için tüpleri kapalı tutun ve gözlem kutusuna yerleştirin. Gözlem kutusunun arkasındaki anahtarı açın.

Numuneyi turuncu filtreden gözlemleyin ve görüntüyü, görüntünün görüş alanının %80'ini doldurduğu bir mesafede tutulan bir cep telefonu kamerasıyla yakalayın. Görselleştirme tamamlandıktan sonra anahtarı kapatın. Mühürlü tüpleri karanlıkta, tercihen daha sonra görselleştirme gerekiyorsa soğutma ile saklayın.

Hem singleplex hem de multipleks durumlarda, RT-LAMP ürünleri agaroz jel üzerinde çalıştırıldığında bir birleştirici harfi olarak görünür. Numune olarak su içeren negatif kontrol numuneleri, enfekte olmamış bir dişi sivrisinekten ekstrakte edilen toplam nükleik asidin şablon olarak kullanıldığı spesifik olmayan hedef kontrol de dahil olmak üzere, yalnızca primerlerin kendileri için bantları verdi. Zika için FAM ile etiketlenmiş beş asal NT olarak problar kullanılarak yeşil floresan gözlenir.

Açık yeşil sarı floresan, probun HEX ile etiketlenmiş beş asal NT olduğu Chikungunya'ya atanır. Dang humması-1 için turuncu kırmızı bir floresan kullanılır, burada probu TAMRA ile etiketlenmiş beş asal NT'dir. Sivrisinek içeren iki kağıt doğrudan RT-LAMP karışımına batırıldı ve 30 dakika boyunca 65 santigrat derecede inkübe edildikten sonra, Zika virüsü varlığında parlak yeşil floresan gözlendi.

Dokuz hacim rehidrasyon tamponu ve bir hacim idrar örneği kullanılarak, 30 dakika içinde görünür yeşil floresan oluşturulabilir ve görüntü herhangi bir cep telefonu kamerası tarafından yakalanabilir. Geliştirilmesinden sonra bu teknik, klinik teşhis alanındaki araştırmacıların idrar, kan, tükürük veya sivrisinek leşlerindeki sivrisinek kaynaklı virüsleri tespit etmek için bakım noktası platformlarını keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, çeşitli biyolojik örneklerde Zika ve diğer arbovirüsleri multipleks bir şekilde tespit etmek için bir izotermal amplifikasyon sisteminin, bu durumda lambanın nasıl kullanılacağını iyi anlamalısınız.