Name: Tetradotoksin dayanıklı sodyum kanallarını kullanarak Drosophila Monosynaptic bağlantıları inceleyerek (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: Öğrenin, Drosophila'da tetrodotoksin dirençli sodyum kanalları kullanarak monosinaptik bağlantıları elektrofizyolojik olarak nasıl tanımlayacağınızı. Bu yöntem, sinapsların kimyasal doğasını ortaya çıkarır ve nörobilim araştırmaları için değerlidir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

El yazması üzerinde Joshua Singer, Jonathan Schenk yanı sıra düşünceli gözden geçirenler yorum için teşekkür etmek istiyorum. Ayrıca Ben beyaz ve Harold Zakon tekniği üzerine tartışmalar için teşekkür etmek istiyorum. Jonathan Schenk verileri şekil 3Aiçin sağlanan. Bu eser Whitehall Vakfı Hibe ve NIH R21 QG için tarafından desteklenmiştir.

1. uçar ve tanımlamak GAL4 organizatörü satırları hazırlamak
<ol><li>GAL4 organizatörü satırı seçin ve sinekler UAS-NaChBac transgene ve harekete geçirmek için bir optogenetic transgene ile çapraz. Not: UAS-CsChrimson11 onun yüksek gürültülerinden ve hangi ile NaChBac-aracılı aksiyon potansiyelleri etkinleştirir kolaylığı nedeniyle seçilir. UAS-NaChBac ve UAS-CsChrimson Bloomington hisse senetleri deposundan mevcuttur.</li>
	<li>All-trans retinal etanol (35 mM) hisse senedi bir çözüm olarak hazırlamak ve çözüm dondurucu-20 ° C'de depolayın</li>
	<li>Mix 28 µL yaklaşık 5 mL rehydrated patates de içine bu stokunun gıda pul ve geleneksel Drosophila orta bir şişe başına bu karışımı ekleyin.</li>
	<li>Yetişkin sinekler 0.2 mM all-trans-retina 1 – 3 gün11içeren gıda csChrimson ifade yükseltmek.</li>
</ol>2. TTX hisse senedi hazırlayın
<ol><li>1 mM TTX stok çözeltisi distile veya deiyonize su içinde oluşturun. Bu çözüm birkaç ay için bir laboratuvar buzdolabında saklayın. Birçok kurum TTX tehlikeli veya kontrollü bir madde olarak sınıflandırmak olarak TTX depolanmasını ilgili kurumlarının politikalarına kontrol edin.</li>
</ol>3. sinekler Elektrofizyoloji için hazırlayın
<ol><li>1-3 yaşlı yetişkin uçar gün yetiştirilir gıda all-trans-retina ile toplamak. Not: Yama Drosophila sinir hücreleri12,13sıkma ayrıntılı bir açıklaması için 2013 yılında Murthy ve Turner'ı bakın.</li>
	<li>Sinekler bir cam mercek şişede koymak. Şişe buz sinekler hareketsiz için 1 dakika için üzerine yerleştirin.</li>
	<li>Kaba forseps bir sinek bir ısmarlama kayıt odasına eklemek için kullanın. 1/16" akrilik kesmek 3 ½" Daire lazer odası oluşmaktadır. Nerede özel bir folyo 2 parçalı epoksi ile bağlı olduğu merkezi haline kesim bir delik ¾" olduğunu. Folyo bir üçgen şeklinde anında eklenir umut içerir.</li>
	<li>Balmumu veya UV tedavi edilebilir epoksi hayvan sıkıca içinde kayıt odası güvenliğini sağlamak için geçerli.</li>
	<li>Boynu optik fiber hazırlıkla bir stereomicroscope altında görselleştirme için aydınlatmak. Böylece onlar sinek tarafından doğrudan gelen aydınlatmak onları ayarlayarak boynu liflerin oblik aydınlatma için ayarlayın.</li>
	<li>Hala anında net görselleştirme sağlar en düşük olası ayar için ışık seviyesini ayarlayın. Bu ışık şiddeti bireysel deneyler arasında değişir. Not: Bu protokol adapte edilebilir bir içinde in situ beyin kullanarak yöntemi14explant.</li>
	<li>Harici kayıt salin almak. Serum mM içerir: 103 NaCl, 3 KCl, 5 N-tris (hydroxymethyl) metil-2-aminoethane-sulfonic asit, 8 trehalose, 10 glikoz, 26 NaHCO3, 1 NaH2PO4, 1,5 CaCl2ve 4 MgCl2 (270 – 275 mΩ için ayarlanabilir). Tuz çözeltisi % 95'i O2/5% CO2 ile (carbogen) bubbled ve pH 7,315' e ayarlanabilir.</li>
	<li>4-6 damla hücre dışı kayıt tuz uçmak hazırlık yere. Bu noktada, diseksiyon mikroskop daha iyi görüş için hafif düzeyde artırmak.</li>
	<li>Elektroliz kullanarak bir tungsten tel keskinleştirmek. Tel yapmak için KNO3 doymuş çözeltisi hazırlamak ve ucu bilenmiş kadar 100 ms için 20 kez çözüm içine tel ucu daldırma süre yaklaşık 20 V AC akım uygulayın. Bilenmiş tungsten tel anında ve böylece beyin başkalarının eline geçmesini kafasına kütikül kaldırmak için kullanın.</li>
	<li>Daha fazla beyin trakea ve onu çevreleyen yağ cesetleri çıkarma tarafından ortaya çıkarmak. Antennal loblar, bir bükülmüş tungsten tel veya benzer aracı yavaşça anten folyo odası görünürlüğünü artırmak için kayıt altına sokmak için kullanın. Sharp forceps yavaşça uzakta gözyaşı nerede kayıtları yapılacaktır ilgi alanı kapsayan gliyal kaplama için kullanın.</li>
	<li>Kayıt odası Elektrofizyoloji teçhizat aktarın. Hemen başlangıç perfüzyon harici kayıt salin ile beyin korumak için carbogen ile bubbled. Tuzlu çözüm rezervuar mikroskop sahne üzerinde yerleştirilir ve yerçekimi beslenen-hazırlık için. Bir vakum hattı ve bir 2 L Erlenmeyer şişesi atık salin toplamak için kullanın.</li>
</ol>4. bütün hücreli kayıt elde
<ol><li>Yama Pipetler bir ticari pipet çektirmenin çek. 7 mΩ yakınındaki bir ipucu direnci ile uygun bir pipet elde etmek ayarları için kullanım kılavuzuna bakın.</li>
	<li>İç kayıt çözüm 4 µL yama pipet ekleyin. 140 potasyum aspartat, 10 HEPES, 4 MgATP, 0.5 Na3GTP, 1 EGTA ve 1 iç tuz oluşur KCl mm.</li>
	<li>Yama kelepçe amplifikatör bütün hücreli kayıt için ayarlayın. Amplifikatör'ın uzaklık sıfır ve amplifikatör test darbeleri teslim etmek için ayarla. Burada, bir AM sistemleri yama kelepçe amplifikatör 2400 kullanılır.</li>
	<li>Pipet ile pozitif basınç uygulayın ve hücre yaklaşım. Bir micromanipulator pipet doğrudan ve hücre üzere kullanın. Pozitif basınç serbest bırakmak. Set membran -60 için holding potansiyelini mV. Pipet gigaohm mühür olarak geçerli tutan düşük bir alt picoamp kanıtladığı hücre membran ile oluşturmalıdır. Not: GFP kullanarak hücre hedefleme destekli, ChR2 harekete geçirmek ve potansiyel sinaptik depresyon önlemek için epifluorescent ışık kullanımı en aza indirmek deneyin. Ayrıca adım 5 uygulamadan önce birkaç dakika bekleyin.</li>
	<li>Ayarla test bakliyat -50 teslim etmek belgili tanımlık amplifikatör mV -60 için mV. Yama-kelepçe amplifikatörler üzerinde standart bir ayardır. Test bakliyat yama pipet şarj etmek için geçerli gerekli temsil eden bir büyük capacitative geçici ortaya çıkaracaktır. AM 2400 kapasite tazminat topuzlar ayarlayarak capacitative geçişler veya benzer amplifikatör kaldırın.</li>
	<li>Hücre membran rüptürü ve bütün hücre yapılandırmasını almak için negatif basınç kısa darbeleri uygulayın. Not: nöron kapasitans gösterilen capacitative geçişler büyük bir artış olduğunda bütün hücre yapılandırması görülmektedir. Holding geçerli (temel) küçük bir artış büyük olasılıkla da gözlenir. Amplifikatör geçerli kelepçe moda ayarlayın ve hücre potansiyeli -50 -60 ila için ayarlamak mV.</li>
</ol>5. sinaptik bağlantısını sınama
<ol><li>Işık darbeleri üretmek için bir LED sürücü tetiklemek için veri alma (DAQ) sistemi yapılandırın. Burada, bir ulusal aletleri DAQ sistemi Matlab ile analog bir sinyal LED sürücü için teslim etmek için kullanılır. LED yoğunluğu sürücü analog sinyal aracılığıyla ayarlanır. LED bir 620-630 nm dalga boyu LED var.</li>
	<li>Yüksek güçlü kırmızı LED doğrudan hazırlık altına yerleştirin. 0,238 mW/mm2 anında ulaşır ışık yoğunluğunu ayarlayın.</li>
	<li>Postsinaptik hücre ilgi kayıt sırasında presynaptic nöronlar etkinleştirin. Hücre harekete geçirmek optogenetically, pharmacogentically, elde etmek veya sinir stimülasyonu ile. Burada, csChrimson ve kırmızı ışık ve kısa darbeleri uygulanır. Not: Sinaptik bağlantıları ya EPSPs olarak geçerli kelepçe ya da gerilim kelepçe EPSCs olarak izlenebilir. Sinaptik bağlantı yanıt olarak 40 ms ışık nabız TTX uygulamadan önce görünür olmalıdır. Hiçbir bağlantı gözlem yapılırsa, olası değildir ya da mono - bağlı nöronlar synaptically olan ya da polysynaptically. Potansiyel holding buna göre eksitatör ve inhibitör bağlantıları vurgulamak için ayarlanabilir.</li>
	<li>Bir bağlantı normal salin TTX 1 son bir konsantrasyon ulaşmak için perfüzyon sistemi eklemek gözlem yapılırsa µM. dolaşım pompası yakalamak ve serum TTX korumak için yeniden kullanmak için kullanın. Peristaltik pompa tuzlu çözüm banyodan çizmek ve tuzlu su deposu için geri.</li>
	<li>Bu serum düzeyi yükselişi ve düşüşü için banyoda izin vermez güçlü bir sürekli vakum sağlamak için Pompa hızı ayarlayın. Not: Bütün-hücreye izlenmekte nöron etkinliğinde spiking bırakma TTX uygulanması sonucunda. Bu yeterli TTX salin için eklenmiş olduğunu onaylar.</li>
	<li>Kırmızı ışık (40 ms her darbe için) ve kısa darbeleri tekrar başvur. Bu noktada kalır herhangi bir sinaptik bağlantı büyük olasılıkla monosynaptic. Farmakolojik antagonistleri kalır sinaptik bağlantıları kimyasal doğası TTX içinde test etmek için dolaşım tuz ekleyin. Not: optogenetics ve floresan nöronlar hedefleme birleştirilirken, ısrarla nöronlar presynaptic nüfusa kaydı elde etmek çalışırken değil harekete geçirmek için önemli olabilir. Bu sinaptik depresyona yol açabilir ve bağlantıları görmek zorlaştırır. CsChrimson geniş yeşil flüoresan protein aralığı uzanır bir uzun uyarma grup olduğundan, kırmızı bir fluorophore nöronlar ve channel2rhodopsin görselleştirmek için kullanılabilir (Ch2R) hücre popülasyonlarının heyecanlandırmak için kullanılabilir. Bunu yaparken belirli genetik ve bir özel filtre küp gerektirir. Uygun sinekler üretmek için kırmızı fluorophore (RFP ya da mCherry) hızlı uçar LexA veya Q sistem ikili ifade sistemleri altında yapmak. Bunlar bir Gal4 organizatörü ve UAS-Ch2R ile UAS-NaChBac efektör gen ifade sinekli geçti gerekecektir. Epifluorescence için en uygun filtre küp kırmızı fluorophore heyecanlandırmak için ama heyecanlandırmak Ch2R. buna ek olarak değil bir dar uyarma aralığı vardır, filtre kümesi verilmiş kadar ışık toplamak için uzun pası emisyon filtre içermelidir. Bölüm numaraları et580/25 x ve t600lpxr (49306 set) üzerinden dahil Chroma kümeden özel filtre kullandık ama bir et610lp bariyer/emisyon filtreli.</li>
</ol>

<ol><li>Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin-2-assisted+circuit+mapping+of+long-range+callosal+projections%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections.</a> Nat Neurosci. 10, 663-668 (2007).</li>
<li>Yao, Z., Macara, A. M., Lelito, K. R., Minosyan, T. Y., Shafer, O. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+functional+neuronal+connectivity+in+the+Drosophila+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Analysis of functional neuronal connectivity in the Drosophila brain.</a> J Neurophysiol. , 684-696 (2012).</li>
<li>Doyle, M. W., Andresen, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliability+of+monosynaptic+sensory+transmission+in+brain+stem+neurons+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Reliability of monosynaptic sensory transmission in brain stem neurons in vitro.</a> J Neurophysiol. 85, 2213-2223 (2001).</li>
<li>Nicholls, J. G., Purves, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+chemical+and+electrical+connexions+between+sensory+and+motor+cells+in+the+central+nervous+system+of+the+leech%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol-London%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic chemical and electrical connexions between sensory and motor cells in the central nervous system of the leech.</a> J Physiol-London. 209, 647-667 (1970).</li>
<li>Byrne, J. H., Castellucci, V. F., Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+individual+mechanoreceptor+sensory+neurons+to+defensive+gill-withdrawal+reflex+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Contribution of individual mechanoreceptor sensory neurons to defensive gill-withdrawal reflex in Aplysia.</a> J Neurophysiol. 41, 418-431 (1978).</li>
<li>Liao, X., Walters, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+elevated+divalent+cation+solutions+to+isolate+monosynaptic+components+of+sensorimotor+connections+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Meth%22%5BJournal%5D)">The use of elevated divalent cation solutions to isolate monosynaptic components of sensorimotor connections in Aplysia.</a> J Neurosci Meth. 120, 45-54 (2002).</li>
<li>Feinberg, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GFP+Reconstitution+Across+Synaptic+Partners+%28GRASP%29+Defines+Cell+Contacts+and+Synapses+in+Living+Nervous+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">GFP Reconstitution Across Synaptic Partners (GRASP) Defines Cell Contacts and Synapses in Living Nervous Systems.</a> Neuron. 57, 353-363 (2008).</li>
<li>Macpherson, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+labelling+of+neural+connections+in+multiple+colours+by+trans-synaptic+fluorescence+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Dynamic labelling of neural connections in multiple colours by trans-synaptic fluorescence complementation.</a> Nat Commun. 6, 10024-10029 (2015).</li>
<li>Zhang, X., Gaudry, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+integration+of+a+serotonergic+neuron+in+the+Drosophila+antennal+lobe%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Functional integration of a serotonergic neuron in the Drosophila antennal lobe.</a> Elife. 5, (2016).</li>
<li>Wilson, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+olfactory+processing+in+Drosophila%3A+mechanisms+and+principles%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Early olfactory processing in Drosophila: mechanisms and principles.</a> Annu Rev Neurosci. 36, 217-241 (2013).</li>
<li>Klapoetke, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+optical+excitation+of+distinct+neural+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Independent optical excitation of distinct neural populations.</a> Nat Methods. 11, 338-346 (2014).</li>
<li>Murthy, M., Turner, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-cell+in+vivo+patch-clamp+recordings+in+the+Drosophila+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Whole-cell in vivo patch-clamp recordings in the Drosophila brain.</a> Cold Spring Harb Protoc. , 140-148 (2013).</li>
<li>Murthy, M., Turner, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+the+head+cuticle+and+sheath+of+living+flies+for+whole-cell+patch-clamp+recordings+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Dissection of the head cuticle and sheath of living flies for whole-cell patch-clamp recordings in the brain.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013, 134-139 (2013).</li>
<li>Gu, H., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Cell+Recordings+from+Brain+of+Adult+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole Cell Recordings from Brain of Adult Drosophila.</a> J Vis Exp. , (2007).</li>
<li>Wilson, R. I., Turner, G. C., Laurent, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+olfactory+representations+in+the+Drosophila+antennal+lobe%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transformation of olfactory representations in the Drosophila antennal lobe.</a> Science. 303, 366-370 (2004).</li>
<li>Kazama, H., Wilson, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeostatic+Matching+and+Nonlinear+Amplification+at+Identified+Central+Synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Homeostatic Matching and Nonlinear Amplification at Identified Central Synapses.</a> Neuron. 58, 401-413 (2008).</li>
<li>Becnel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DREADDs+in+Drosophila%3A+a+pharmacogenetic+approach+for+controlling+behavior%2C+neuronal+signaling%2C+and+physiology+in+the+fly%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">DREADDs in Drosophila: a pharmacogenetic approach for controlling behavior, neuronal signaling, and physiology in the fly.</a> Cell Reports. 4, 1049-1059 (2013).</li>
<li>Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolving+the+lock+to+fit+the+key+to+create+a+family+of+G+protein-coupled+receptors+potently+activated+by+an+inert+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand.</a> P Natl Acad Sci USA. 104, 5163-5168 (2007).</li>
<li>Sun, Q. Q., Wang, X., Yang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laserspritzer%3A+A+Simple+Method+for+Optogenetic+Investigation+with+Subcellular+Resolutions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Laserspritzer: A Simple Method for Optogenetic Investigation with Subcellular Resolutions.</a> PLoS One. 9, e101600-e101608 (2014).</li>
<li>Holloway, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+Glutamatergic+Activation+of+Locus+Coeruleus+and+Other+Lower+Brainstem+Noradrenergic+Neurons+by+the+C1+Cells+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic Glutamatergic Activation of Locus Coeruleus and Other Lower Brainstem Noradrenergic Neurons by the C1 Cells in Mice.</a> J Neurosci. 33, 18792-18805 (2013).</li>
<li>Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+subcellular+organization+of+neocortical+excitatory+connections%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The subcellular organization of neocortical excitatory connections.</a> Nature. 457, 1142-1145 (2009).</li>
<li>Kloppenburg, P., Ferns, D., Mercer, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin+enhances+central+olfactory+neuron+responses+to+female+sex+pheromone+in+the+male+sphinx+moth+manduca+sexta%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Serotonin enhances central olfactory neuron responses to female sex pheromone in the male sphinx moth manduca sexta.</a> J Neurosci. 19, 8172-8181 (1999).</li>
<li>Suster, M. L., Seugnet, L., Bate, M., Sokolowski, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refining+GAL4-driven+transgene+expression+in+Drosophila+with+a+GAL80+enhancer-trap%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Refining GAL4-driven transgene expression in Drosophila with a GAL80 enhancer-trap.</a> Genesis. 39, 240-245 (2004).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

TERPS analiz tanımlanan neurons arasındaki sinapslar tespiti etkinleştirerek çatlama devre için kullanılan güncel teknikler övgü. Özellikle, yaklaşım geniş aksiyon potansiyelleri ile TTX uyarılabilirlik nöronların TTX-duyarlı sodyum kanalı NaChBac ile select bir popülasyondaki geri yüklerken susturmak tarafından monosynaptic bağlantıları ortaya koymaktadır. Postsinaptik olaylar bütün hücreli kayıtları ile izlenir iken sinaptik yayın optogenetic stimülasyon tarafından elde edildi. TERPS kendini KAVRAMAK gibi diğer yaklaşı...

Nöroloji ana amacı bilgi devreleri nasıl aktığını anlamak için nöronlar arasındaki bağlantıları göster etmektir. Çok sayıda yaklaşımlar ve kaynakları model sistemleri1,2aralığında nöronlar arasındaki fonksiyonel bağlantı test etmek kullanılabilir hale gelmiştir. Elektrofizyoloji kullanarak en doğru devre şemaları oluşturmak için iki hücre arasında gözlenen bağlantı doğrudan ve dolaylı ve polysynaptic karşı monosynaptic gidermek önemlidir. Bu ayrım memeli nöronlarda yapmak için bir altın standart presynaptic hücrelerdeki tek action potentials ve ikinci nöron eksitatör postsinaptik akımlar (EPSCs) başlangıcı arasındaki gecikme süresi ölçmek etmektir. Monosynaptic bağlantıları bir kaç milisaniye ve düşük değişkenlik3kısa gecikme süreleri olması gerekir. Çünkü sinapslarda onların dendrites uzak algılama arasında postsinaptik conductances ve kayıt uzun electrotonic mesafeleri nedeniyle gecikmelere neden somatik kayıt sitesi oluşabilir bu yaklaşım omurgasız nöronlarda karmaşık olabilir elektrot. Böyle gecikmeler belirsizlik ile ilgili Poli-monosynaptic katkıları karşı ortaya çıkarabilir. Ayrıca, küçük sinaptik olaylar somatik kayıtları sitenin ulaşmadan önce çürük ve daha güçlü presynaptic etkinlik, sürüş polysynaptic olaylar işe almak olasıdır.
Omurgasızlar monosynaptic bağlantılarına ilişkin test etmek için çeşitli teknikler geliştirilmiştir. Uygulanabilecek yöntemlerden biri aşırı++ Mg ve Ca++içeren yüksek divalent katyon Çözümleri (Hi-Di) kullanır. Bu çözüm azalan bakiyeli yayın olasılık ve algılama monosynaptic giriş4,5lehine artan aksiyon potansiyeli eşik tarafından polysynaptic bağlantıları engeller. Gerekli, Mg Ca++ ++ kesin oranını belirlemek ancak, önemsiz değildir ve polysynaptic katkıları için bile mütevazı stimülasyon6kalıcı. GFP sulandırma genelinde sinaptik ortakları (kavrama) denilen alternatif bir yaklaşım sinapslarda bir monosynaptic bağlantı 7anlaması için bulundu öncesi ve postsinaptik membran arasında yakınlık avantajlarını kullanır. Burada, bir bileşeni yeşil flüoresan protein (GFP) bir neuron ifade edilir ve molekül tamamlayıcı parçası sözde postsinaptik ortak olarak ifade edilir. Floresans varlığını iki neurons sulandırma GFP molekülünün izin vermek için yeterince yakın ve bir synapse varlığını ima olduğunu gösterir. İki hücre membranlar, bir sinir ya da fascicle olduğu gibi yakından apposed KAVRAMAK sinapslarda yanlış, yine de, bildirebilirsiniz. KAVRAMAK türevleri böyle yanlış pozitif GFP presynaptic parçası doğrudan synaptobrevin, böylece yalnızca etkin sinapslarda8' de sulandırma izin için hayvan zinciri tarafından ortadan kaldırmak. Ise KAVRAMAK ve türevleri fonksiyonel bağlantısı'nda Drosophila CNS belirlemede etkili olabilirdi, öncesi ve postsinaptik ortakları arasındaki mesafeleri göreceli olarak büyük ise bazı bağlantılar KAVRAMAK tarafından görünür yapılabilir değil. Bu özellikle ilgili değerlendirme birimi iletim neuromodulation9 veya GABAergic inhibisyon10ile ilişkili olduğunu.
Burada, bir tamamlayıcı ve yeni teknik Drosophila içinde CNS doğrudan monosynaptic bağlantıları sınama gösterilmiştir. Tetradotoksin (TTX) ortak ifade tarafından Tetradotoksin Engineered Direniş sondalama Synapses (TERPS için), denilen bu yöntem inşaat-dayanıklı sodyum kanal, NaChBac ve optogenetic aktivatör sözde üzerinden kayıt sırasında presynaptic hücrede postsinaptik ortakları9. TTX huzurunda tüm aksiyon potansiyeli-aracılı etkinliğini NaChBac ifade dışındaki hücrelerde bastırılır. NaChBac kanal seçici olarak sinaptik iletimi ışık uyarılmış izin uyarılabilirlik hedeflenen presynaptic hücreleri içinde geri yükler. Öyle ki bağlantıları postsynaptically polysynaptic devreler işe alma olasılığını azaltırken somatik kayıt tarafından çözülebilir bu yöntem presynaptic nöronların güçlü harekete geçirmek izin verir. Önemlisi, bu teknik ses iletim çalışma ruhsatı ve bir devre boyunca tek bir nöron serbest verici yayılmasını ortaya koymaktadır. Buna ek olarak, TERPS geleneksel Farmakoloji bağlantısından kimyasal doğası ortaya çıkarabilir. TERPS TTX-duyarlı sodyum kanalları transgenik ifade veren herhangi bir modeli sistem kullanım için uygundur.

<table><tbody><tr><td>UAS-csChrimson</td><td>Bloomington Drosophila Stok Merkezi</td><td>55135</td><td>Nöral aktivatör olarak kullanılır</td></tr><tr><td>UAS-NaChBac</td><td>Bloomington Drosophila Stok Merkezi</td><td>9466</td><td>TTX'teki hücrelerde resotores uyarılabilirliği</td></tr><tr><td>Tetrodotoksin</td><td>Tochris</td><td>1078</td> Tüm trans-Retinal Sigma-Aldrichall kontrollü <td>bir madde olduğu için TTX'i satın almak için özel izin gerekebilir</td></tr><tr><td></td><td>. trans-Retinal</td><td>R2500</td><td>Channelrhodopsin</td></tr><tr><td>Kaynaklanabilir 321 Paslanmaz Çelik için kofaktör gerektirir&nbsp; Çarşaf,&nbsp; 0.002 "&nbsp; Kalın,&nbsp; 10 inç&nbsp; Geniş</td><td>McMaster Carr</td><td>3254K7</td><td>Özel sinek tutucu yapmak için kullanılır. Özel folyo, sağlanan PDF dosyasından pololu.com olarak lazerle kesilebilir</td></tr><tr><td>Diseksiyon Mikroskobu</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000-C</td><td>Preparatın diseksiyonu için kullanılır</td></tr><tr><td>Waxer</td><td>Almore</td><td>Eectra Waxer 66000</td><td>Diseksiyon sırasında folyoda sineği sabitlemek için kullanılır</td></tr><tr><td>Parafin Wax</td><td>Joann</td><td>4917217</td><td>5 numaralı wax ile birlikte kullanılır</td></tr><tr><td>forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>#5CO</td><td>Diseksiyon ve kılıfların çıkarılması için kullanılır</td></tr><tr><td>Diseksiyon</td><td>Makası Güzel Bilim Araçları</td><td>15001-08</td><td>Diseksiyon sırasında kütikül parçalarını çıkarmak için kullanılır</td></tr><tr><td>Tungsten tel</td><td>A-M Sistemleri</td><td>797500</td><td>Diseksiyon için keskinleştirilmiş iğneler yapmak için elektroliz ile kullanın</td></tr><tr><td>Reciküle Peristaltik Pompa</td><td>Basitçe Pompalar (Amazon)</td><td>PM200S</td><td>devridaim için TTX</td></tr><tr><td>Hız Kontrol Cihazı peristaltik pompa</td><td>Zitrades (Amazon)</td> LED Işıklar veya Şerit için <td>N/A</td><td>PWM Karartma Kontrol Cihazı, 12 Volt 8 Amp, Ayarlanabilir Parlaklık Işık Anahtarı Dimmer Kontrol Cihazı DC12V 8A 96W Led Şerit Işığı için B</td></tr><tr><td>Versa-Mount&nbsp; Hassas Basınçlı Hava Regülatörü</td><td>McMaster Carr</td><td>1804T1</td><td>Yama sırasında pozitif basınç uygulamak için</td></tr><tr><td>Cam kılcal damarlar</td><td>Dünya Hassas Aletler</td><td>TW150F-3</td><td>Yama pipetleri için</td></tr><tr><td>Çok Amaçlı Ölçer</td><td>McMaster Carr</td><td>3846K431</td><td>Basınç regülatörü için gösterge</td></tr><tr><td>Elektrofizyoloji Kamera</td><td>Dage MTI&nbsp;</td><td>IR-1000</td><td>IR aralığında (850 nm) çalışan herhangi bir kamera çalışacaktır. csChrimson IR LED Thorlabs'ı etkinleştirebileceği için kırmızı aydınlatma kullanmak istemezsiniz</td></tr><tr><td></td><td>&nbsp;</td><td>M850F2</td><td></td></tr><tr><td>IR LED Thorlabs için</td><td></td> eğik aydınlatma fiber optik <td>için M89L01</td><td>IR LED Objektif lensi ile çiftler</td></tr> ve <tr><td>nbsp;</td><td>Olympus 40X</td><td>LUMPlanFLN</td><td>Bu, çoğu mikroscipte kullanılabilir ve sinek nöronlarını görselleştirmek için iyi çalışır.</td></tr><tr><td>Amber LED</td><td>Thorlabs</td><td>M590L3d</td><td>RFP ve mCherry Blue LED'i görselleştirmek için</td></tr><tr><td></td><td>Thorlabs</td><td>M470L3d</td><td>GFP'yi görselleştirmek için</td></tr><tr><td>GFP filtre seti</td><td>Chroma</td><td>49011</td><td>GFP'yi görselleştirmek veya channel2rhodopsin'i uyarmak için</td></tr><tr><td>Özel mCherry Filtre Seti Chroma</td><td></td><td>&nbsp; ET580/25X ve T600LPXR (49306 setinden) ancak bir et610lp bariyer/emisyon optiği ile</td><td>Yalnızca tanımlanmış nöronları Amber ve mavi LED'i birleştirmek için channel2rhodopsin</td></tr><tr><td>Dichroic</td> ile yamalamak istiyorsanız kullanın <td>Thorlabs</td><td>DMLP550R</td><td>Yalnızca mCherry altında yama kullanın ve channel2rhodopsin'i mavi ışıkla uyarın.</td></tr><tr><td>Kırmızı LED</td><td>LEDSupply</td><td>Cree XPE 620 - 630 nm</td><td>CsChrimson</td></tr><tr><td>LED Sürücü</td><td>LED'lerini</td> sürmek için kullanılırEk <td>3021-D-E-1000</td><td>Optogenetik stimülasyon için LED'leri sürmek için kullanılır</td></tr><tr><td>Manipülatör</td><td>Sutter Instruments</td><td>MP-225</td><td>Kayıtlar sırasında pipeti konumlandırmak için kullanılır</td></tr><tr><td>Patchclamp Amplifikatör</td><td>A-M Sistemleri</td><td>Model 2400</td><td>Eşdeğer bir amplifikatör uygundur</td></tr><tr><td>Bessel Filtre</td><td>Warner Instruments&nbsp;</td><td>LPF 202A</td><td>Yama sırasında osiloskopa giden akım izini filtrelemek için kullanılan yardımcı filtre.</td></tr><tr><td>Veri Toplama Sistemi&nbsp;</td><td>Ulusal Aletler</td><td>NI PCIe-6321&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 781044-01</td><td>Amplifikatörden bilgisayara veri kaydetmek için kullanılır</td></tr><tr><td>Konnektör Bloğu - BNC Terminali BNC-2090A</td><td>Ulusal Aletler</td><td>779556-01</td><td>Amplifikatörü DAQ kartına bağlamak için kullanılır.</td></tr><tr><td>Çelik Folyo&nbsp;</td><td>McMaster Carr</td><td>3254K7</td><td>Özel kayıt odası için çelik folyo</td></tr><tr><td>Mıknatıslar K</td><td>& J Magnetics</td><td>D42</td><td>Kayıt odasını halka standına sabitlemek için</td></tr><tr><td>1/16" Hücre Dökme Akrilik Şeffaf</td><td>Pololu</td><td></td><td>Özel kayıt odası yapmak için kullanılır. Akrilik, sağlanan PDF dosyasından pololu.com olarak lazerle kesilebilir</td></tr></tbody></table>

tetradotoksin dayanıklı sodyum kanallarını kullanarak drosophila monosynaptic bağlantıları inceleyerek

Examining Monosynaptic Connections in Drosophila Using Tetrodotoxin Resistant Sodium Channels

Burada, Tetrotoxin (TTX) Engineered Direniş sondalama Synapses (TERPS için) olarak adlandırılan yeni bir teknik hedef nöronlar arasındaki monosynaptic bağlantıları için test etmek için uygulanır. Yöntem bir transgenik harekete geçirmek Tetradotoksin dayanıklı sodyum kanalda, NaChBac, presynaptic belirli bir neuron ile ortak ifade kullanır. Sözde Post sinaptik ortaklarıyla bağlantı NaChBac ifade edemediği nöronların elektriksel aktivite engeller TTX huzurunda bütün hücreli kayıtları belirler. Bu yaklaşım ile herhangi bir harekete geçirmek ya da kalsiyum görüntüleme bağlantılarının bir muhabir olarak çalışmaya değiştirilebilir. TERPS büyüyen bağlantı ağları içerisinde belirlemek için kullanılabilen araçlar kümesi ekler. Ayrıca güvenilir bir şekilde toplu veya ses iletimi ve yayılma iletim raporları ancak, TERPS benzersizdir.

TERPS mono - ve polysynaptic katkıları sinaptik bağlantıları nöronlar arasında ayırt etmek için kullanılır. Zayıf bir hücre uyarılması doğrudan bağlantıyı sınamak için kullanılan iken, büyük presynaptic faaliyet kez sürüş polysynaptic bağlantıları (şekil 1A) acemi. TTX-duyarlı sodyum kanal NaChBac ve bir optogenetic aktivatör ortak ifade ve bağlantıları polysynaptic bağlantıları (şekil 1B) ortadan kaldırmak için TTX varlığında te...

Bu makalede tarafından istihdam Tetradotoksin ve Tetradotoksin dayanıklı sodyum kanal, NaChBac arasındaki monosynaptic bağlantıları sınamak için bir yöntem sunar.

Tetradotoksin dayanıklı sodyum kanallarını kullanarak Drosophila Monosynaptic bağlantıları inceleyerek

Here, a new technique termed Tetrotoxin (TTX) Engineered Resistance for Probing Synapses (TERPS) is applied to test for monosynaptic connections between ...

Bu tekniğin genel amacı, tetrodotoksin dirençli sodyum kanallarını kullanarak drosophila'da monosinaptik bağlantıları elektrofizyolojik olarak tanımlamaktır. Bu tekniğin temel avantajları, uygulanışının basit olması ve sinapsların kimyasal doğasını ortaya çıkarabilmesidir. Ayrıca hacimsel veya toplu iletimin çalışılması için de uygundur.Genellikle, bu yöntemin yeni uygulandığı videolarda, diseksiyonun zorluğu nedeniyle güçlük çekilmektedir. Ancak yöntem basitçe anlaşıldığında, mantık fareler gibi diğer model sistemlere kolayca aktarılabilir. Kayıtlar için patch pipetlerinin direnci yaklaşık yedi megaohm olmalıdır.Ayrıca, pH değeri 7.3 veya daha düşük olan, %95 oksijen ve %5 karbondioksit içeren karbojen ile sürekli olarak havalandırılan harici kayıt salini hazırlayın. Denekler için, 0.2 milimolar all trans-Retinal içeren besiyerinde çoğaltılan ve csChrimson eksprese eden bir sinek stokuna sahip olun. Kayıtlar için, bir ila üç günlük yetişkinleri seçin.Bunları cam bir sintilasyon şişesine yerleştirin ve bir dakika boyunca buz soğuk koşullarına maruz bırakarak sabitleyin. Ardından, diseksiyon mikroskobundaki ışık seviyesini düşürün ve anestezi uygulanmış bir sineği özel yapım kayıt o

examining-monosynaptic-connections-drosophila-using-tetrodotoxin

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Burada Drosophila larva nöromüsküler kavşakta sinaptik iletim ölçmek için elektrofizyolojik yöntemler açıklanmaktadır. Uyarılmış serbest motor nöron aksonları uyararak yapay olarak başlatılan ve iletim yoluyla NMJ kas uyarılmış postsinaptik tepki ölçülebilir.

Drosophila Larva NMJ Synaptic Potansiyeller kayıt için Elektrofizyolojik Yöntemler

Bu prosedür sinaptik potansiyeller, nöromüsküler bileşke (NMJ) ışık darbeleri ile uyandırmak için mavi bir ışık ile aktive alg kanal ve hücre spesifik genetik ifade araçları...

Synaptic Potansiyellerinin Channelrhodopsin2 aracılığı Uyarım Drosophila Nöromüsküler Kavşaklar

Elektrofizyolojik Kayıt Drosophila Embriyo

Aktif Bölgeleri Diseksiyon ve Görüntüleme Drosophila Nöromüsküler Junction

Bu video, transgenik bir sinek kullanarak monosinaptik bağlantıların test edilmesini gösterir. Sineğin presinaptik nöronlarında tetrodotoksine dirençli sodyum kanalları ve kırmızı ışıkla aktive olan kanallar bulunur ve bunlar postsinaptik nöronlara sinyalleri iletmek için optogenetik olarak uyarılır.

Tetrodotoksin ve Tetrodotoksine Dirençli Sodyum Kanalları Kullanılarak Monosinaptik Bağlantıların Test Edilmesi

Bu video, Drosophila larvasının nöromüsküler kavşağındaki sinaptik bir bouton'dan sinaptik akımları kaydetme tekniğini göstermektedir. Bu teknik, gelişmiş spontan veya asenkron sinaptik aktiviteye sahip mutant sinek hatlarının incelenmesi için önemli olan tek bir sinaptik bouton aktivitesinin izlenmesini sağlar.

Drosophila Larva Nöromüsküler Kavşakta Sinaptik Akımların Kaydedilmesi

Burada, Drosophila larva'daki segmental sinirlere zarar vermek için basit ve yaygın olarak erişilebilen bir yöntem tarif ediyor ve üçüncü instar larva nöromüsküler kavşakta (NMJ) motor nöronların nörodejenerasyonunu görselleştirip sayısallaştırıyor.

Çalışmak İçin Basit Bir Nöronal Mekanik Yaralanma Metodolojisi<em&gt; Drosophila</em&gt; Motor Nöron Dejenerasyonu

Sinaptik akımları, Drosophila Üçüncü INSTAR larva nöromüsküler kavşak görüntülenmeyecektir sinaptik boutons üzerinden focally kaydedilebilir. Bu teknik, tek bir sinaptik bouton etkinliğini izleme sağlar.

Drosophila larva nöromüsküler kavşak sinaptik akımlardan Fokal Macropatch kayıtları

Biz lipophilic floresan boyalar kullanarak Drosophila embriyonik motor nöronların retrograd izleme için bir yöntem açıklar.

Lipophilic Floresan Boyalar Kullanarak Drosophila Embriyonik Motor Nöronların Retrograd İzleme

Burada, nöromüsküler kavşaklar ve kas hücrelerindeki mikrotübül ağlarını görselleştirmek için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Drosophila melanogaster'in güçlü genetik araçlarıyla birleştiğinde, bu protokol, sinir sistemindeki mikrotübül ağı düzenleyici proteinlerin rolü için genetik taramayı ve mikrotübül dinamiği analizini büyük ölçüde kolaylaştırır.

Mikrotübül Ağını Görselleştirmek için Drosophila Larva Nöromüsküler Kavşak ve Kas Hücrelerini Kullanma

Bu protokol, Drosophila melanogaster larvalarının merkezi sinir sisteminde tanımlanmış nöronal partnerler arasındaki fonksiyonel sinaptik aktiviteyi in vivo olarak değerlendirir; genetik olarak kodlanmış araçlar kullanılır. Presinaptik cIVda duyusal nöronların CsChrimson aracılı optogenetik uyarısı, postsinaptik Basin-4 internörlerinde CaMPARI'nin kalsiyuma bağlı fotodönüşümünü indükler.

CaMPARI kullanılarak Drosophila larva merkezi sinir sisteminde bireysel pre- ve postsinaptik partnerlerin fonksiyonel karakterizasyonu

Öğrenin, Drosophila'da tetrodotoksin dirençli sodyum kanalları kullanarak monosinaptik bağlantıları elektrofizyolojik olarak nasıl tanımlayacağınızı. Bu yöntem, sinapsların kimyasal doğasını ortaya çıkarır ve nörobilim araştırmaları için değerlidir.

Tetradotoksin dayanıklı sodyum kanallarını kullanarak Drosophila Monosynaptic bağlantıları inceleyerek

Daha fazla video keşfet