Tetradotoksin dayanıklı sodyum kanallarını kullanarak Drosophila Monosynaptic bağlantıları inceleyerek

Bu tekniğin genel amacı, tetrodotoksine dirençli sodyum kanalları kullanarak drosophila'daki monosinaptik bağlantıları elektrofizyolojik olarak tanımlamaktır. Bu tekniğin temel avantajları, basit olması ve sinapsların kimyasal yapısını ortaya çıkarabilmesidir. Hacim veya toplu iletim çalışması için de uygundur.

Genelde bu yönteme yeni başlayan videolarda diseksiyonun zorluğu nedeniyle zorlanıyoruz. Bununla birlikte, yöntemi basitçe anlayarak, mantık fareler gibi diğer model sistemlere kolayca aktarılabilir. Kayıtlar için, yedi megaohm'a yakın direnç için yama pipetleri bulundurun.

Ayrıca,% 95 oksijen ve% 5 karbondioksit içeren karbojen ile sürekli olarak havalandırılmış, pH'ı 7,3 veya daha düşük olan harici kayıt tuzuna sahip olun. Denekler için, tüm trans-Retinallerin 0.2 milimolar içeren yiyecekler üzerinde yayılan csChrimson eksprese eden bir sinek stoğuna sahip olun. Kayıtlar için bir ila üç günlük yetişkinleri seçin.

Bunları bir cam parıldama şişesine koyun ve buz gibi soğuk koşullara bir dakika maruz bırakarak hareketsiz hale getirin. Ardından, diseksiyon dürbünü üzerindeki ışık seviyesini düşürün ve anestezi uygulanmış bir sineği özel yapım kayıt odasına yüklemek için kaba forseps. Balmumu veya UV ile kürlenebilen epoksi ile çevreleyerek sineği hazneye sabitleyin.

Folyo göğüs kafesinin kabaca yarısına kadar gelecek şekilde sırt tarafı yukarı bakacak şekilde konumlandırın. Harika bir hazırlık elde etmenin anahtarı, folyoda kesilen deliğin tam olarak doğru boyutta olmasıdır, böylece sinek sıkışmaz veya düşmez. Hazırlığı her iki taraftan fiber optik ışıklarla aydınlatın ve mümkün olduğunca loş tutun.

Daha sonra, hazırlığı dört ila altı damla kayıt salin ile örtün. Ardından, diseksiyon için tungsten telini veya filamanı keskinleştirin. Potasyum nitratla doymuş bir çözeltiye yaklaşık 20 volt AC akım uygulayın ve telin ucunu tekrar tekrar çok hızlı bir şekilde çözeltiye batırın.

20 daldırmadan sonra uç keskin olacaktır. Şimdi, kütikülü, ardından trakea ve yağ cisimlerini çıkararak beyni ortaya çıkarmak için keskinleştirilmiş teli kullanmak için yeterli görünürlük sağlamak için ışıkları ayarlayın. Anten loblarına erişmek için, anteni folyo kalkanın altına nazikçe sıkıştırmak için bükülmüş bir tungsten tel kullanın.

Ardından, ilgilenilen alanı kaplayan glial kılıfı nazikçe yırtmak için keskin forseps kullanın. Şimdi kayıt yapmak için hazırlığı elektrofizyoloji teçhizatına aktarın. Teçhizatta, preparatı hemen karbojen ile köpürtülmüş kayıt salini ile perfüze etmeye başlayın.

Mikroskop aşamasının üzerine yerleştirilmiş yerçekimi beslemeli bir tuzlu su çözeltisi rezervuarı kullanın. Atık tuzlu suyu toplamak için bir vakum hattı ve 2 litrelik bir şişe kullanın. Ardından, yama pipetini 4 mikrolitre dahili kayıt solüsyonu ile yükleyin ve pipeti bir mikromanipülatöre takın.

Ardından, amplifikatörün ofsetini sıfırlayın ve amplifikatörü test darbeleri verecek şekilde ayarlayın. Ardından, beynin net bir görüntüsünü elde etmek için IR eğik aydınlatmasını ayarlayın. Şimdi, pipete pozitif basınç uygularken, pipet ile hücreye yaklaşın.

Hücre ile temas kurduğunda, pipeti zara yapıştırmak için pozitif basıncı serbest bırakın. Ardından, zarın tutma potansiyelini eksi 60 milivolta ayarlayın. Ve pipet, hücre zarı ile bir gigaohm conta oluşturmalıdır.

Tutma akımı, düşük alt pikoamp seviyesine düşmelidir. Sabit gigaohm contalar elde etmek için, pozitif basıncı koruyarak pipetinizi temiz tuttuğunuzdan ve dokuya çarpmaktan veya hücrelerinize yaklaşmaktan kaçındığınızdan emin olun. Devam etmek için amplifikatörü eksi 50 ila eksi 60 milivolt arasında test darbeleri verecek şekilde ayarlayın.

Test darbeleri, yama pipetini şarj etmek için gerekli akımı temsil eden büyük bir kapasitif geçici durum ortaya çıkaracaktır. Kapasitif geçiciliği gidermek için, amplifikatör üzerindeki kapasite dengeleme düğmelerini ayarlayın. Şimdi, hücre zarını yırtmak ve tüm hücre konfigürasyonunu elde etmek için kısa negatif basınç darbeleri uygulayın.

Kapasitif geçicilikte büyük bir artış başarıyı gösterir. Tutma akımında küçük bir artış da gözlenmelidir. Ardından, amplifikatörü akım kelepçesi moduna ayarlayın.

Ve hücrenin potansiyelini eksi 50 ile eksi 60 milivolt arasında ayarlayın. Hazırlık olarak, veri toplama sistemini teknolojinin protokolünde belirtildiği gibi yapılandırın. Sistem, preparatın altına yerleştirilmiş, sineği milimetre kare başına 0,238 miliwatt hızında aydınlatacak şekilde konumlandırılmış yüksek güçlü bir kırmızı LED gerektirir.

Şimdi, csChrimson ekspresyonunda darbeli kırmızı ışık kullanarak presinaptik nöronları optogenetik olarak aktive edin. Başka yöntemler de kullanılabilir. Tetrodotoksin uygulamadan önce, 40 milisaniyelik bir ışık darbesine yanıt olarak sinaptik bir bağlantı görünür olmalıdır.

Yanıt olmaması, bağlantı olasılığının düşük olduğu anlamına gelir. Tutma potansiyeli, buna göre uyarıcı veya inhibitör bağlantıları vurgulamak için ayarlanabilir. Bir bağlantı doğrulandıktan sonra, salin bolluğunu salinde devridaim için ayarlayın.

Pompayı, banyodaki tuz seviyesi sabit kalacak şekilde ayarlayın. Ardından, bir mikromolar nihai konsantrasyon için sisteme yeterli miktarda tetrodotoksin ekleyin. Bu, yamalı nöronun ani yükselme aktivitesini durdurmalıdır.

Değilse, sisteme daha fazla tetrodotoksin ekleyin. Şimdi, monosinaptik bir bağlantı olması muhtemel olanı etkinleştirmek için kısa kırmızı ışık darbeleri uygulayın. Ardından, sinaptik bağlantıların kimyasal yapısını test etmek için devridaim salinine farmakolojik antagonistler ekleyerek devam edin.

Tetrodotoksinin hassas sodyum kanalı çentiklerinde transgenik ekspresyonu, nöronlarda uyarılabilirliği kurtarır ve büyük bir plato potansiyeli ile sonuçlanır. Anten lobundaki internöronlar kokulara tepki verir. Bununla birlikte, uyarıcı post-sinaptik akımlar somada kolayca çözülemez.

Peki, yanıtlar doğrudan koku alma reseptörü nöron girdisinden mi kaynaklanıyor? tERP'lerin kullanılması, koku alma reseptör nöronlarının yerel internöronlarla doğrudan bağlantı kurduğunu ortaya koymaktadır. Anten lobundaki serotonerjik nöronların uyarılması, lokal internöronlarda uyarılma ve inhibisyonun bir karışımı ile sonuçlanır.

Geniş bir 5HT reseptör antagonisti olan metilerjit uygulaması, yavaş bir hiperpolarizasyonu bloke etti, ancak depolarizasyon üzerinde hiçbir etkisi olmadı, mekamilamin ise hızlı depolarizasyonu bloke etti. Bu, stimülasyonun kolinerjik olduğunu göstermektedir. tERP'ler, GABA veya nöromodülatörlerle meydana gelen ekstrasinaptik hacim iletimini çözmek için kullanıldı.

Bir örnekte, tetrodotoksin uygulaması lokal internöronda inhibitör bir sinyali baskılamadı. Bu inhibisyon, belirli bir serotonerjik nörondan doğrudan bir sinyal olduğunu düşündüren serotonin antagonisti metisergide kullanılarak bloke edildi. Bu videoyu izledikten sonra, drosophila nöronlarından tam hücre kayıtlarının nasıl elde edileceğini ve tERP'leri kullanarak iletkenliklerini nasıl değerlendireceğinizi iyi anlamış olmalısınız.

Bu prosedürü denerken, sabırlı olmayı ve zor diseksiyonu tekrar tekrar uygulamayı unutmamak önemlidir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde yapılırsa yaklaşık bir saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü takiben, kimyasal sinapsın doğası gibi ek soruları yanıtlamak için farmakoloji gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir.

Tetrodotoksin ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürleri gerçekleştirirken eldiven giymek ve küçük hacimlerle çalışmak gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.