RNA sentezi 5-Bromouridine etiketleme ve Immunoprecipitation kullanarak incelenmesi

Bu deneyin genel amacı, bromouridin etiketleme ve immünopresipitasyon yoluyla RNA sentezindeki değişiklikleri ölçmektir. Bu yöntem, RNA seviyelerindeki bir değişikliğin RNA sentezindeki değişikliklerden kaynaklanıp kaynaklanmadığını ölçerek RNA metabolizması alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, tercih edilen herhangi bir hücre kültürü türünde kullanılabilmesi ve kullanılan malzemelere kolayca erişilebilmesidir.

Protokole başlamak için, 48 saat sonra ekstraksiyondan sonra toplam 40 mikrogramdan fazla RNA elde etmek için 10 mililitre büyüme ortamında 10 santimetrelik bir Petri kabında 3,5 kez 10 ila altıncı HEK293T hücresi tohumlayın. Tohumlamadan 37 saat sonra hücreleri 37 santigrat derece ve% 5 CO2.48'de tutun, sekiz mililitre büyüme ortamını aspire edin ve hücrelerin kurumasını önlemek için iki mililitre geride bırakın. Büyüme ortamına iki milimol bromouridin ve muamele ekleyin ve sekiz mililitre bromouridin içeren büyüme ortamını yeniden uygulamadan önce kalan iki mililitreyi hücrelerden çıkarın.

Sonra, hücreleri bir saat inkübe edin. İnkübasyondan sonra, hücreleri beş mililitre Hank'in tamponunda yıkayın ve hücreleri beş dakika boyunca iki mililitre% 0.05 tripsin ile tripsine edin. Reaksiyonu durdurmak için sekiz mililitre büyüme ortamı ekleyin, hücreleri 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve hücreleri 1.000 kez g'de iki dakika döndürün.

Daha sonra, süpernatanı çıkarın ve bir RNA izolasyon kiti kullanarak hücre peletinden toplam RNA'yı çıkarın ve RNA'yı RNaz içermeyen suda elüte edin. Bu teknik çok hassastır ve bu nedenle yüksek kalitede RNA ile çalışmak önemlidir. RNA ekstraksiyonu bu nedenle kritik bir adımdır, ancak günümüzün RNA ekstraksiyon kitleri ile de kolayca gerçekleştirilir.

İncelenecek numune sayısı için boncukları bir partide hazırlayın, ayrıca pipetleme ve girdaplı karıştırma sırasında kaybı hesaba katmak için fazladan bir tane daha hazırlayın. Anti-Mouse IgG manyetik boncukları girdapla karıştırarak iyice yeniden askıya alın ve RNaz içermeyen 1,5 mililitrelik bir tüpte numune başına 20 mikrolitre boncuk çıkarın. Boncukların yan tarafta toplanması için 1,5 mililitrelik tüpü 20 saniye boyunca manyetik bir standa yerleştirin.

Süpernatanı çıkarın, tüpü manyetik standdan çıkarın ve boncukları pipetleme ile 40 mikrolitre bir kez bromouridin-IP tamponunda yeniden süspanse edin. Tüpü bir masa üstü santrifüjde iki saniye döndürün, manyetik standa geri yerleştirin ve süpernatanı çıkarın. Daha sonra, heparin kullanarak boncuklara belirsiz bağlanmayı engelleyin.

Boncukları bir mililitre bir kez bromouridin-IP artı mililitre heparin tamponu başına bir miligram olarak yeniden süspanse edin ve tüpü 30 dakika döndürün. Ardından boncukları bir kez yıkayın. Boncukları bir mililitre bir kez bromouridin-IP tamponunda yeniden süspanse edin ve anti-alfa-bromodeoksiüridin antikoru örneği başına 1.25 mikrogram ekleyin.

Boncukları döndürürken bir saat inkübe edin. İnkübasyondan sonra boncukları üç kez yıkayın. Yıkanmış boncukları, bir milimolar bromouridin ile desteklenmiş bir kez bromouridin-IP tamponunun numune başına 50 mikrolitrede yeniden süspanse edin ve boncukları 30 dakika boyunca döndürmeye bırakın.

Döndürmeden sonra, boncukları üç kez yıkayın ve boncukları bir kez bromouridin-IP tamponunun numunesi başına 50 mikrolitre içinde yeniden süspanse edin. Ultraviyole görünür spektrofotometri kullanarak RNA ekstraktlarındaki RNA konsantrasyonlarını ölçün ve her numuneden 40 mikrogram RNA'yı RNaz içermeyen suda toplam 200 mikrolitre hacme seyreltin. RNA'yı 80 santigrat derecede iki dakika boyunca denatüre ettikten sonra, örnekleri bir masa üstü santrifüjde kısa bir süre döndürün.

Döndürme işleminden sonra, 200 mikrolitre iki kez bromouridin-IP artı BSA, RNase inhibitörü ekleyin. Ardından, her numuneye 50 mikrolitre yeniden askıya alınmış ve hazırlanmış boncuklar ekleyin ve numuneleri bir saat boyunca döndürün. İnkübasyondan sonra boncukları dört kez yıkayın.

RNA'yı elüte etmek için boncukları 200 mikrolitre elüsyon tamponunda yeniden süspanse edin ve numuneden RNA olmayan molekülleri çıkarmak için hızlı bir şekilde 200 mikrolitre pH 6.6 fenol ekleyin. Karıştırmak için numuneyi döndürün ve bir masa üstü santrifüjde 25.000 kez g'de üç dakika döndürün. Daha sonra, mümkün olduğu kadar üst fazı, yaklaşık 190 mikrolitre aspire edin ve 200 mikrolitre pH 6.6 fenol-kloroform içeren bir tüpe taşıyın.

Numuneler arasında aynı miktarı aspire ettiğinizden emin olun. Numuneyi döndürün ve döndürün. Sıkma işleminden sonra, yaklaşık 180 mikrolitre olan sulu üst fazı aspire ederek kloroform ekstraksiyonu yapın ve 200 mikrolitre kloroform içeren bir tüpe aktarın.

Numuneyi döndürün ve ardından döndürün. Sulu üst fazı, yaklaşık 170 mikrolitreyi aspire edin ve RNA'yı sulu çözeltiden nötralize etmek ve çökeltmek için 17 mikrolitre üç molar pH altı sodyum asetat içeren bir tüpe aktarın. Ardından, RNA ile çökelecek ve peleti daha görünür hale getirecek iki mikrolitre glikojen ekleyin.

Tuz iyonları ve RNA arasındaki bağlanmayı artırmak için 500 mikrolitre %96 etanol ekleyin ve tüpü birkaç kez ters çevirerek karıştırın. Tüpü gece boyunca eksi 20 santigrat derecede veya kuru buz üzerinde 15 dakika bekletin. Soğutulmuş numuneyi döndürün, peleti bozmadan süpernatanı atın ve kalan tuzu gidermek için peleti 185 mikrolitre %75 etanol içinde yıkayın.

Ardından, numuneyi beş dakika boyunca dört santigrat derecede 25.000 kez g'de döndürün. Peleti bozmadan süpernatanı tamamen atın ve peleti kapak açıkken beş ila 10 dakika kurumaya bırakın. Peletin bozulmasını önlemek için peleti tüpün yan tarafına uygulanan 10 mikrolitre RNaz içermeyen suda yeniden süspanse edin.

AsPC-1 hücreleri sıfır, bir, iki ve 4.5 saat boyunca bromouridin ile muamele edildi, ardından toplam RNA ekstraksiyonu ve bromouridin-IP izledi. GAS5 ve GAPDH, bromouridin-IP RNA'da ölçüldü, bu da bir saatlik etiketlemenin arka plana kıyasla dokuz ve 44 kat değişime ulaşmak için yeterli olduğunu gösterdi. İki milimol bromouridin tedavisi, HEK293T hücrelerinde bir saat veya daha uzun dört saatlik tedavi boyunca herhangi bir morfolojik değişikliğe neden olmadı.

PLK-2 inhibisyonu, hem girdide hem de bromouridin-IP'de alfa-sinüklein mRNA'sında bir artışa neden oldu, bu da kararlı durum RNA'sındaki artışın RNA sentezindeki bir artıştan kaynaklandığını düşündürdü. Bu videoyu izledikten sonra, yeni sentezlenen RNA'yı bromouridin ile nasıl etiketleyeceğinizi ve ardından bromouridin ve etiketli RNA'nın immünopresipitasyonunu nasıl gerçekleştireceğinizi iyi anlamış olmalısınız.