Name: RNA sentezi 5-Bromouridine etiketleme ve Immunoprecipitation kullanarak incelenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: Öğrenin bromouridin etiketleme ve immunoprecipitation yöntemiyle RNA sentezi değişikliklerini ölçmeyi. Bu teknik, RNA metabolizması dinamiklerini incelemek ve sentez hızlarındaki değişimleri belirlemek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Lundbeck Vakfı, Aarhus Üniversitesi, Dandrite ve Lundbeck A/S bu çalışmaları destekledi.

Not: Aksi belirtilmediği sürece, oda sıcaklığında tüm adımları uygulayın ve arabellekleri buz üzerinde veya buzdolabında (arabellek elüsyon SDS içeren hariç) tutun. Protokol 5 bölüme ayrılır: RNA hazırlık örnekleri; IP için boncuk hazırlanması; BrU-etiketli RNA boncuk için bağlama; elüsyon ve ilişkili BrU etiketli RNA 3 adımda fenol-fenol/kloroform-kloroform çıkarma tarafından arıtma; RNA analizi (örnekte RT-qPCR kullanarak)
1. hazırlanması RNA örnekleri
<ol><li>Kont HEK293T hücreleri otomatik bir hücre kullanarak counter ve toplam elde etmek için 10 cm petri kabına 10 mL büyüme medya (Dulbecco'nın modifiye kartal orta takıma % 10 fetal buzağı serum ve 50 µg/mL penisilin/streptomisin) 3.500.000 hücrelerde tohum > 40 µg RNA ayıklama 48 saat daha sonra. 37 ° C ve % 5 CO2hücreleri korumak.</li>
	<li>tohum sonra 48 h 8 mL büyüme medya Aspire edin ve kurutma önlemek için 2 mL geride. 2 mM BrU eklemek ve herhangi bir tedavi 8 ml büyüme medya emişli ve kalan 2 mL 8 mL BrU içeren büyüme medya yeniden uygulama önce hücrelerden kaldırma. Bu gen ekspresyonu değişiklikler neden beri BrU başvurusu hücreleri, üzerine taze medya kullanmaktan kaçının.</li>
	<li>1s BrU ve tedavisi için hücreleri kuluçkaya. 5 mL Hank'in arabellek hücrelerde yıkama ve 2 mL % 0.05 tripsin kullanarak hücreleri trypsinize. Reaksiyon durdurmak için bir 15 mL tüp hücreleri aktarıp spin için 2 dk 1000 x g de hücreleri aşağı 8 mL büyüme ortamı ekleyin.</li>
	<li>Süpernatant kaldırmak ve toplam RNA bir RNA yalıtım kullanarak hücre Pelet--dan hulâsa ( Tablo malzemelerigörmek) kiti veya herhangi bir diğer tercih edilen yöntem ve RNase free H2' O. mağaza RNA-80 ° C'de devam etmek için hazır kadar elute.</li>
</ol>2. IP için boncuk hazırlanması
<ol><li>Gruplar halinde boncuklar artı bir pipetting sırasında kaybı için hesap ve karıştırma whirl için ilave araştırılması için örnekleri sayısı için hazırlayın. Anti-fare IgG manyetik boncuklar koşuşturma karıştırma tarafından iyice resuspend ve örnek bir RNase free 1,5 mL tüp başına 20 µL boncuk çıkarmak. Üstünde belgili tanımlık yan toplamak için bir yer manyetik stand ve izin yaklaşık 20 s boncuklar için 1,5 mL tüp.</li>
	<li>Süpernatant kaldırmak, manyetik stand tüpünden dışarı almak ve 400 µL 1 x BrU-IP arabellekte pipetting tarafından resuspend. Çok kısa bir süre için 2 tüp spin bir masa üstü santrifüj s manyetik tribünde yer ve süpernatant kaldırın. Bir kez yıkama adımı yineleyin.</li>
	<li>Blok heparin kullanarak boncuk belirsiz bağlama. 1 mL 1 boncuk resuspend x BrU-IP + 1 mg/mL heparin tampon ve 30 dk. yıkama için boncuk dönen bir kez, adım 2.2 olduğu gibi bırakın. Not: Heparin RNA'lar ile bağlama için yarışacak olumsuz şarj edilmiş bir polimer var. aşağı akım uygulama değil sıralama tRNA ya da alakasız başka RNA'ların da kullanılabilir.</li>
	<li>1 ml 1 x BrU-IP arabellek boncuk resuspend ve de BrU tanır 1,25 µg/örnek anti-α-Bromodeoxyuridine antikor ekleyin. Döndürme sırasında boncuk 1 h için kuluçkaya, veya bir gece oda sıcaklığında.</li>
	<li>Boncuk üç kez olduğu gibi adım 2.2 yıkayın. Boncuk ile 1 mM BrU ve boncuk ve bu vesile ile bağlı antikor duyarlılığını azaltmak 30 dk belirsiz bağlama sırasında IP riskini dönen bırakın takıma 50 µL/Örnek 1 x BrU-IP tampon resuspend.</li>
	<li>Boncuk üç kez olduğu gibi adım 2.2 yıkama ve 50 µL/örnek 1xBrU-IP arabellekte resuspend.</li>
</ol>3. BrU etiketli RNA boncuk için bağlama
<ol><li>Ölçmek adım 1.3 RNA özler konsantrasyonlarda RNA ultraviyole görünür spectrophotometry kullanarak ve 40 µg RNA her örnekten RNase free H2O 200 µL toplam hacmiyle oranında seyreltin.</li>
	<li>RNA örnekleri için 2 dk 80 ° C'de RNA ve kısa bir süre içinde bir masa üstü santrifüj spin denatüre için ısı. BrU-IP + BSA/RNAse inhibitörü x 200 µL 2 ekleyin.</li>
	<li>50 µL resuspended ve adım 2.6 boncuk her örnek için hazırlanan ve 1 h. yıkama dört kez olduğu gibi adım 2.2 boncuk dönen bırakın ekleyin.</li>
</ol>4. elüsyon ve RNA 3 adımda fenol-fenol/kloroform-kloroform çıkarma tarafından arıtma
<ol><li>
RNA elute ve fenol ayıklama gerçekleştirmek
	<ol>
<li>Boncuk RNA elute için 200 µL elüsyon arabellek resuspend ve hızlı bir şekilde bundan sonra 200 µL fenol, pH 6,6 ekleyin (Uyarı: toksik, bkz: adım 4.1.2 aşağıdaki nota) herhangi bir sigara-RNA molekülleri örneğinden kaldırmak için.</li>
		<li>Tempo mix örnek ve spin 25.000 x g masa üstü bir santrifüj içinde de 3 dak. Not: Fenol toksik ve Cilt koruma giyen bir duman mahallede ele alınmalıdır. Hafif asidik pH sadece RNA ve DNA değil, ayıklanmış sağlar. RNA üst sulu faz ücretleri hidrofilik doğası gereği alanında bulunacaktır. Proteinlerin hidrofobik çekirdek fenol bağlamak ve alt organik fenol-faz için hareket.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Fenol kloroform ayıklama gerçekleştirmek
	<ol>
<li>Çok üst fazlı (200 µL deneyim işleme bağlı olarak yaklaşık 190 µL) olabildiğince Aspire edin ve bir tüp ile 200 µL fenol/kloroform, pH 6,6 için hareket (Uyarı: toksik, nota bakın). Aynı miktarda örnekler üzerindeki Aspire edin emin olun.</li>
		<li>Koşuşturma mix örnek ve spin için 25.000 x g de 3 dak. Not: Kloroform toksik ve Cilt koruma giyen bir duman mahallede ele alınmalıdır. Kloroform RNA aşağı akım analizi ters transkripsiyon14 ve Polimeraz zincir reaksiyonları15engelleyerek etkileyebilir fenol kaldırmak için eklenir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>(Şimdi yaklaşık 180 µL) önce sulu üst aşaması olarak aspirating tarafından kloroform ayıklama gerçekleştirmek ve 200 µL kloroform içeren bir tüp aktarın. Koşuşturma örnek mix ve 25.000 x g de 3 dk spin.</li>
	<li>(Şimdi yaklaşık 170 µL) önce sulu üst aşaması olarak Aspire edin ve 17 µL (1/10 cilt) 3 M CH3COONa, pH 6.0 içeren bir tüp transferi. Etkisiz hale getirmek ve RNA sulu çözüm çökelti RNA ile birlikte precipitates ve RNA Pelet daha görünür yapar 2 µL glikojen (20 mg/mL) ekleyin.</li>
	<li>Tuz iyonları ve RNA ile mix arasındaki tüp ters çevirme tarafından birkaç kez artırmak için 500 µL % 96 etanol ekleyin. -20 ° C veya 15dk adlı gecede tüp kuru buz üzerinde bırakın.</li>
	<li>Örneği 25.000 x g, pelet bozmadan 30 dk. atma süpernatant için 4 ° C'spin ve Pelet 185 µL % 75 etanol içinde herhangi bir kalıntı tuzu yıkamak. 25.000 x g, 5 min için 4 ° C de spin.</li>
	<li>Süpernatant atmak tamamen Pelet bozmadan ve Pelet açık bir kapak ile 5-10 dk kurumaya bırakın. 10 µL RNase free H2Pelet rahatsız edici önlemek için O tüp tarafında uygulanan resuspend.</li>
</ol>5. RNA analizi
<ol><li>CDNA cDNA ters transkripsiyon kullanarak hazırlamak ( Tablo malzemelerigörmek) kiti veya herhangi bir diğer tercih edilen yöntem 2 µL RNA örnek ve 1 µg Maya toplam RNA RNA (cDNA sonraki nesil sıralama için kullanılırsa kullanılmaz) cDNA sentezi tepki için taşıyıcı olarak. 1 µg RNA Maya RNA olmadan karşılık gelen bir girdi cDNA hazırlanması için kullanın.</li>
	<li>Seyreltik cDNA 1:25 ve 10 µL qPCR ile karışımı 9 µL seyreltilmiş cDNA Master mix ve 1 µL fluorogenic sonda, belirtilen her iki Malzeme tablo. Not: CDNA seyreltme cDNA hazırlık ve qPCR yöntemi kullanılan üzerinde bağlıdır.</li>
	<li>Aşağıdaki qPCR (Örneğin, 7500 hızlı gerçek zamanlı PCR sistemi veya eşdeğeri) çalıştırın: 2 min 50 ° c, 20 s 95 ° c, 3 40 döngüleri 95 ° C ile 30 s s 60 ° C'de</li>
</ol>

<ol><li>Kofoed, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polo-like+kinase+2+modulates+%CE%B1-synuclein+protein+levels+by+regulating+its+mRNA+production%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Dis%22%5BJournal%5D)">Polo-like kinase 2 modulates α-synuclein protein levels by regulating its mRNA production.</a> Neurobiol. Dis. 106, 49-62 (2017).</li>
<li>Imamachi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRIC-seq%3A+A+genome-wide+approach+for+determining+RNA+stability+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">BRIC-seq: A genome-wide approach for determining RNA stability in mammalian cells.</a> Methods. 67, 55-63 (2014).</li>
<li>Jacob, F., Monod, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+regulatory+mechanisms+in+the+synthesis+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins.</a> J. Mol. Biol. 3, 318-356 (1961).</li>
<li>Lee, T. I., Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+Regulation+and+its+Misregulation+in+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptional Regulation and its Misregulation in Disease.</a> Cell. 152, 1237-1251 (2014).</li>
<li>Farrer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+kindreds+with+parkinsonism+and+%CE%B1-synuclein+genomic+multiplications%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Comparison of kindreds with parkinsonism and α-synuclein genomic multiplications.</a> Ann. Neurol. 55, 174-179 (2004).</li>
<li>Khodr, C. E., Becerra, A., Han, Y., Bohn, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+alpha-synuclein+with+a+microRNA-embedded+silencing+vector+in+the+rat+substantia+nigra%3A+Positive+and+negative+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Targeting alpha-synuclein with a microRNA-embedded silencing vector in the rat substantia nigra: Positive and negative effects.</a> Brain Res. , 47-60 (2014).</li>
<li>Cooper, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+exosomal+siRNA+delivery+reduced+alpha-synuclein+aggregates+in+brains+of+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mov.+Disord%22%5BJournal%5D)">Systemic exosomal siRNA delivery reduced alpha-synuclein aggregates in brains of transgenic mice.</a> Mov. Disord. 29, 1476-1485 (2014).</li>
<li>Magdalan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alpha-Amanitin+induced+apoptosis+in+primary+cultured+dog+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Folia+Histochem.+Cytobiol%22%5BJournal%5D)">alpha-Amanitin induced apoptosis in primary cultured dog hepatocytes.</a> Folia Histochem. Cytobiol. 48, 58-62 (2010).</li>
<li>Lu, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actinomycin+D+inhibits+cell+proliferations+and+promotes+apoptosis+in+osteosarcoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Clin.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Actinomycin D inhibits cell proliferations and promotes apoptosis in osteosarcoma cells.</a> Int. J. Clin. Exp. Med. 8, 1904-1911 (2015).</li>
<li>Bensaude, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibiting+eukaryotic+transcription.+Which+compound+to+choose%3F+How+to+evaluate+its+activity%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Transcription%22%5BJournal%5D)">Inhibiting eukaryotic transcription. Which compound to choose? How to evaluate its activity?</a> Transcription. 2, 103-108 (2011).</li>
<li>Tani, H., et al. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/protocol/10.1007/978-1-4939-2253-6_19">Nuclear Bodies and Noncoding RNAs. Methods in Molecular Biology</a>. 1262, 305-320 (2015).</li>
<li>Meneni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Alkynyl-2%27-deoxyuridines%3A+chromatography-free+synthesis+and+cytotoxicity+evaluation+against+human+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">5-Alkynyl-2'-deoxyuridines: chromatography-free synthesis and cytotoxicity evaluation against human breast cancer cells.</a> Bioorg. Med. Chem. 15, 3082-3088 (2007).</li>
<li>Meola, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+Nuclear+Exosome+Decay+Pathway+for+Processed+Transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of a Nuclear Exosome Decay Pathway for Processed Transcripts.</a> Mol. Cell. 64, 520-533 (2016).</li>
<li>Zhao, B. S., Roundtree, I. A., He, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-transcriptional+gene+regulation+by+mRNA+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Post-transcriptional gene regulation by mRNA modifications.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 18, 31-42 (2016).</li>
<li>Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR+inhibitors+-+occurrence%2C+properties+and+removal%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">PCR inhibitors - occurrence, properties and removal.</a> J. Appl. Microbiol. 113, 1014-1026 (2012).</li>
<li>Paulsen, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Bru-Seq+and+BruChase-Seq+for+genome-wide+assessment+of+the+synthesis+and+stability+of+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Use of Bru-Seq and BruChase-Seq for genome-wide assessment of the synthesis and stability of RNA.</a> Methods. 67, 45-54 (2014).</li>
<li>Dölken, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+gene+expression+profiling+for+simultaneous+kinetic+parameter+analysis+of+RNA+synthesis+and+decay%5BTitle%5D)+AND+%22Rna%22%5BJournal%5D)">High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay.</a> Rna. , 1959-1972 (2008).</li>
<li>Raghavan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+mRNA+decay+in+resting+and+activated+primary+human+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of mRNA decay in resting and activated primary human T lymphocytes.</a> Nucleic Acids Res. 30, 5529-5538 (2002).</li>
<li>Sharova, L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Database+for+mRNA+half-life+of+19+977+genes+obtained+by+DNA+microarray+analysis+of+pluripotent+and+differentiating+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Res%22%5BJournal%5D)">Database for mRNA half-life of 19 977 genes obtained by DNA microarray analysis of pluripotent and differentiating mouse embryonic stem cells.</a> DNA Res. 16, 45-58 (2009).</li>
<li>Pandya-Jones, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Splicing+kinetics+and+transcript+release+from+the+chromatin+compartment+limit+the+rate+of+Lipid+A-induced+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Splicing kinetics and transcript release from the chromatin compartment limit the rate of Lipid A-induced gene expression.</a> RNA. 19, 811-827 (2013).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

RNA üretim, yeni etiketleme tarafından belirlenmesi için 1S BrU, ardından hemen RNA ayıklama ve immunoprecipitation BrU etiketli RNA'ın RNA üretilen için bu protokolü BrU-IP kullanımını açıklar. Bu yöntem daha önce başvuru16açıklandığı ve bu makale IP özgüllük ve RNA saflık, BrU yanı sıra bir fenol kloroform arıtma adıma düşük konsantrasyonları ile önceden tedavi boncuk artırmak için bazı ek adımlar içerir IP takip RNA saflık artırın. Ayrıca, biz de burada BrU-IP özgüllük BrU ve sigara-BrU yakalan...

5-Bromouridine (BrU) immunoprecipitation (IP) RNA üretim olmayan hücrelerde çalışma izin verir veya çok sınırlı etkisi Fizyoloji dönemi1,2etiketleme kısa sırasında hücre. Bu yöntem etiketli RNA anti-BrU antikorlar (şekil 1) kullanarak IP tarafından BrU yeni sentezlenmiş RNA içine takip sentetik üridin türev birleşme dayanır.
Yıllardır bu protein sentezi transcriptionally düzenlenmiş ve transkripsiyon faktörleri varlığını daha 50 yıl önce olan için bilinmektedir3. Günümüzde, birçok hastalıkları transkripsiyon ve RNA istikrar bozukluk tarafından neden olduğu bilinmektedir (ek şekil S1, başvuru4) ve yeteneği RNA üretim değişiklikleri ölçmek için anlayış hastalığında büyük önem taşıyor geliştirme.
Öte yandan, RNA üretim düzenlenmesi için çözümler çok az ya da çok fazla protein ifade veya Parkinson hastalığı (PD) gibi protein birikimi kaynaklanan hastalıkların tedavisi için yeni olanaklar sağlar. PD olarak çözünmez toplamları biriken baskın α-synuclein proteindir ve α-synuclein gen gen çarpma ailesel PD5nedenleri olarak α-synuclein düzeyini doğrudan hastalığa, bağlı. Ayrıca, α-synuclein bir konsantrasyon bağımlı şekilde toplar. α-synuclein mRNA düzeylerinin downregülasyon bu nedenle başarılı nöronal hücre kaybı PD kemirgen modelleri6,7azaltmak için RNA müdahale kullanarak elde edilmiştir ilginç bir tedavi stratejisi.
Bu hastalık ya da tedavi müdahaleler tarafından neden RNA üretim değişiklikleri ölçmek önemlidir. RNA, ölçüm kararlı duruma düzeyleri gibi nicel Polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR), tarafından takip ters transkripsiyon transkripsiyon düzenleme nedeni veya değişiklikleri ayırt yeteneğine sahip değildir için en modern yöntemleri değişmiş RNA istikrar. RNA çürüme oranları incelenmesi için yaygın olarak kullanılan bir yöntem α-amanitin veya actinomycin D çürüyen RNA'ların ölçümleri tarafından takip gibi bileşikler kullanarak transkripsiyon makine engelliyor. Ancak, transkripsiyon hücrelerde apoptoz8,9indüksiyon gibi genel bir tıkanması ile ilgili bazı sorunlar vardır. Sitotoksik etkileri, transkripsiyon inhibitörleri da hücresel alımını yavaş: α-amanitin ve actinomycin (referans10gözden) D özgüllüğü eksikliği gibi çeşitli teknik sorunlar mevcut.
Transkripsiyon genel tıkanması önlemek için nükleotid analogları, 5-ethynyl üridin (5-AB), 4-thiouridine (4-TU) ve kardeş gibi kullanılmaktadır. Bunlar kolayca memeli hücreleri tarafından alınır ve yeni sentezlenmiş RNA, darbe-etiketleme RNA'ın belirli bir zaman çerçevesinde etkinleştirme dahil. BrU seçim11,12tercih edilen analog yapmak 5-AB ve 4-TU, daha az toksik değildir.
BrU-IP RNA sentezi ve istikrar hem oranı araştırmak ve böylece toplam RNA değişimler nedenleri arasında ayırt etmek için kullanılabilir. Bu makalede RNA sentezi ölçüm üzerinde durulacak ve2 soruşturma RNA istikrar hakkında ayrıntılı bilgi için başvuru başvurur. RNA sentezi araştırmak için hücreleri kısa bir süre ile BrU örneğin 1s BrU-IP1 tarafından (şekil 1 c) ardından için etiketli. Bu ölçümler etiketleme kısa sürede sentezlenmiş RNA'ın sağlar ve gözlenen değişiklikleri düzenlemelerin daha iyi bir tahmin RNA sentezi içinde RT-qPCR tarafından toplam RNA değişiklikleri ölçerek verecektir. Bu, ancak, etiketleme zaman, örneğin, sadece 1 h, olsa bile bozulma hala gözlenen RNA düzeyleri üzerinde bir etkisi olabilir belirtilmelidir.
RNA BrU-IP deneyler üzerinden RT-qPCR1 veya sonraki nesil sıralama2,13tarafından aşağı akım analizi için uygundur. Kuzey kurutma veya ribonükleaz koruma yöntemi, gibi diğer standart RNA algılama yöntemleri de bazı RNA'lar için geçerli olabilir.

<table><tbody><tr><td>Ribolock Rnaz inhibitörü</td><td>ThermoFisher</td><td>EO0381</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads M-280 Koyun anti-fare IgG</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11202D</td><td></td></tr> <tr><td>ve alfa ; -Bromodeoksiüridin fare antikoru</td><td>BD Bioscience</td><td>555627</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 1000</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>Ultraviyole görünür spektrofotometri</td></tr><tr><td>Suya Doymuş Fenol pH 6.6</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9712</td><td></td></tr><tr><td>Fenol:Kloroform:IAA 25:24:1 pH 6.6</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9732</td><td></td></tr><tr><td>Yüksek Saf RNA İzolasyon Kiti</td><td>Roche</td><td>11828665001</td><td></td></tr><tr><td>Yüksek Kapasiteli cDNA Ters Transkripsiyon Kiti</td><td>ThermoFisher</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>Taqman Hızlı Gelişmiş Master Mix</td><td>ThermoFisher</td><td>4444557</td><td>qPCR Master Mix</td></tr><tr><td>Taqman RNA probları</td><td>ThermoFisher</td><td>SNCA: Hs01103383_m1, 18sRNA: Hs03928985_g1, ACTB: Hs01060665_g1, HMBS: Hs00609296, NADH: Hs01072843_m1</td><td>Florojenik problar</td></tr><tr><td>7500 Hızlı Gerçek Zamanlı PCR sistemi Hücre</td><td></td> hattı ATCC HEK293T Uygulamalı Biyosistemler <td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı</td><td>Lonza</td><td>BE12-604F</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td> Fetal buzağı serumu <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Biochrom</td><td>S0115</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin</td><td>Biochrom</td><td>A2213</td><td></td></tr><tr><td>Hank'in tamponu</td><td></td><td></td><td>5,3 mM KCl, 0.44 mM KH2PO4, 0.2 mM Na2HPO<>sub4 ve 136.8 mM NaCl pH 6.77, otoklavlanmış.</td></tr><tr><td>DEPC-H2O</td><td></td><td></td><td>%0.1 dietilpirokarbonat ile muamele edilmiş H2O</td></tr><tr><td>2xBrU-IP Tamponu</td><td></td><td></td> DEPC H2O 2xBrU-IP+BSA/RNAse inhibitöründe <td>40 mM Tris-HCl pH 7.5 ve 500 mM NaCl</td></tr>, <tr><td></td> 1 &mu ile desteklenmiş 2xBrU-IP tamponu;<td></td><td></td><td> g/&mu; L BSA ve 80 U / mL Ribolock</td></tr><tr><td>BrU-IP + 1 mg / mL heparin</td><td></td><td></td><td>2xBrU-IP tamponu 1: 1 DEPC-H <2 / sub>O seyreltilmiş ve 1mg / mL heparin</td></tr><tr><td>1xBrU-IP</td><td></td><td></td><td>2xBrU-IP tamponu ile desteklenmiş, DEPC-H2O'da 1: 1 oranında seyreltilmiş ve 0.5 & mu ile desteklenmiş; g/&mu; L BSA ve 20 U/mL Ribolock</td></tr><tr><td>Elüsyon tamponu</td><td></td><td></td>, <td>RNAz içermeyen H2O'da %0,1 SDS</td></tr></tbody></table>

rna sentezi 5-bromouridine etiketleme ve immunoprecipitation kullanarak incelenmesi

Investigation of RNA Synthesis Using 5-Bromouridine Labelling and Immunoprecipitation

Kararlı duruma RNA düzeyleri arasında iki koşulları karşılaştırıldığında, değişiklikleri değişiklikler üretim veya RNA bozulma nedeniyle olup olmadığını ayırt etmek mümkün değildir. Bu iletişim kuralı RNA üretim, 5-Bromouridine immunoprecipitation, soruşturma bir kısa süre içinde (örneğin, 1 h) sentezlenmiş RNA'ın sağlayan ardından RNA'ın etiketleme kullanarak ölçülmesi için bir yöntemi açıklar. 5-Bromouridine-etiketleme ve immunoprecipitation avantaj α-amanitin ve actinomycin D, gibi toksik transkripsiyon inhibitörleri kullanımı vardır yok veya çok düşük etkileri kısa süreli kullanım sırasında hücre canlılığı. Ancak, 5-Bromouridine-immunoprecipitation sadece kısa etiketleme süre içinde üretilen, yavaş yavaş üretilen gibi hızla bozulmuş RNA yakalar çünkü RNA bu yöntemle ölçmek zor olabilir. 5-Bromouridine-immunoprecipitation tarafından yakalanan 5 Bromouridine etiketli RNA ters transkripsiyon, nicel Polimeraz zincir reaksiyonu ve sonraki nesil sıralama tarafından çözümlenebilir. RNA her türlü incelenmiş ve için yöntem bu örnekte sunulan mRNA ölçme için sınırlı değildir.

AsPC-1 hücrelerde BrU-etiketi zaman bizim ilk testler yapıldı. Hücreler için 0, 1, 2 ve 4.5 h, ardından toplam RNA ayıklama ve BrU-IP BrU ile tedavi edildi. GAS5 ve GAPDH 1 h etiketleme için arka plan (0 h) GAPDH ve GAS5, için sırasıyla karşılaştırmalı bir yaklaşık 9 - ve 44 - kat değişiklik ulaşmak için yeterli olduğunu gösterdi BrU-IP RNA ölçüldü.
BrU-IP ve yukarıda açıklanan analiz değişiklikleri fark araştırmak için kullanıl...

Bu yöntem RNA sentezi ölçmek için kullanılabilir. 5-Bromouridine hücrelere eklendi ve sentezlenmiş RNA dahil. RNA sentezi 5 Bromouridine hedeflenmiş immunoprecipitation etiketli RNA ve analiz ters transkripsiyon ve nicel Polimeraz zincir reaksiyonu ardından hemen sonra etiketleme, RNA ayıklama ölçülür.

RNA sentezi 5-Bromouridine etiketleme ve Immunoprecipitation kullanarak incelenmesi

When steady state RNA levels are compared between two conditions, it is not possible to distinguish whether changes are caused by alterations in ...

Bu deneyin genel amacı, bromouridin etiketleme ve immünopresipitasyon yoluyla RNA sentezindeki değişiklikleri ölçmektir. Bu yöntem, RNA seviyelerindeki bir değişikliğin RNA sentezindeki değişikliklerden kaynaklanıp kaynaklanmadığını ölçerek RNA metabolizması alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, tercih edilen herhangi bir hücre kültürü türünde kullanılabilmesi ve kullanılan malzemelere kolayca erişilebilmesidir.Protokole başlamak için, 48 saat sonra ekstraksiyondan sonra toplam 40 mikrogramdan fazla RNA elde etmek için 10 mililitre büyüme ortamında 10 santimetrelik bir Petri kabında 3,5 kez 10 ila altıncı HEK293T hücresi tohumlayın. Tohumlamadan 37 saat sonra hücreleri 37 santigrat derece ve% 5 CO2.48'de tutun, sekiz mililitre büyüme ortamını aspire edin ve hücrelerin kurumasını önlemek için iki mililitre geride bırakın. Büyüme ortamına iki milimol bromouridin ve muamele ekleyin ve sekiz mililitre bromouridin içeren büyüme ortamını yeniden uygulamadan önce kalan iki mililitreyi hücrelerden çıkarın.Sonra, hücreleri bir saat inkübe edin. İnkübasyondan sonra, hücreleri beş mililitre Hank'in tamponunda yıkayın ve hücreleri beş dakika boyunca iki mililitre% 0.05 tripsin ile tripsine edin. Reaksiyonu durdurmak için sekiz mililitre büyüme ortamı ekleyin, hücreleri 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve hücreleri 1.000 kez g'de iki dakika döndürün.Daha sonra, süpernatanı çıkarın ve bir RNA izolasyon kiti kullanarak hücre peletinden toplam RNA'yı çıkarın ve RNA'yı RNaz içermeyen suda elüte edin. Bu teknik çok hassastır ve bu nedenle yüksek kalitede RNA ile çalışmak önemlidir. RNA ekstraksiyonu bu nedenle kritik bir adımdır, ancak günümüzün RNA ekstraksiyon kitleri ile de kolayca gerçekleştirilir.İncelenecek numune sayısı için boncukları bir partide hazırlayın, ayrıca pipetleme ve girdaplı karıştırma sırasında kaybı hesaba katmak için fazladan bir tane daha hazırlayın. Anti-Mouse IgG manyetik boncukları girdapla karıştırarak iyice yeniden askıya alın ve RNaz içermeyen 1,5 mililitrelik bir tüpte numune başına 20 mikrolitre boncuk çıkarın. Boncukların yan tarafta toplanması için 1,5 mililitrelik tüpü 20 saniye boyunca manyetik bir standa yerleştirin.Süpernatanı çıkarın, tüpü manyetik standdan çıkarın ve boncukları pipetleme ile 40 mikrolitre bir kez bromouridin-IP tamponunda yeniden süspanse edin. Tüpü bir masa üstü santrifüjde iki saniye döndürün, manyetik standa geri yerleştirin ve süpernatanı çıkarın. Daha sonra, heparin kullanarak boncuklara belirsiz bağlanmayı engelleyin.Boncukları bir mililitre bir kez bromouridin-IP artı mililitre heparin tamponu başına bir miligram olarak yeniden süspanse edin ve tüpü 30 dakika döndürün. Ardından boncukları bir kez yıkayın. Boncukları bir mililitre bir kez bromouridin-IP tamponunda yeniden süspanse edin ve anti-alfa-bromodeoksiüridin antikoru örneği başına 1.25 mikrogram ekleyin.Boncukları döndürürken bir saat inkübe edin. İnkübasyondan sonra boncukları üç kez yıkayın. Yıkanmış boncukları, bir milimolar bromouridin ile desteklenmiş bir kez bromouridin-IP tamponunun numune başına 50 mikrolitrede yeniden süspanse edin ve boncukları 30 dakika boyunca döndürmeye bırakın.Döndürmeden sonra, boncukları üç kez yıkayın ve boncukları bir kez bromouridin-IP tamponunun numunesi başına 50 mikrolitre içinde yeniden süspanse edin. Ultraviyole görünür spektrofotometri kullanarak RNA ekstraktlarındaki RNA konsantrasyonlarını ölçün ve her numuneden 40 mikrogram RNA'yı RNaz içermeyen suda toplam 200 mikrolitre hacme seyreltin. RNA'yı 80 santigrat derecede iki dakika boyunca denatüre ettikten sonra, örnekleri bir masa üstü santrifüjde kısa bir süre döndürün.Döndürme işleminden sonra, 200 mikrolitre iki kez bromouridin-IP artı BSA, RNase inhibitörü ekleyin. Ardından, her numuneye 50 mikrolitre yeniden askıya alınmış ve hazırlanmış boncuklar ekleyin ve numuneleri bir saat boyunca döndürün. İnkübasyondan sonra boncukları dört kez yıkayın.RNA'yı elüte etmek için boncukları 200 mikrolitre elüsyon tamponunda yeniden süspanse edin ve numuneden RNA olmayan molekülleri çıkarmak için hızlı bir şekilde 200 mikrolitre pH 6.6 fenol ekleyin. Karıştırmak için numuneyi döndürün ve bir masa üstü santrifüjde 25.000 kez g'de üç dakika döndürün. Daha sonra, mümkün olduğu kadar üst fazı, yaklaşık 190 mikrolitre aspire edin ve 200 mikrolitre pH 6.6 fenol-kloroform içeren bir tüpe taşıyın.Numuneler arasında aynı miktarı aspire ettiğinizden emin olun. Numuneyi döndürün ve döndürün. Sıkma işleminden sonra, yaklaşık 180 mikrolitre olan sulu üst fazı aspire ederek kloroform ekstraksiyonu yapın ve 200 mikrolitre kloroform içeren bir tüpe aktarın.Numuneyi döndürün ve ardından döndürün. Sulu üst fazı, yaklaşık 170 mikrolitreyi aspire edin ve RNA'yı sulu çözeltiden nötralize etmek ve çökeltmek için 17 mikrolitre üç molar pH altı sodyum asetat içeren bir tüpe aktarın. Ardından, RNA ile çökelecek ve peleti daha görünür hale getirecek iki mikrolitre glikojen ekleyin.Tuz iyonları ve RNA arasındaki bağlanmayı artırmak için 500 mikrolitre %96 etanol ekleyin ve tüpü birkaç kez ters çevirerek karıştırın. Tüpü gece boyunca eksi 20 santigrat derecede veya kuru buz üzerinde 15 dakika bekletin. Soğutulmuş numuneyi döndürün, peleti bozmadan süpernatanı atın ve kalan tuzu gidermek için peleti 185 mikrolitre %75 etanol içinde yıkayın.Ardından, numuneyi beş dakika boyunca dört santigrat derecede 25.000 kez g'de döndürün. Peleti bozmadan süpernatanı tamamen atın ve peleti kapak açıkken beş ila 10 dakika kurumaya bırakın. Peletin bozulmasını önlemek için peleti tüpün yan tarafına uygulanan 10 mikrolitre RNaz içermeyen suda yeniden süspanse edin.AsPC-1 hücreleri sıfır, bir, iki ve 4.5 saat boyunca bromouridin ile muamele edildi, ardından toplam RNA ekstraksiyonu ve bromouridin-IP izledi. GAS5 ve GAPDH, bromouridin-IP RNA'da ölçüldü, bu da bir saatlik etiketlemenin arka plana kıyasla dokuz ve 44 kat değişime ulaşmak için yeterli olduğunu gösterdi. İki milimol bromouridin tedavisi, HEK293T hücrelerinde bir saat veya daha uzun dört saatlik tedavi boyunca herhangi bir morfolojik değişikliğe neden olmadı.PLK-2 inhibisyonu, hem girdide hem de bromouridin-IP'de alfa-sinüklein mRNA'sında bir artışa neden oldu, bu da kararlı durum RNA'sındaki artışın RNA sentezindeki bir artıştan kaynaklandığını düşündürdü. Bu videoyu izledikten sonra, yeni sentezlenen RNA'yı bromouridin ile nasıl etiketleyeceğinizi ve ardından bromouridin ve etiketli RNA'nın immünopresipitasyonunu nasıl gerçekleştireceğinizi iyi anlamış olmalısınız.

investigation-rna-synthesis-using-5-bromouridine-labelling

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Pre-mRNA geçici doğası nedeniyle, izole etmek ve incelemek için zor...

İnsan pre-mRNA üzerinde Haritalama Ribonucleoproteins Hızlı Yüksek verim için Yöntemi (RNPs)

RNA transkript trans etkili RNA bağlayıcı proteinler (RBPs) çok sayıda aracılığı ile geniş posttranskripsiyonel düzenlemeye tabidir. Burada hassas ve transcriptome geniş bir ölçekte RBPs, RNA bağlayıcı siteleri tanımlamak için genellenememektedir bir yöntem mevcut.

PAR-Klip - RNA Cilt Proteinler Transcriptome geniş Cilt Siteleri Belirlemek Amacıyla Bir Yöntem

Bu video, mRNA'daki adenilat-üridilat açısından zengin element (ARE) dizileri ile etkileşime giren RNA bağlayıcı proteinleri (RBP'ler) tanımlamak için bir in vitro RNA aşağı çekme testini göstermektedir. Bir hücre lizatından gelen hedef RBP'ler, RNA-protein kompleksleri oluşturmak için bir RNA probu ile karıştırılır. Kompleksler, RNA probunun destiyobiyotin etiketinin streptavidin etiketli bir manyetik boncuğa afinitesi kullanılarak afinite saflaştırması yoluyla izole edilir.

Afinite Ekstraksiyonu Yoluyla RNA Bağlayıcı Proteinleri İzole Etmek için RNA-Protein Pull-Down Testi

Toplam hücresel RNA, kısa vadeli RNA sentezi ve çürüme değişikliklerin yanı sıra, RNA işleme kinetiğini incelemek için kötü bir şablon sağlar. Burada, 4-thiouridine ile yeni kopyalanan RNA metabolik etiketlenmesi tarif, bu sınırlılıkların üstesinden gelmek için izin veren yeni transkripsiyonu RNA tiyol-spesifik bir biotinilasyon ve saflaştırma takip etti.

Hücre Kültürü RNA sentezi, İşleme ve Çürüme Yüksek Çözünürlük Gen İfadesi Profil için Yeni Transkripsiyonu RNA Metabolik Etiketleme

Bu görüntüleme kullanılarak hipoksi küresel RNA sentez analizi için bir tekniği açıklar. RNA tıklayın-kimya etiketleme önceden hipoksi altında gerçekleştirilen ve tek hücre düzeyinde küresel RNA değişikliklerin görselleştirme sağlar olmamıştır. Bu yaklaşım, küresel RNA sentezinde hücreden hücreye değişiklik doğrudan görselleştirme sağlayan, mevcut ortalama RNA tekniklerinin tamamlar.

Ününüz Aşağıdaki Tek Hücre Düzeyinde Küresel RNA Sentezi Analizi

Tomurcuklanan mayada ipliğe özgü transkripsiyon run-on (TRO) yaklaşımı ile BrUTP kullanarak in vivo RNA polimeraz II tarafından transkripsiyonun sonlandırılmasının analizi için temel bir deneysel yaklaşımı açıklıyoruz. Bu protokol, hem mayada hem de daha yüksek ökaryotlarda diğer RNA polimerazlar tarafından transkripsiyon sonlandırmasını incelemek için genişletilebilir.

BrUTP iplikli özgü Transkripsiyon Run-on (TRO) Yaklaşımı ile Transkripsiyon Feshi Analizi

Bu iletişim kuralı ChIP-seq, 4sU seq, toplam RNA-seq ve hücre satırları ve Primer hücre için profil oluşturma ribozom Kombinatorik kullanımını açıklar. Transkripsiyon faktörü de novo transkripsiyon, RNA işlenmesi, ciro ve çeviri zamanla, bağlama ve olayların genel gidişatı harekete geçirmek ve/veya hızla değişen hücrelerde görüntüleme izleme değişiklikleri sağlar.

Gerçek zamanlı analiz bağlama, transkripsiyon, çeviri ve ciro hücresel etkinleştirme sırasında küresel olayları görüntülemek üzere transkripsiyon faktörü

Burada açıklanan protokolü yeni sentezlenmiş mRNA 4-thiouracil ile etiketli Maya hücrelerinden saf genom çapında miktar temel alır. Bu yöntem mRNA decay edilişi mRNA sentezi ölçmek için sağlar ve böylece, RNA polimeraz II transkripsiyon doğru bir ölçüm sağlar.

Saccharomyces cerevisiae Metabolik 4-thiouracil ve bir miktar ile etiketleme yeni mRNA RNA polimeraz II etkinlik için bir Proxy olarak sentezlenmiş

Ribonucleotides genom ökaryotik nükleer DNA ikileşmesi sırasında dahil en bol kanonik olmayan nükleotit arasındadır. Düzgün kaldırdıysanız, ribonucleotides DNA hasarı ve mutagenesis neden olabilir. Burada, ribonucleotide birleşme DNA ve mutajenik etkileri içine bolluk değerlendirmek için kullanılan iki deneysel yaklaşımlar mevcut.

Eğitim Ribonucleotide ortaklık: Strand-özel hafiye-in Ribonucleotides Maya genom ve Ribonucleotide kaynaklı Mutagenesis ölçme

Hassas ve özellikle maya Saccharomyces cerevisiaeyeni transkripsiyonu RNA arındırmak için tiolated urasil kullanımı .

RNA In Vivo'nun 4-Thiouracil (Ers4tU) ile Son Derece Hızlı ve Spesifik Metabolik Etiketlemesi

Metillenmiş RNA immün önksepitasyon testi, metillenmiş RNA parçaları için zenginleştirmek için kullanılan antikor bazlı bir yöntemdir. Derin sıralama ile birleştiğinde, m5C modifikasyonlarını taşıyan transkriptlerin tanımlanmasına yol açar.

Arabidopsis'te m5C Modifikasyonu Çalışmak için Metillenmiş RNA İmmün Prempripitasyon Tahlil

Öğrenin bromouridin etiketleme ve immunoprecipitation yöntemiyle RNA sentezi değişikliklerini ölçmeyi. Bu teknik, RNA metabolizması dinamiklerini incelemek ve sentez hızlarındaki değişimleri belirlemek için kullanılır.

RNA sentezi 5-Bromouridine etiketleme ve Immunoprecipitation kullanarak incelenmesi

Daha fazla video keşfet