Escherichia Coli proteinler Site-Specifically oluşturmak için Facile iletişim kuralı Acetylated

Bu çalışmada, ekspresyon konakçısı olarak E.coli kullanarak belirli bölgelerde homojen olarak asetillenmiş proteinler üretmek için kolay bir protokol göstereceğiz. Proteinlerin geri dönüşümlü lizin asetilasyonu, doğada en bol bulunan translasyon sonrası modifikasyonlardan biridir. Gen transkripsiyonu, stres tepkisi, hücresel farklılaşma ve metabolizma dahil olmak üzere çok çeşitli biyolojik süreçlerde önemli roller oynar.

Tasarım pozisyonlarında tamamen asetillenmiş proteinler üretmek, protein asetilasyonunu incelemek için çok yararlıdır. Ancak, çoğu klasik yöntem için zordur. Bu zorluk, genetik kod genişletme tekniği ile çözülmüştür.

tRNA-Pyl'i asetillisin ile şarj etmek için tasarlanmış bir pirolisil-tRNA sentetaz varyantı kullanır, daha sonra mRNA'daki UAG durdurma kodonunu bastırmak için konak translasyon makinesini kullanır ve hedef proteinin tasarım konumuna asetillisin dahil edilmesini yönlendirir. İlk olarak, kehribar durdurma kodonunun, bölgeye yönelik mutajenez ile hedef gendeki karşılık gelen konuma sokulması gerekir. Yabani tip proteinlerin genini içeren şablon plazmidi amplifiye edin ve PCR reaksiyonu ile primerlerden durdurma kodon mutasyonunu ekleyin.

PCR'den sonra, amplifiye edilmiş materyal, daireselleştirme ve şablonun çıkarılması için oda sıcaklığında bir saat boyunca doğrudan kinaz-ligaz-Dpn1 enzim karışımına eklenir. Karışımın beş mikrolitresini 25 mikrolitre çözülmüş yetkin E.coli hücrelerinin tüpüne ekleyin. Karıştırmak için tüpü dikkatlice hafifçe vurun ve karışımı 30 dakika boyunca buzun üzerine koyun.

Karışımı 42 santigrat derecede 30 saniye boyunca ısı şoku uygulayın ve beş dakika daha buzun üzerine koyun. Karışıma 600 mikrolitre oda sıcaklığında SOC ortamı pipetleyin. 37 santigrat derecede 60 dakika çalkalayarak inkübe edin.

İlgili antibiyotikle tabağa 100 mikrolitre yayın ve gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Tek koloniden alınan plazmit dizileme için gönderilir. İkinci adım, bölgeye özgü asetillenmiş proteini eksprese etmek ve saflaştırmaktır.

Mutasyona uğramış TAG içeren hedef geni ve asetillisin dahil sistemini içeren plakadan tek bir koloni alın. 37 santigrat derecede gece boyunca karşılık gelen antibiyotiklerle 15 mililitre taze LB ortamına aşılayın. 15 mililitrelik gece kültürünü antibiyotikli 300 mililitre taze LB ortamına aktarın ve 37 santigrat derecede inkübe edin.

Absorbans 600 nanometrede 5'e ulaştığında büyüme ortamındaki son konsantrasyonlar olarak beş milimolar asetillisin ve 20 milimolar nikotinamid ekleyin. Hücreleri 37 santigrat derecede bir saat daha büyütün. Daha sonra protein ekspresyonu için indükleyiciyi ekleyin ve hücreleri gece boyunca 25 santigrat derecede büyütün.

15 dakika boyunca 3.000 g'da santrifüjleyerek hücreleri toplayın. Süpernatanı atın ve hücre peletlerini eksi 80 derecede saklayın. Donmuş hücre peletlerini buz üzerinde çözdürün ve 15 mililitre lizis tamponu, beş mikrolitre beta-merkaptoetanol ve bir mikrolitre nükleaz ile yeniden süspanse edin.

Hücreler sonikasyon ile kırılır. Ham ekstraktı 20.000 g'da dört derecede 25 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı 45 mikrometre membran filtre ile filtreleyin.

Filtrelenmiş numuneyi, 20 mililitre lizis tamponu ile dengelenmiş bir mililitre nikel NTA reçinesi içeren bir kolona yükleyin. Sütunu 20 mililitre yıkama tamponu ile yıkayın. Hedef protein, iki mililitre elüsyon tamponu ile atlatılır.

Saflaştırılmış protein, 2,5 mililitre numune eklenerek PD-10 kolonu tarafından tuzdan arındırılır ve tuzdan arındırılmış numuneyi 3,5 mililitre tuz giderme tamponu ile toplar. Bir sonraki adım, saflaştırılmış asetillenmiş proteini biyokimyasal olarak karakterize etmektir. SDS numune tamponu ile proteinleri beş dakika boyunca 100 derecenin üzerinde denatüre edin.

Karışımı santrifüjleyin, SDS-PAGE jele yükleyin ve 30 dakika boyunca 200 voltta çalıştırın. Jeli damıtılmış suyla yıkayın ve hafifçe çalkalayın. Sandviçi batı lekeleme için yapmak için, katottan anoda sünger, filtre kağıdı, transfer tamponu, ıslatılmış SDS-PAGE jeli, metanol ile aktive edilmiş PVDF membranı, başka bir filtre kağıdı, sandviçteki kabarcıkları çıkarın ve başka bir sünger.

Yığını transfer tankına koyun. 45 dakika boyunca 350 miliamperlik sabit bir akımda çalıştırın. PVDF membranını 25 mililitre TBST tamponu ile hafifçe çalkalayarak beş dakika boyunca yıkayın.

Membranı %5 BSA ve TBST tamponu ile oda sıcaklığında bir saat bloke edin. Membranı seyreltilmiş HRP konjuge asetillisin antikoru ile oda sıcaklığında gece boyunca bir saat veya dört derece boyunca hafifçe çalkalayarak inkübe edin. Membranı 20 mililitre TBST tamponu ile hafifçe çalkalayarak beş dakika boyunca yıkayın.

Bu adımı dört kez tekrarlayın. Kemilüminesans substratını zara bir dakika boyunca uygulayın. Sinyali bir CCD kamera tabanlı görüntüleyici ile yakalayın.

Aynı hacimlerde elüsyon fraksiyonları ve protein saflaştırması SDS-PAGE jeline yüklendi. Asetillenmiş proteinin verimi, yüksek verimli olan vahşi tip proteinin yaklaşık yarısıdır ve asetillisin ve büyüme ortamı içermeyen aynı ekspresyon suşu, tespit edilebilir miktarda protein üretemez, bu da asetillenmiş proteinin yüksek saflığını gösterir, çünkü bu spesifik pozisyonda kanonik amino asitler dahil edilmiştir. Western blotlama, vahşi tip proteinde tespit edilebilir bir asetilasyon olmadığını gösterdi, bu da bu ekspresyon sisteminin spesifik olmayan asetilasyonunun düşük arka planını gösterirken, asetillenmiş proteinin net bir bandı vardı.

Tandem kütle spektrometresi, asetilasyonun, gendeki karşılık gelen konumu durdurma kodonuna mutasyona uğramış olan doğru bölgede meydana geldiğini doğruladı. Asetillenmiş proteinlerin iyi verimini ve saflığını elde etmek için, hem yüksek verimlilik hem de yüksek saflık için optimize edilmiş asetillisin dahil sistemi kullanılmalıdır. BL21 (DE3) hücreleri, saflığı artırmak için düşük arka plan ve spesifik olmayan asetilasyon için kullanılmalıdır.

Genetik birleştirme sistemi, ökaryotik sistemlerde daha geniş uygulamalar için kullanılabilir.