Sıtma enfeksiyon sırasında hücre dışı vezikül ile değerlendirilmesi

Bu çalışmada, enfekte Plasmodium falciparum eritrositler tarafından yayımlanan ekstraselüler veziküller (EVs) rolünü araştırmak için iletişim kurallarını açıklar. Özellikle, endotel hücreleri ile EVs etkileşimleri odaklanmak.

Bu prosedürün genel amacı, Sıtma paraziti ile enfekte olmuş kırmızı kan hücreleri tarafından salınan hücre dışı veziküllerin işlevini araştırmaktır. Bu yöntem, parazitlerin parazit-konak iletişimini nasıl düzenlediği gibi Sıtma alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, indoterot hücreleri tarafından veziküler RNA'nın düzenleyici fonksiyonunun incelenen indoterot hücreleri tarafından veziküler arbitajın görselleştirilmesidir.

Prosedürü gösteren, laboratuvarımdaki tüm yüksek lisans öğrencileri olan Mya Alondez, Smartin Bagu ve Bayo Babatunde olacak. Bir mikro santrifüj tüpünde 100 mikrogram hücre dışı vezikül ve bir mililitre fosfat tamponlu salin ekleyin. Daha sonra, hücre dışı vezikülleri bir pelet oluşturmak için yedi dakika boyunca maksimum 20.000 kez g hızında santrifüjleyin.

Santrifüjleme bittiğinde, peleti rahatsız etmeden süpernatanı atın. Daha sonra hücre dışı vezikül peletini 100 mikrolitre dilümatta çözün C.To tam karıştırmayı sağlayın, birkaç kez pipetleyin. Daha sonra, yeni bir mikro santrifüj tüpünde, 100 mikrolitre dilmant C'ye dört mikrolitre PKH67 etanolik boya çözeltisi ekleyin.

Boyama işleminden hemen önce 40 mikromolar 2XPKH67 boya solüsyonunu hazırlayın. Daha sonra 100 mikrolitre iki x hücre dışı veziküler süspansiyonu eşit hacimde PKH67 etanolik boya çözeltisi ile hızlı bir şekilde birleştirin. Daha sonra uygun karışımı sağlamak için karışımı 10 kez pipetleyin.

Tamamen karıştırdıktan sonra, hücre dışı veziküler ve PKH67 etanolik boya çözeltisini ışıktan uzakta beş dakika inkübe edin. Kuluçka sırasında, karışımı üç ila dört kez girdaplamaya devam edin. Lekelenme reaksiyonunu durdurmak için, karışıma 200 mikrolitre serum ekleyin ve fazla boyanın bağlanması için bir dakika inkübe edin.

Daha sonra, hücre dışı vezikülleri fosfat tamponlu tuzlu su ile üç kez yıkayın. Yıkadıktan sonra, numuneyi beş dakika boyunca 20.000 kez g'de santrifüjleyin. Daha sonra, mikrolitre başına bir mikrogramlık bir nihai konsantrasyon elde etmek için hücre dışı veziküler peleti 100 mikrolitre fosfat tamponlu salin içinde çözün.

Endotel hücrelerini bir mililitre tam endotel hücresi büyüme ortamında poli-ilten kaplı bir örtü astarına aktarın. Hücrelerin kapak kızağı üzerinde tek bir tabaka oluşturmasına izin verin. Tek tabaka oluşturulduktan sonra, ortamı dikkatlice çıkarın ve hücreleri iki kez yıkamak için bir mililitre taze ortam ekleyin.

Daha sonra kapak kaymasına 50 mikrogram PKH67 lekeli hücre dışı vezikül ekleyin ve dört saat inkübe edin. İnkübasyondan sonra, ortamı aspire edin. Tüm bağlanmamış hücre dışı vezikülleri çıkarmak için, hücreleri üç kez fosfat tamponlu tuzlu su ile yıkayın.

Lekelenme sırasında, hücre kaybını ve örtü kaymasının kırılmasını önlemek için ince maşa kullanılarak örtü astarlarının manipülasyonu sırasında çok dikkatli olunmalıdır. Yıkadıktan sonra, hücreleri 15 dakika boyunca sabitlemek için fosfat tamponlu tuzlu su içinde paraformaldehit çözeltisinin yüzde üçünü kullanın. Yine, hücreleri fosfat tamponlu tuzlu su ile üç kez yıkayın ve hücreleri geçirgen hale getirmek ve oda sıcaklığında beş dakika inkübe etmek için fosfat tamponlu salin içine 250 mikrolitre yüzde 0.1 tritan x 100 ekleyin.

Daha sonra, hücreleri fosfat tamponlu tuzlu su ile üç kez yıkayın ve hücrelere 400 mikrolitre bloke edici tampon ekleyin. Daha sonra, spesifik olmayan bağlanmayı önlemek için hücreleri oda sıcaklığında otuz dakika inkübe edin. Bloke ettikten sonra, hücreleri bir kez fosfat tamponlu tuzlu su ile yıkayın.

Daha sonra, her bir örtü kayması için boyama solüsyonunu hazırlamak için 200 mikrolitre fosfat tamponlu salin içinde beş mikrolitre phalloiden stok çözeltisini yüzde bir sığır serum albümini ile seyreltin. Daha sonra kapak kızağına 200 mikrolitre boyama solüsyonu ekleyin ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. İnkübasyon bittiğinde, hücreleri üç kez fosfat tamponlu tuzlu su ile yıkayın.

Daha sonra, DNA'yı 30 saniye boyunca lekelemek için 200 mikrolitre fosfat tamponlu salin içinde mililitre kancalı 3342 başına iki mikrogramlık son konsantrasyonu kullanın. Boyamadan sonra, kapak fişini iki kez yıkamak için 400 mikrolitre fosfat tamponlu salin ekleyin. Daha sonra kapak fişini forseps yardımıyla dikkatlice kaldırın ve bir cam slayt üzerindeki bir damla antifade montaj ortamının üstüne ters çevirin.

Fazla ortamı nazikçe çıkarmak için bir mendil kullanın ve ardından çevresini oje ile kapatın. Hücre ağartımını önlemek için mikroskopi sırasında hücrelerin çok fazla boyaya maruz kalmamasına da büyük özen gösterilmelidir. 0.4 mikromolar dökme boyutuna sahip 24 oyuklu bir doku kültürü ekinde, endotel hücrelerini tohumlayın.

Daha sonra, farklılaşmış bir tek tabaka oluşturmak için hücrelerin rahatsız edilmeden beş gün boyunca kültürde büyümesine izin verin. Ortamı her iki günde bir değiştirmeye devam edin. Tek tabaka oluştuktan sonra, üst haznede bir mililitre hücre dışı vezikül içinde 50 mikrogram tohumlayın.

Daha sonra üst kuyucuğa mililitre başına 20 miligram rotomin dekstran ekleyin ve yüzde beş karbondioksit ile 37 santigrat derecede inkübe edin. 40 mikrolitre orta avokattan floresan misyonunu ölçerek floresan dekstranın kuyu dibine göçünü izleyin. Ardından, çok etiketli bir mikro plaka okuyucu için uyarma dalga boyunu 544 nanometrede ve emisyon dalga boyunu 590 nanometrede programlayın.

Hücre sayısını saymak için bir hemositometre kullanın. Daha sonra endotel hücrelerini tam endotel kültür ortamında yeniden askıya alın ve hücreleri 100 mikrolitre endotel hücre büyüme ortamında 96 oyuklu bir plakada tohumlayın. Mililitre başına 0.1 ila on mikrogram konsantrasyon elde etmek için, 100 mikrolitre antibiyotik içeren ortam ekleyin.

Işık mikroskobu altında 20 kat objektif kullanarak hücrelerin canlılığını her iki günde bir izleyin. Hücreleri 10 ila 14 gün daha kültürlemeye devam edin ve hücre büyümesine bağlı olarak antibiyotik içeren ortamı her iki ila üç günde bir değiştirin. Daha sonra, her bir oyuğa 10 mikrolitre MTS reaktifi ekleyin ve reaktifi karıştırın.

96 oyuklu plakayı dört saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Dört saat sonra, plakayı bir çalkalayıcı üzerinde kısa bir süre çalkalayın. Daha sonra, 490 nanometrede bir plaka okuyucu kullanarak işlenmiş ve işlenmemiş hücrelerin emicilerini okuyun.

Lentiviral transdüksiyondan bir gün önce, endotel hücrelerini bir mililitre tam ortamda tohumlayın. Hücrelerin lentiviral transdüksiyon için yüzde 50 ila 80 birleşmeye ulaşmasını bekleyin Tüpü açmadan önce, dökülmeyi önlemek için lentiviral süspansiyonu 30 saniye boyunca 200 kez g'de döndürün. Daha sonra, mililitre başına sekiz mikrogramlık bir nihai konsantrasyona ayarlamak için hücrelere heksidimetrin bromür ekleyin ve plakayı hafifçe döndürün.

Lentivirüsü hücrelere ekleyin ve uygun karışımı sağlamak için plakayı 30 saniye boyunca hafifçe döndürün. Lentiviral transdüksiyon verimliliğini artırmak için, hücre-viral karışımını oda sıcaklığında 45 dakika boyunca 300 kez g'de santrifüjleyin. Daha sonra hücre-virüs karışımını gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Ertesi gün, viral partikül içeren ortamı atın ve önceden ısıtılmış, taze, tam kültür ortamı ile değiştirin. İkinci gün puromisin seçimine başlayın. Tam kültür ortamını puromisin içeren ortamla değiştirin.

Puromisin seçiminden sonra hücreleri hasat edin. Üreticinin talimatlarına göre, bir RNA izolasyon kiti kullanarak RNA'yı hücrelerden izole edin. Seçilen mikro-RNA'lar ile tamamlayıcı DNA'yı izole etmek için bir ters transkripsiyon kiti kullanın.

Ardından kantitatif PCR reaksiyonunu ayarlayın. Hücre dışı veziküllerin endotel hücreleri tarafından içselleştirilmesini izlemek için, PKH67 işaretli yeşil veziküller konfokal mikroskopi kullanılarak analiz edildi. Tahlilde, endotel hücrelerinin içindeki veziküllerin translokasyonunu izlemek için sırasıyla kırmızı ve nükleid mavisi renkte hareket eden faloudine ve hookst 33342 kullanılır.

Elde edilen konfokal görüntüler, dört saat sonra veziküllerin endotel hücreleri tarafından hazır alımını göstermektedir. Daha sonra, rodamin b izothyosionadedekstran'ın endotel hücresi monotabaka difüzyon kabiliyetinin geçirgenliğini incelemek için analiz edildi. Bu test, endotel hücrelerinin mililitre hücre dışı veziküller başına 50 ve 100 mikrogram ile inkübe edilmesinin, iki saat sonra endotelyal tek tabaka geçirgenliğini arttırdığını göstermektedir.

Grafikte, x ekseni hücre dışı veziküllerin konsantrasyonunu temsil eder ve y ekseni 590 nanometrede okunan endotel geçirgenliğindeki kıvrım değişikliklerini temsil eder. Daha sonra, puromisin tedavisi ile endotel hücrelerinin duyarlılığını belirlemek için bir öldürme eğrisi çizildi. Öldürme eğrisi, tüm hücreleri öldürmek için mililitre puromisin başına 0.15 mikrogram kadar az olduğunu gösterir.

Ayrıca, endotel hücrelerinden izole edilen mikro-RNA451a'nın ekspresyon seviyesini belirlemek için gerçek zamanlı kantitatif PCR yapıldı. Çubuk grafikleri, temizlikçi geni U6'ya karşı mikro-RNA451a transkriptinin önemli ölçüde aşırı ekspresyonunu göstermektedir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, bulaşıcı hastalıklar alanındaki araştırmacıların, genetik materyalin transferi yoluyla EV'lerin konak etkileşimi ve hücresel iletişimdeki rolünü keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, alıcı hücreler tarafından EV alımının nasıl görselleştirileceğini ve endotel hücrelerinin düzenlenmesinde RNA işlevi de dahil olmak üzere küçük hücrelerin nasıl araştırılacağını iyi anlamış olmalısınız.

Sıtma parazitleri ve insan kanı ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü uygularken eldiven, laboratuvar önlüğü giymek ve steril bir başlık altında çalışmak gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.