Name: Sıtma enfeksiyon sırasında hücre dışı vezikül ile değerlendirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-14T14:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 45 s
Description: Keşfedin sıtma enfeksiyonunda Plasmodium falciparum enfekte eritrositlerden salınan hücre dışı veziküllerin endotelyal hücrelerle etkileşimini. Bu yöntem parazit-konakçı iletişim mekanizmalarını anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışmada mali kısmen tıbbi ve biyolojik araştırma (PYM için) Gottfried ve Julia Bangerter-Rhyner-Stiftung (için MW ve PYM) ve araştırma havuzu Fribourg Üniversitesi (PYM için) Novartis Vakfı tarafından desteklenmiştir. Ek hibe İsviçre hükümetinin mükemmellik burs (için KAFİLE ve SM) yabancı bilim adamları için içerir. Isabelle Fellay ve Solange Kharoubi Hess teknik destek için teşekkür ederiz.

İnsan RBCs Swissethics (swissethics.ch) yönergeleri doğrultusunda sağlıklı bağış kan elde.
Not: P. falciparum parazit kültür (3D 7) ve EV üretim daha önce Mbagwu tarif edildi ve ark. 11 P. falciparum insan bir patojen olduğundan, işleme için yerel düzenlemelere bakın. Kültürler tüm steril tutulmalıdır zaman.
1. Floresans EVs etiketleme
Not: Aşağıdaki yordam, stabil bir yeşil flüoresan boya (PKH67) dahil etmek için etiketleme teknolojisi EV membran lipid bölgesinin büyük Alifatik kuyruklu yararlanır. Reaksiyon 200 µL PKH67 20 µM son konsantrasyon içeren birim boyama son gerçekleştirilir. Tüm adımları izleyerek, ortam sıcaklığında (20-25 ° C)
<ol><li>PBS 1 ml microcentrifuge tüp içinde yer 100 µg EVs.</li>
	<li>Cips için EVs 7 min için maksimum hızda (20.000 x g) bir microcentrifuge tüp santrifüj kapasitesi. Not: hemozoini EVs içinde mevcut olduğu için kırmızı-koyu kahverengi Pelet dikkat edilmelidir. EVs lysed ise o zaman süpernatant kırmızımsı.</li>
	<li>Santrifüjü sonra süpernatant dikkatli bir şekilde, herhangi bir EVs kaldırma önlemek için Aspire edin. Not: kalan arabellek EVs Dilüent C'de tekrarlanabilirlik ve boyama verimliliği artırmak için resuspending önce mevcut miktarını en aza indirmek.</li>
	<li>EV Pelet Dilüent C 100 µL içinde resuspend (2 X EV süspansiyon) ve yavaşça damlalıklı tam dağılım sigorta için.</li>
	<li>Yeni bir microcentrifuge tüp hazırlayın ve PKH67 ethanolic boya çözüm 4 µL karıştırmak için seyreltici C. girdap iyi 100 µL için ekleyin. Hemen boyama önce bu 2 x boya çözüm (40 µM) hazırlayın. Not: heterojen boyama önlemek için PKH67 ethanolic boya çözüm doğrudan EV Pelet eklemeyin.</li>
	<li>Hızla, 2 EV süspansiyon (Adım 1.4) X 100 µL 2 boya çözüm (Adım 1.5) X 100 µL ile birleştirir. Sonra aşağı yukarı 10 kez pipetting tarafından örnek karıştırın.</li>
	<li>Işık ve mix 3 - 4 kez 5 dk kuluçka sırasında vortexing tarafından korunan EV/boya süspansiyon adım 1.6 5 min için kuluçkaya. Not: boyama çok hızlı olduğundan EV/boya süspansiyon için daha uzun süreleri kuluçka hiçbir avantaj sağlar.</li>
	<li>Serum eşit bir hacmi (200 µL) ekleyerek boyama reaksiyonu durdurmak ve 1dk için fazla boya bağlantısına izin kuluçkaya. Not: boyama durdurmadan önce EVs üzerinden serum Santrifüjü 20.000 x g 20 dk için de tarafından tüketmek.</li>
	<li>3 kez PBS ile yıkama ve 20.000 x g 5 dakika süreyle aşağı spin Resuspend EVs 1 µg/µL son bir konsantrasyon ulaşmak için PBS 100 µL içinde.</li>
</ol>2. EVs Confocal mikroskobu tarafından alımını görselleştirmek
Not: EV içselleştirilmesi cam coverslips üzerinde yetiştirilen endotel hücreleri tarafından izlenmesine aşağıdaki protokolünü açıklar. Endotel hücreleri12' açıklandığı gibi yarı ölümsüzleştirdi insan kemik iliği endotel hücreleri vardır.
<ol><li>Steril bir ortamda çalışmaya, coverslips % 0,01 Poli-L-lizin, oda sıcaklığında (RT) 10 min için bir fazlalığı ile kat.</li>
	<li>Poli-L-lizin çözüm Aspire edin ve coverslips tamamen kurumasını bekleyin.</li>
	<li>Trypan mavi dışlama ve bir hemasitometre kullanan bir uygun endotel hücre sayısı gerçekleştirin.</li>
	<li>Tam endotel hücre büyüme Poli-L-lizin-kaplı coverslips ek karışıma içeren ve bir monolayer büyümek hücreleri izin orta 1 mL 1 x 105 endotel hücrelerinde aktarın. Not: Orta hücreleri bir monolayer oluşturmak için ve sıkı kavşaklar oluşturmak için izin büyüme faktörleri içerir.</li>
	<li>Hücreleri bir monolayer formu, dikkatli bir şekilde orta Aspire edin ve hücreleri yıkamak için taze orta 1 mL ekleyin. Yıkama bir kez daha yineleyin. PKH67 etiketli EVs 50 µg ekleyin ve 4 h için kuluçkaya. Not: alımı için en uygun zaman noktası bulmak için bir zaman ders gerçekleştirilebilir.</li>
	<li>4 h sonra orta Aspire edin ve aşırı ve ilişkisiz EVs kaldırmak için 3 kez PBS hücrelerle yıkayın. Hücreleri 15dk için PBS içinde % 3 paraformaldehyde çözüm ile düzeltmek. Not: Metanol fiksasyon işlemi sırasında aktin kesintiye uğratabilir; Bu nedenle, herhangi bir metanol Fiksajlar veya diğer solvent bazlı Fiksajlar içeren kaçınmak en iyisidir. Formaldehit metanol-Alerjik bir sabitleştirici kullanılması önerilir.</li>
	<li>Hücreleri 3 kez PBS ile yıkayın. Dikkatle 250 µL % 0.1 eklemek PBS hücreleri permeabilize Triton X-100. RT 5 min için kuluçkaya.</li>
	<li>3 kez PBS ile yıkayın. RT non-spesifik bağlama engellemek için 30 dk 400 µL engelleme arabelleği (PBS %5 BSA) ekleyin.</li>
	<li>Hücreleri bir kez PBS ile yıkayın. Boyama çözüm sulandrarak 5 µL 200 µL PBS/1% BSA her kapak notu başına phalloidin hisse senedi çözümün hazırlayın. Damlalıklı 200 µL boyama çözüm coverslip Tarih ve 20 dk RT. az için kuluçkaya</li>
	<li>3 kez PBS ile yıkayın. DNA için 30 counterstain s Höchst 33342 adlı PBS 200 µL 2 µg/mL nihai bir konsantrasyon ile.</li>
	<li>2 coverslip x 400 µL PBS ekleyerek yıkayın. Dikkatle coverslip Forseps ile kapmak ve üst kısmında bir cam slayt üzerinde ortam takma antifade bir damla tersine çevirin. Yavaşça bir doku ile aşırı medyayı çıkarın ve her tarafı oje ile mühür.</li>
	<li>4 ° C'de ışık korunuyorsunuz slaytları depolama</li>
	<li>Lazer uyarilmalar 405, 488 ve 543 nm ve 63 X, 1.3 NA petrol amacı ile floresan emisyonlarının 450-470 nm (mavi), 505-530 nm (yeşil) ve 620 confocal mikroskop kullanarak hücreleri görselleştirmek nm. Not: Tipik F-aktin boyama sonuçları şekil 1' de gösterilmiştir.</li>
</ol>3. endotel hücre geçirgenliği
Not: Endotel hücre geçirgenliği rodamine B isothiocyanate-dextran (ortalama MW 70.000) transferini ölçerek endotel hücre monolayer değerlendirilir. Dextran vasküler geçirgenliği eğitim için mükemmel bir araç sağlar.
<ol><li>%0,4 Trypan mavi dışlama ve bir hemasitometre kullanarak uygun endotel hücreleri saymak.</li>
	<li>İzdiham 24-iyi doku kültürü ekler (0.4 µm gözenek boyutu) ve izin bozulmamış farklılaşmış monolayers oluşturmak en az 5 gün için 105 hücrelere x 0.6 yoğunluğu, endotel hücreleri plaka. Orta iki günde yenileyin.</li>
	<li>Hücreleri bir monolayer ulaştığınızda, EVs yük (1 ml 50 µg) üst odası üzerinde. Rodamine-dextran 20 mg/mL nihai bir konsantrasyon üst kuyuda ekleyin. %5 CO237 ° C'de hücreler kuluçkaya.</li>
	<li>Floresan dextran transfer altına de floresan emisyon 40 µL orta aliquots üzerinden ölçerek izlemek. Çok etiketli Mikroplaka okuyucu 544 nm uyarma ve 590 nm emisyon ölçümleri için ayarlayın. Not: Dağınık dextran miktarda hisse senedi çözüm ile kurulan kalibrasyon eğrileri kullanarak sayısal. Buna ek olarak, Kinetik deney süresi boyunca (Şekil 2) dış Kamara orta küçük örnekleri kaldırarak gerçekleştirilebilir. Bile herhangi bir tedavi, dextran hücre monolayer yaygın.</li>
</ol>4. puromisindir duyarlılık belirlemek
Not: hücre hatları ile lentivirus transducing önce o belirli hücre satır için seçili bir ilacın öldürmek eğrisi belirlemek önemlidir. İlaç konsantrasyonu bütün hücreleri öldürmek gerekli en az miktarını belirlemek için seçilen ilaç artan dozlarda kullanılarak bir doz yanıt deneme gerçekleştirin. Çünkü her memeli hücre satırı önce deneme, farklı bir duyarlılık antibiyotik en iyi konsantrasyon öldürmek eğrisi titrasyon aşağıda ayrıntılı olarak geliştirerek tespit edilmelidir.
<ol><li>Hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. 1 x 105 hücre/mL tam endotel hücre büyüme ek karışımı içeren ortamda bir konsantrasyon, endotel hücreleri resuspend.</li>
	<li>Plaka 1 x 104 100 µL endotel hücre büyüme ortamının son hacmi bir 96-şey plaka hücrelere.</li>
	<li>0.1-10 µg/mL konsantrasyonu elde etmek için antibiyotik içeren orta 100 µL ekleyin (bkz. şekil 3).</li>
	<li>Hücre canlılığı 2 günde 20 X amacı istimal ışık mikroskop altında incelemek. 10-14 gün için hücreleri kültür ve puromisindir bağlı olarak hücre büyümesini her 2-3 gün içeren ortamı değiştirin.</li>
	<li>10 µL/iyi MTS reaktif her kuyuya, mix, eklemek ve standart kültür koşullarında 37 ° C'de 4 h için kuluçkaya.</li>
	<li>Plaka kısaca üzerinde bir sallayıcı ve Absorbans 490 bir plaka okuyucu kullanarak tedavi ve tedavi edilmezse hücrelerinin ölçmek nm (şekil 3).</li>
</ol>5. iletim Lentiviral vektör ile endotel hücrelerinin
<ol><li>Tam orta 1 mL 1 x 105 endotel hücrelerinde iletim önceki gün plaka. Hücreleri 50-%80 confluency ulaştığında iletim gerçekleştirir.</li>
	<li>Lentivirus buz erime ve donma-çözülme döngüsü önlemek için viral stoklarının aliquots olun. Spin aşağı 200 x g de malzeme için 30 s, tüpler üzerinde yayılımı önlemek için açmadan önce.</li>
	<li>Hexadimethrine bromür 8 µg/mL nihai bir konsantrasyon hücreleri ekleyin. Not: bazı durumlarda hücreler için zehirli olabilir ancak Hexadimethrine bromür iletim verimliliği yardımcı olur. Bu nedenle, en iyi toplama bir öldürme eğrisi iletim önce gerçekleştirerek tespit edilmelidir.</li>
	<li>Karışımı yavaşça için plaka girdap. Enfeksiyon (MOI) uygun bir çeşitlilik viral parçacıkların (0,5-2 x 106 parçacıklar arasında) uygun miktarı ekleyin ve hafifçe 30 plaka girdap karışımı s.</li>
	<li>RT, santrifüj iletim verimliliği artırmak için 300 x g de 45 dakika için hücre viral parçacık karışımda santrifüj kapasitesi. 37 ° C hücre viral parçacık karisimin gecede kuluçkaya.</li>
	<li>Dikkatli bir şekilde viral partikül içeren orta çıkarın ve uygun şekilde atın. Eski yerine koymak o ile taze, Önceden ısıtılmış tam kültür orta.</li>
	<li>Başlangıç seçimi ile puromisindir ikinci gün: Orta kaldırmak ve taze orta bölüm 4 (şekil 3) önceden belirlendiği gibi puromisindir doğru konsantrasyon içeren ile değiştirin.</li>
	<li>Hücreleri puromisindir seçimden sonra hasat ve üreticinin yönergeleri izleyerek kiti izole bir RNA kullanarak RNA yalıtır.</li>
	<li>Seçili cDNA sentezini gerçekleştirmek bir ters transkripsiyon kullanarak miRNAs Kiti ( Tablo reçetesigörmek).</li>
	<li>QPCR tepki gösterdi protokolü13göre ayarlayın.</li>
</ol>

<ol><li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.who.int/malaria/publications/world-malaria-report-2015/report/en/">WHO Malaria Report 2015</a>. , (2015).</li>
<li>Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11832955">The pathogenic basis of malaria.</a> Nature. 415 (6872), 673-679 (2002).</li>
<li>Mantel, P. Y., Marti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+extracellular+vesicles+in+Plasmodium+and+other+protozoan+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The role of extracellular vesicles in Plasmodium and other protozoan parasites.</a> Cell Microbiol. 16 (3), 344-354 (2014).</li>
<li>Couper, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parasite-derived+plasma+microparticles+contribute+significantly+to+malaria+infection-induced+inflammation+through+potent+macrophage+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Parasite-derived plasma microparticles contribute significantly to malaria infection-induced inflammation through potent macrophage stimulation.</a> PLoS Pathog. 6 (1), e1000744(2010).</li>
<li>Schofield, L., Grau, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+processes+in+malaria+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunological processes in malaria pathogenesis.</a> Nat Rev Immunol. 5 (9), 722-735 (2005).</li>
<li>Mantel, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malaria-infected+erythrocyte-derived+microvesicles+mediate+cellular+communication+within+the+parasite+population+and+with+the+host+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Malaria-infected erythrocyte-derived microvesicles mediate cellular communication within the parasite population and with the host immune system.</a> Cell Host Microbe. 13 (5), 521-534 (2013).</li>
<li>Regev-Rudzki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cell+communication+between+malaria-infected+red+blood+cells+via+exosome-like+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell-cell communication between malaria-infected red blood cells via exosome-like vesicles.</a> Cell. 153 (5), 1120-1133 (2013).</li>
<li>Szempruch, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+Vesicles+from+Trypanosoma+brucei+Mediate+Virulence+Factor+Transfer+and+Cause+Host+Anemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Extracellular Vesicles from Trypanosoma brucei Mediate Virulence Factor Transfer and Cause Host Anemia.</a> Cell. 164 (1-2), 246-257 (2016).</li>
<li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+genomics%2C+biogenesis%2C+mechanism%2C+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.</a> Cell. 116 (2), 281-297 (2004).</li>
<li>Mantel, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infected+erythrocyte-derived+extracellular+vesicles+alter+vascular+function+via+regulatory+Ago2-miRNA+complexes+in+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Infected erythrocyte-derived extracellular vesicles alter vascular function via regulatory Ago2-miRNA complexes in malaria.</a> Nat Commun. 7, 12727(2016).</li>
<li>Mbagwu, S., Walch, M., Filgueira, L., Mantel, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+Characterization+of+Extracellular+Vesicles+in+Malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Production and Characterization of Extracellular Vesicles in Malaria.</a> Methods Mol Biol. 1660, 377-388 (2017).</li>
<li>Schweitzer, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+newly+established+human+bone+marrow+endothelial+cell+line%3A+distinct+adhesive+properties+for+hematopoietic+progenitors+compared+with+human+umbilical+vein+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Characterization of a newly established human bone marrow endothelial cell line: distinct adhesive properties for hematopoietic progenitors compared with human umbilical vein endothelial cells.</a> Lab Invest. 76 (1), 25-36 (1997).</li>
<li>Wong, W., Farr, R., Joglekar, M., Januszewski, A., Hardikar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probe-based+Real-time+PCR+Approaches+for+Quantitative+Measurement+of+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs.</a> J Vis Exp. (98), (2015).</li>
<li>Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Routes+and+mechanisms+of+extracellular+vesicle+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake.</a> J Extracell Vesicles. 3, (2014).</li>
<li>French, K. C., Antonyak, M. A., Cerione, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicle+docking+at+the+cellular+port%3A+Extracellular+vesicle+binding+and+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicle docking at the cellular port: Extracellular vesicle binding and uptake.</a> Semin Cell Dev Biol. 67, 48-55 (2017).</li>
<li>Montecalvo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+transfer+of+functional+microRNAs+between+mouse+dendritic+cells+via+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes.</a> Blood. 119 (3), 756-766 (2012).</li>
<li>Idro, R., Jenkins, N. E., Newton, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis%2C+clinical+features%2C+and+neurological+outcome+of+cerebral+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis, clinical features, and neurological outcome of cerebral malaria.</a> Lancet Neurol. 4 (12), 827-840 (2005).</li>
<li>Jambou, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodium+falciparum+adhesion+on+human+brain+microvascular+endothelial+cells+involves+transmigration-like+cup+formation+and+induces+opening+of+intercellular+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Plasmodium falciparum adhesion on human brain microvascular endothelial cells involves transmigration-like cup formation and induces opening of intercellular junctions.</a> PLoS Pathog. 6 (7), e1001021(2010).</li>
<li>Zhou, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-secreted+miR-105+destroys+vascular+endothelial+barriers+to+promote+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Cancer-secreted miR-105 destroys vascular endothelial barriers to promote metastasis.</a> Cancer Cell. 25 (4), 501-515 (2014).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Çeşitli parazitler, Toxoplasma, Trypanosoma, LEISHMANIA ve Trikomonas gibi EVs virüslü konak hücre sürümü tetikler. Patojenler bağlı olarak yayımlanan EVs konak immün yanıt modüle veya hücresel iletişim parazitler6arasında arabuluculuk. Henüz, bu küçük veziküller sıtma hastalığı için nasıl katkıda bulunduğunu düşündüren çok az kanıt var. Burada, EVs fonksiyonu Plasmodium enfeksiyon sırasında araştırmak için çeşitli yollar anlatmıştık. Örneğin, EVs alımını alıcı hücreler in vivo t...

Dünya Sağlık Örgütü göre 2015 yılında dünya çapında sıtma 212 milyon yeni vaka vardı ve yaklaşık 429,000 kişi öldü, esas olarak yaş1beş yaş altı çocuklar. Genellikle vasküler disfonksiyonu ile ilişkili olan, ağır hastalıklar için önde gelen mekanizmalar kötü tanımlanmış2kalır. Plasmodium- iRBCs küçük bi-lipid membran küreler ekstraselüler veziküller (EVs) bilinen salgılar. Bu EVs potansiyel enfeksiyon enfeksiyon süreci ve konak immün yanıt ilgili bilinir; Ancak, az sıtma enfeksiyon3sırasında bu küçük veziküller özdeş işlevini hakkında bilinir. Bu iki önemli roller oynamak mümkündür: bir yandan, makrofajlar4,5; aktive ederek patogenezinde katkıda ve öte yandan, hücresel iletişim parazitler arasında parazitler ve ana bilgisayar6,7arasında arabuluculuk. Aslında, parazitler proteinler veya nükleik asitler birbirleriyle EVs üzerinden aktarabilirsiniz. Örneğin, Trypanosoma brucei rhodesiense EVs virülans faktörü Serum Resistance-Associated (SRA) aktarabilir ve diğer T. brucei ve ana bilgisayar eritrositler8hedefleyebilirsiniz. Ayrıca, P. falciparum- iRBCs arada her diğer nükleik asitler EVs içinde aktarma tarafından iletişim. Bu parazitler optimize etmek ve onun büyüme eşitlemek sağlar. Aslında, EVs, gametocyte dönüşüm büyük düzenleyici olmak ve bu nedenle iletim sahne7düzenlenmesi için katkıda bulunmak.
Sadece EVs parazitleri düzenleyen, onlar da parazit ana bilgisayar etkileşimi aracılık. Biz son zamanlarda EVs iRBCs gelen insan endotel hücreleri tarafından gerçekleştirilen ana bilgisayar kaynaklı mikroRNA (miRNAs; 21-25 nükleotit9aralığındaki küçük RNA türü) içeren keşfetti. EVs miRNAs Ago2 ile karmaşık istikrarlı bir form (RNA kaynaklı damping üye karmaşık), hangi bir kez alıcı hücrelere teslim kabil özellikle gen ifadesinin susturulması ve hücre10bariyer özelliklerini etkileyen. Standart protokolleri EVs işlevi araştırmak için geliştirilmiştir. Burada, biz ilk tarif onların alımını alıcı hücreleri tarafından araştırmaya EVs floresan etiketlemeyi sağlayan bir protokol. Buna ek olarak, confocal mikroskop kullanarak, bu EV'ın kaderi hücre içindeki izlemek mümkündür. Çeşitli floresan boyalar EVs izlemek için kullanılabilir. Amin-reaktif boya, 5-(and-6) Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) ve Calcein-AM olmak floresan bir kez veziküller içinde. Daha parlak ve daha düzgün bir sinyal verir, çünkü biz amfifilik etiket, PKH, kullanmayı tercih eder. Bu yaklaşım EVs ve alıcı hücreler arasındaki etkileşimleri anlamak için önemli bilgiler sağlar. Bazı durumlarda EVs hücreleri yüzeye bağlamak iken, bazı veziküller hızla alınır. Alımı EVs hangi onlar yasal işlevlerini uygularlar hücrelere onların yükleri teslim.
Burada, endotel hücreleri vitro bariyer fonksiyonu bir floresan dextran hücresel monolayer aracılığıyla transfer miktarının ölçmek için bir protokol açıklayın. Daha hassas tarayıcıları gibi radiolabeled işaretleri kullanılabilir. Ancak, onlar için özel güvenlik önlemleri gerektirir. Vitro bariyer fonksiyonu gibi sıkı bağlantı bütünlüğü ölçen transendothelial elektriksel direnç (AYLARININ), ölçmek için diğer deneyleri adlı biri yok. Sonunda ZO-1, sıkı kavşak protein ayirt tarafından görüntülenmesi iyi10olarak sıkı kavşak dürüst değerlendirme sağlar. EVs potansiyel düzenleyici özelliği ile birkaç yükleri içeren karmaşık ve türdeş olmayan varlıklar olduğundan, alıcı hücreye üzerindeki etkisini incelemek için belirli bir RNA overexpress yararlıdır. Bu nedenle, ayrıca faiz10miRNA ifade istikrarlı hücre satırlarını oluşturmak için amaçlayan bir iletişim kuralını tanımlar.

<table><tbody><tr><td>PKH67 Yeşil Floresan Hücre Bağlayıcı Mini Kiti</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MINI67-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Seyreltici C</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8278</td><td></td></tr><tr><td>poli-L-lizin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher - Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin CF594</td><td>Biotium</td><td>#00045</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>ThermoFisher</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Altın Antifade Mountant</td><td>ThermoFisher</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine B izotiyosiyanat&ndash; Dextran</td><td>ThermoFisher</td><td>R9379-250MG</td><td></td></tr><tr><td>PET membranlı şeffaf Falcon ile Uç&nbsp; plaka 24 kuyu için</td><td>Falcon</td><td>353095</td><td></td></tr><tr><td>Endotel Hücre Büyümesi&nbsp; Orta MV</td><td>Promocell</td><td>C-22020</td><td></td></tr><tr><td>Puromisin dihidroklorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9620-10ML</td><td></td></tr><tr><td>MTS Hücre Proliferasyonu Kolorimetrik Test Kiti</td><td>Biovision</td><td>K300-500</td><td></td></tr><tr><td>heksadimetri bromür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>107689-10G</td><td></td></tr><tr><td>MİSYON&nbsp; Lenti mikroRNA, İnsan has-miR-451a</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HLMIR0583</td><td></td></tr><tr><td>MİSYON Lenti mikroRNA, ath-miR416, Negatif Kontrol 1 İletim Parçacıkları</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NCLMIR001</td><td></td></tr><tr><td>MİSYON&nbsp; Lenti mikroRNA, İnsan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NCLMIR0001</td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS SP5</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy mini Kiti</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA Ters Transkripsiyon Kiti 1000 reaksiyon</td><td>ThermoFisher</td><td>4366597</td><td></td></tr><tr><td>has-mir-451a&nbsp; RT/750 PCR rxns</td><td>ThermoFisher</td><td>001141</td><td></td></tr><tr><td>U6 snRNA</td><td>ThermoFisher</td><td>001973</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal Master Mix II, UNG</td><td>ThermoFisher</td><td>4440038</td><td></td></tr><tr><td>StepOnePlus Gerçek Zamanlı PCR Sistemi</td><td>ile ThermoFisher</td><td>4376600</td><td></td></tr></tbody></table>

sıtma enfeksiyon sırasında hücre dışı vezikül ile değerlendirilmesi

Evaluation of Extracellular Vesicle Function During Malaria Infection

Sıtma bir yaşamı tehdit eden hastalık Plasmodium parazitler tarafından neden, P. falciparum ile en yaygın Afrika kıtasında ve en sıtma ile ilgili boyunca genel olarak varlık. Doku, vasküler disfonksiyon ve inflamatuar yanıt parazit tutma gibi birçok etkene sıtma enfekte kişilerde hastalığın evrim etkilemek. P. falciparum-virüslü kırmızı kan hücreleri (iRBCs) yayın çeşitli türde Patogenez ve hücresel iletişim parazitler ve ev sahibi arasında arabuluculuk kargo molekülleri içeren küçük hücre dışı veziküller (EVs). EVs verimli bir şekilde hangi onlar işlevlerine modüle hücreleri tarafından alınır. Burada EVs rolde parazit-ana etkileşimler adrese stratejileri tartışmak. İlk olarak, biz bir yeşil hücre bağlayıcı boya kullanarak etiketleme ve endotel hücreleri tarafından EV içselleştirilmesi izlemek için basit bir yöntem açıklanmaktadır. İkinci olarak, biz geçirgenliği endotel hücre monolayer fluorescently etiketli dextran kullanarak ölçmek için basit bir yol raporu. Son olarak, biz küçük kodlamayan RNA molekülleri endotel hücre işlevindeki rolünü araştırmak nasıl göstereceğim.

Burada, konak hücreleri ile EVs etkileşimleri araştırmak için iletişim kurallarını açıklar. Fluorescently etiketli EVs alımını confocal mikroskobu (şekil 1) tarafından kontrol edilmektedir. EVs kuluçka zamanla alımını izlemek için optimize edilebilir ancak endotel hücreleri verimli EVs götür. Bir daha iyi yerelleştirme EVs için hücrelere, aktin phalloidin ile leke. Sonra hangi üst kısmında bir monolayer endotel hücrelerinin büyür bir filtre membran kullanın. ...

Bu çalışmada, enfekte Plasmodium falciparum eritrositler tarafından yayımlanan ekstraselüler veziküller (EVs) rolünü araştırmak için iletişim kurallarını açıklar. Özellikle, endotel hücreleri ile EVs etkileşimleri odaklanmak.

Sıtma enfeksiyon sırasında hücre dışı vezikül ile değerlendirilmesi

Malaria is a life-threatening disease caused by Plasmodium parasites, with P. falciparum being the most prevalent on the African continent and responsible ...

Bu prosedürün genel amacı, Sıtma paraziti ile enfekte olmuş kırmızı kan hücreleri tarafından salınan hücre dışı veziküllerin işlevini araştırmaktır. Bu yöntem, parazitlerin parazit-konak iletişimini nasıl düzenlediği gibi Sıtma alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, indoterot hücreleri tarafından veziküler RNA'nın düzenleyici fonksiyonunun incelenen indoterot hücreleri tarafından veziküler arbitajın görselleştirilmesidir.Prosedürü gösteren, laboratuvarımdaki tüm yüksek lisans öğrencileri olan Mya Alondez, Smartin Bagu ve Bayo Babatunde olacak. Bir mikro santrifüj tüpünde 100 mikrogram hücre dışı vezikül ve bir mililitre fosfat tamponlu salin ekleyin. Daha sonra, hücre dışı vezikülleri bir pelet oluşturmak için yedi dakika boyunca maksimum 20.000 kez g hızında santrifüjleyin.Santrifüjleme bittiğinde, peleti rahatsız etmeden süpernatanı atın. Daha sonra hücre dışı vezikül peletini 100 mikrolitre dilümatta çözün C.To tam karıştırmayı sağlayın, birkaç kez pipetleyin. Daha sonra, yeni bir mikro santrifüj tüpünde, 100 mikrolitre dilmant C'ye dört mikrolitre PKH67 etanolik boya çözeltisi ekleyin.Boyama işleminden hemen önce 40 mikromolar

evaluation-of-extracellular-vesicle-function-during-malaria-infection

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

GFP transgenik sıtma parazitleri ve bu organ içinde parazit hareketlilik ve kan akımının ölçülmesi ile dalak intravital mikroskobi gerçekleştirmek için yöntem gösteriyor.

Dalak intravital Mikroskopi: Parazit Mobilite ve Kan Akımının Kantitatif Analiz

Bir<em&gt; In vitro</emOkumak&gt; Co-enfeksiyon Modeli<em&gt; Plasmodium falciparum</emİnsan İlköğretim Monosit kökenli Bağışıklık Hücrelerde&gt;-HIV-1 Etkileşimleri

Bu yöntem, Platelet dolayımlı topaklanma fenotip...

Trombosit-aracılı kesekleşme için Basit Protokolü<em&gt; Plasmodium falciparum</emBir kaynak Poor Setting&gt; ile enfekte Eritrosit

Beyin kan damarlarının gelen yapışık inflamatuar lökositlerin izolasyonu için bir...

Den Beyin sekestre Lökositler İzolasyonu ve Analizi<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA-enfekte Fare

Antikor fonksiyonu Ölçme Plasmodium falciparum sıtma dokunulmazlık anlamanın anahtarıdır. Bu yöntem, uygun bir merozoit saflaştırılmasını ve akış sitometresi ile opsonizasyon bağımlı fagositoz ölçümünü açıklamaktadır.

Yüksek Kapasiteli saflaştırılması<em&gt; Plasmodium falciparum</emOpsonizing Antikor Analizlerde kullanım için&gt; merozoitler

kırmızı kan hücrelerinin içinde sıtma paraziti girdiği, ve çoğaltır. Merozoit işgali ve parazitemya doğru değerlendirme sıtma enfeksiyonu seyrini değerlendirmede nedenle çok önemlidir. Burada sıtma bir fare modelinde bu parametrelerin ölçülmesi için tabanlı protokol sitometri akışı tarif eder.

Akış Cytometry tarafından Kemirgen Plasmodium parazitemi Vivo Değerlendirilmesi ve Merozoit Invasion

İnsan ko-enfeksiyonunun in vitro olarak çoğaltılması zordur. Bununla birlikte, insan sıtma parazitleri, doğal olarak HIV ile enfekte olmuş taze izole edilmiş insan periferik kan mononükleer hücreleri gibi, in vitro olarak kolayca kültürlenebilir. Bu, HIV ko-enfeksiyonu bağlamında sıtma parazitlerine karşı erken bağışıklık tepkilerini incelemek için mükemmel bir model sağlar.

Bir<em&gt; İn Vitro</em&gt; HIV Co-enfeksiyon Bağlamında Sıtma için Bağışıklık Yanıtları Ölçüm Modeli

İnsan mikroRNA'ları, konak eritrositlerinden Plasmodium falciparum parazitlerine yer değiştirir. Burada, sentetik mikroRNA'ları konakçı eritrositlere transfekte etmek ve tüm RNA'ları P. falciparum'dan izole etmek için kullanılan teknikler açıklanmaktadır.  Ek olarak, bu makale, parazit transkriptlerinin ribozomal doluluğunu ve translasyon potansiyelini belirlemek için P. falciparum'da bir polizom izolasyon yöntemini detaylandıracaktır.

Yöntemler Küçük RNA&#39;ların ve Ribosomal doluluk Düzenleyici Rolü Araştırma<em&gt; Plasmodium falciparum</em

Burada, Plasmodium sporozoitlerinin intradermal enjeksiyonunu takiben fare derisinden miyeloid hücreleri izole etmek ve lenf düğümünü boşaltmak için bir protokol açıklıyoruz. Toplanan hücrelerin akış sitometrisi, cildi karakterize etmek ve parazite karşı drenaj lenf nodu inflamatuar yanıtını karakterize etmek için güvenilir bir test sağlar.

Canlı zayıflatılmış intradermal aşılama sonrasında Fare Deri ve akan lenf düğümü gelen Myeloid Hücre İzolasyonu<em&gt; Plasmodium</em&gt; Sporozoitler

Bu protokolün genel amacı, plasmodium falciparum enfeksiyonuna doğal olarak maruz kalan bireylerin sera veya plazmasında bulunan antikorların kapasitesinin nasıl ölçüleceklerine, parazit enfekte eritrositlerin (IEs) fagositozunu opsonize etmek ve indüklemek tir.

Akış SitometriSi-Bazlı Bir Test ile Plasmodium falciparum Parazitlerine Doğal Olarak Edinilmiş Fagositoz-Indükleyen Antikorların Ölçülmesi

Burada, enfeksiyonun kan aşamasında Plasmodium'a hücresel bağışıklık mekanizmalarını aydınlatmaya yardımcı olacak yeni bir yöntem tarif ediyoruz. Bu, sitotoksik lenfositler tarafından enfekte kırmızı kan hücresi öldürmeyi ölçen in vitro bir testtir.

In Vitro Sitotoksik Lenfositler Tarafından Plazmodyum ile Enfekte Kırmızı Kan Hücresi Öldürme Testi

Keşfedin sıtma enfeksiyonunda Plasmodium falciparum enfekte eritrositlerden salınan hücre dışı veziküllerin endotelyal hücrelerle etkileşimini. Bu yöntem parazit-konakçı iletişim mekanizmalarını anlamaya yardımcı olur.

Sıtma enfeksiyon sırasında hücre dışı vezikül ile değerlendirilmesi

Daha fazla video keşfet