Name: Zygotic floresan kurtarma fotoğraf ağartma sonra analiz için tam dönemlik geliştirme sağlar kromatin gevşeklik (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Öğrenin zFRAP yöntemiyle zigot kromatin gevşekliğini embriyonik gelişim potansiyeliyle ilişkilendirmeyi. Bu teknik analiz edilen zigotların tam döneme zarar görmeden gelişmesini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz Satoshi Kishigami, Sayaka Wakayama, Hiroaki Nagatomo, Satoshi Kamimura ve Kana Kişida kritik yorum ve teknik destek verdiğiniz için teşekkür ederiz. Bu eser kısmen tarzı için ulusal üniversite reformu teşvik için Milli Eğitim Bakanlığı, kültür, spor, bilim ve teknoloji programı tarafından finanse edildi; Bilim (16H 02593) tanıtım, Asada Bilim Vakfı ve Takeda Bilim Vakfı'na tw Japonya Derneği Fon çalışma tasarım, veri toplama ve analizi, yayımlamaya karar veya el yazması hazırlanması herhangi bir rolü yoktu.

Bu çalışma Kılavuzu'nda bulunan öneriler için bakım ve kullanım Laboratuvar hayvanları Yamanashi Üniversitesi ile sıkı uygun olarak gerçekleştirildi. Protokol ve Yamanashi Üniversitesi hayvan deneyleri Etik Komitesi tarafından kabul edildi (izin numarası: A24-50). Tüm ameliyat tribromoethanol anestezi altında gerçekleştirilen ve tüm çabaları acı en aza indirmek için yapılmıştır. Yordamlar ve saatleri resimli bir bakış gösterilir Şekil 1 ve Tablo 1, anılan sıraya göre.
1. mesajcı RNA (mRNA eGFP-H2B,In Vitro transkripsiyonu) hazırlık
<ol><li>Şablon DNA pTOPO-eGFP-H2B3,7 5 µg ile 30 U değil / linearize ben 37 ° C'de 50 µL gecede.</li>
	<li>Onay sindirilir DNA'ın 1.5 µL olup olmadığını tamamen Elektroforez tarafından sindirilmiş toplamak.<ol>
<li>1,5 µL ve 3-5 µL sindirilmemiş DNA boya de %2 özel jel, sırasıyla yükleme ile ve Elektroforez tabi geçerlidir. Not: Eğer tamamen sindirilmiş, tek bir bant (yaklaşık 5 kb) görülmektedir. Sindirilmemiş DNA farklı bir konumda görünür bir denetim olarak kullanılır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>GKD2O 151.5 µL ekleyip 200 µL kalan için fenol/kloroform/izoamil alkol (25:24:1) DNA sindirilir.<ol>
<li>Gönderen vortex kuvvetle karıştırın.</li>
		<li>15 dakika maksimum hızda santrifüj kapasitesi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Süpernatant kurtarmak ve kloroform 200 µL ekleyin.<ol>
<li>Gönderen vortex kuvvetle karıştırın.</li>
		<li>15 dakika maksimum hızda santrifüj kapasitesi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Süpernatant yeniden elde etmek ve daha sonra 20 µL 3 M sodyum asetat ve ethachinmate 1,5 µL ekleyin.<ol>
<li>Gönderen vortex kuvvetle karıştırın.</li>
		<li>550 µL % 100 etanol ekleyin ve sonra girdap tarafından kuvvetle karıştırın.</li>
		<li>15 dakika maksimum hızda santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>Süpernatant atın ve Öyleyse Pelet % 70 etanol ile yıkayın.</li>
		<li>Pelet buharlaşma için 5-10 dk tarafından kuru.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Çöktürülmüş plazmid DNA nükleaz ücretsiz su 8 µL'geçiyoruz.</li>
	<li>Plazmid konsantrasyon değerlendirmek (beklenen konsantrasyonu olduğunu hakkında 300-500 ng/µL) üretici öğretim takip ederek nanodrop ile.</li>
	<li>Vitro transkripsiyon mRNA üreticinin yönergelerini izleyerek eGFP-H2B ile 1 µg saf DNA'ın bir şablonu olarak toplam reaksiyon hacminin 20 µL kodlama için gerçekleştirin.<ol>
<li>Vitro transkripsiyon sonra 36 μL su ekleyin sonra 1,5 µL analiz için sentezlenmiş mRNA 56 µL Elektroforez tarafından (olmadan poli gibi A) olarak kurtarılır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Poli A takip 100 µL tepki birimindeki sentezlenmiş mRNA için üreticinin yönergelerini izleyerek gerçekleştirin.</li>
	<li>Lityum klorür yağış çözüm 60 µL poly eGFP-H2B kuyruklu bir mRNA ekleyin ve sonra kuvvetle karıştırın.<ol>
<li>-30 ° c 30 dk için serin.</li>
		<li>15 dakika maksimum hızda santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>Süpernatant atın ve Öyleyse Pelet % 70 etanol ile yıkayın.</li>
		<li>Pelet buharlaşma için 5-10 dk tarafından kuru.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Isıtma için 30 dk 55 ° C'de tarafından 20 µL nükleaz ücretsiz su ile Pelet geçiyoruz.</li>
	<li>Nanodrop ile zarlarını mRNA konsantrasyonu değerlendirmek. İçin 500 ng/µL nükleaz ücretsiz su ve mağaza-80 ° c kadar kullanmak oranında seyreltin.</li>
	<li>Tercih edilen mRNA üretim onaylamak; 1 µL/olmadan mRNA (1.8.1 ve 1.12 adımları sırasıyla elde) konu poli 0.1 mg/mL arasında etidyum bromür 1,5 µL ve Elektroforez analiz için örnek yükleme boya 3 µL ile karışık bir kuyruk. Uygulanan birim 5.5 µL yapıldı. Not: Poli A takip başarılı olursa, ötelenen grubun mRNA poli bir takip olmadan göre (Şekil 2A) dikkat edilmelidir.</li>
</ol>2. Vasectomized erkek fareler hazırlanması
<ol><li>ICR erkek fareler 8-12 ayda bir ağırlık ölçeği kullanarak tartın.</li>
	<li>İntraperitoneally erkek fareler 0.7 - 0.9 mL % 1.2 tribromoethanol anestezi ile enjekte et. Not: Anestezi fare boyutuna bağlıdır. Örneğin, 40 gr ağırlığında bir fare tribromoethanol anestezi ile 0.8 mL enjekte edilir.</li>
	<li>Berry % 70 etanol ile ıslak.</li>
	<li>Bir küçük berry (3-5 mm) kesilmiş ve sonra bir makas yardımı ile kas duvardaki bir kesi yapmak olun. Not: Makas ve forseps % 70 etanol ile ameliyat başlamadan önce temizlenmelidir.</li>
	<li>Forseps ile yağ yastığı kavrama ve yavaşça çekin. Daha sonra testis ve vas deferens görünür. Not: Vas deferens U şeklinde bir tüp olduğunu ve bir kırmızı kan damarı ile.</li>
	<li>Cerrahi sütür ile iki puan, vas deferens bağlayın ve sonra bağlı nokta arasındaki orta kısmını kesti.</li>
	<li>Yavaşça geri yağ yastığı ve testis berry itin.<ol>
<li>Kalan testisin ameliyatla yineleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kas Duvar ile cerrahi sütür ile iki dikiş dikmek.</li>
</ol>3. TÜP BEBEK
<ol><li>8 - 10 - hafta eski kadın B6D2F1 enjekte 7.5 IU at koryonik gonadotropin (EKG) ve 46-50 h aralığında insan korionik gonadotropin (hCG) ile intraperitoneally (BDF1) fareler.</li>
	<li>Capacitation ve döllenme 1 gün 30 mm çanak IVF öncesine damla 300 µL insan tubal sıvı (HTF)8 ortam hazırlamak, bu damlalar laboratuvar tezgah üzerinde mineral yağ ile kapak ve bir kuluçka makinesine bir gecede preincubate.</li>
	<li>Olgunlaştı erkek ICR fareler tarafından servikal çıkığı kurban. Kauda epididim 27-G iğne ile incelemek ve spermatozoon toplamak. Onları 1-2 h 38 ° C'de HTF medyasının 300 µL içinde capacitation için kültür</li>
	<li>hCG enjeksiyonu sonra 16 h tarafından servikal çıkık dişi fareler süper ovulated kurban. Mineral yağ HTF medya yanında içine ovidukt ampulla transfer ve kümülüs hücreleri ve yumurta karmaşık bu ovidukt ampulla tarafından 30-G iğne preincubated döllenme-HTF orta çizin. Not: Kadın bazı fareler genellikle yumurtlama süper yumurtlama tedaviye rağmen gösterme. Genişlemiş ovidukt ampulla yumurtlama belirtisidir.</li>
	<li>Capacitation sonra 2-3 µL capacitated spermatozoon, hangi ovulated yumurta toplanmıştır tohumlama HTF medya içine aktarın.</li>
	<li>1 h tohumlama sonra döllenmiş zigotları toplamak ve onları 100 µg/mL CZB9 medya 10 dk, hyaluronidase ile tedavi. Not: Döllenme düzgün gerçekleştirildiğinde, tohumlama sonra 1 h 2nd kutup beden ile döllenmiş zigotları gözlenir. Daha az veya düşük kaliteli sperm kullandıysanız, yalnızca küçük zigotları 2nd kutup beden ile gözlenir. Ayrıca, birçok spermlerinin döllenme için kullanılması halinde, polyspermy oluşur. Uygun döllenme zigotları ile erkek ve dişi pronuclei yol açar. Bu ölçütleri kullanarak, tohumlama iyi ya da değil bitmiş bulmak mümkündür.<ol>
<li>CZB medya yıkandıktan sonra ikinci bir kutup gövdeli zigotları mikroenjeksiyon ile eGFP-H2B mRNA tabi.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Oda ve mikroenjeksiyon pipetler hazırlanması
<ol><li>EGFP-H2B nükleaz ücretsiz su 250 ng/µL bir konsantrasyon elde etmek için kullanarak kodlama RNA sulandırmak.</li>
	<li>2-3 damla PVP-HTF hazırlamak ve eGFP-H2B mRNA damla ve CZB (H-CZB) damla 60 mm çanak üzerinde 5-6 damla Hepes arabelleğe alınmış. Bu damla mineral yağ ile kapak. Not: Bu hazırlıklar laboratuvar tezgah üzerinde gerçekleştirilebilir. Laminer hava akımı kabine kullanmak için bir gereksinim vardır.</li>
	<li>Çek borosilikat cam micropipette çektirme ile (Örneğin, P = 500, ısı 825, çekme = = 30, vel = 120 ve saat = 200)</li>
	<li>Pipet Ucu kırdıktan sonra çekti cam mikroenjeksiyon pipet ucu (geri −300 µm) yakın bir microforge kullanarak yaklaşık 30 ° eğil.</li>
</ol>5. mikroenjeksiyon
<ol><li>Tabak ısıtıcı bir piezo ile zigotları öldürülmesi mRNA enjeksiyon sırasında önlemek için micromanipulator aşamasında açın.</li>
	<li>Yıkama ve enjeksiyon iğneler HEPES tampon HTF iç kat % 10 içeren PVP (PVP-HTF).</li>
	<li>2nd kutup beden (Şekil 2B) ile döllenmiş zigotları toplamak ve 20-25 zigotları odası ile bir micromanipulator bağlı mikroskop sahne alanı'nın üzerine aktarın.</li>
	<li>Seyreltilmiş eGFP-H2B mRNA borosilikat cam kılcal ipuçları içine doldurun.</li>
	<li>Zigot holding pipet ile tutun ve sonra zona pelusida ve piezo sürücü ile sitozolik membran bölün.</li>
	<li>Yaklaşık 10 enjekte pL mRNA zigotları sitoplazma içine. MRNA-enjeksiyon uzun kuluçka makinesi dışında zigotları kültür tarafından hasarları önlemek için 10 dakika içinde bitirmek. Not: Enjeksiyon hacmi 2nd kutup gövde metni olarak büyük olması gerekir. MRNA enjekte miktarı çok büyük ise, mobil kesir etkileyebilir ücretsiz eGFP-H2B kesir neden mümkündür.</li>
	<li>10 dakika sonra mikroenjeksiyon, en az 3 damla yıkama ve zFRAP analiz kadar 38 ° C'de CZB içinde zigotları enjekte kültür.</li>
</ol>6. zFRAP Analizi
<ol><li>Lazer ve confocal mikroskop sahne alanı'na bağlı Isıtma levhası 1s zFRAP Analizi önce açın. Sıcaklığı 38 ° C'de ayarlamak</li>
	<li>6-10 µL HEPES tampon CZB medya 60 mm cam alt çanak üzerinde mineral yağ ile kaplıdır ve sıcak ısıtıcısını zigot koleksiyonu kadar koymak.</li>
	<li>8 - 12 h tohumlama sonra toplamak 5-10 eGFP H2B ifade zigotları ve transfer içine 6-10 µL HEPES tampon CZB orta damla önceden ısındı. Not: uzun inkübatör dışında kültür önlemek için 5-10 eGFP H2B ifade zigotları her Analizi kullanılmıştır. 5-10 zigotları için 1s içinde analiz edilebilir.</li>
	<li>Ağartma ve görüntüleme koşulları üreticinin talimatlarına göre ayarlayın. Durumda confocal bir lazer mikroskop (Tablo reçetesi) tarama aşağıda gösterilmiştir:<ol>
<li>Kullanım 60 X Petrol mercek (60 X 60 X / 1,35 petrol). Not: Lensler daha yüksek büyütme (daha yüksek sayısal diyafram) gösteri daha yüksek hassasiyet ile.</li>
		<li>Tarama hızı 4.0 µs/piksel ve boyut "512" "Satın alma ayarı" (Tamamlayıcı Şekil 1) olarak ayarlayın.</li>
		<li>Dijital zoom "5" (Tamamlayıcı Şekil 1) artırın. Not: Daha yüksek zoom odak kayması ya da değil oluşur tanımak için gereklidir.</li>
		<li>Boya listesi (ek Şekil 1) ve sonra seçti "EGFP" açın. Set gözlem zaman 1.6 s (aralığı "ücretsiz Çalıştır" ayarı olarak ayarlanır) (Tamamlayıcı Şekil 1) Not: Daha fazla gözlem noktaları daha ayrıntılı veri neden olabilir, ancak aynı zamanda fototoksisite neden olabilir. ZFRAP analizde, 1.6 s gözlem vakit kromatin gevşekliği ebeveyn asimetri algılamak için yeterli gibi görünüyor.</li>
		<li>Fotoğraf sayısı 12 toplam (Tamamlayıcı Şekil 1) olarak ayarlayın.</li>
		<li>Start "Uyarıcı ayarı" paneli ve "Ana" UseScanner'ı tıklatın. Tarama hızı 10.0 µs/piksel olarak ayarlayın. "Harekete geçirmek içinde" serisini ve PreActivation "5 sn" (Tamamlayıcı Şekil 1) "3 kare" ve harekete geçirmek zaman ayarlayın.</li>
		<li>"Odak x 2" tıklayın ve odağı ayarlayın ve sonra "Dur".</li>
		<li>Ağartma ve lazer güç görüntüleme ayarla (477 nm) 110 ve 15 µW at, sırasıyla, tarafından ayarlama "gage güç lazer" (Tamamlayıcı Şekil 1). Not: Çok güçlü ağartma Nicel analiz zorluğa neden oluyor daha büyük bir ağartılmış alan neden olabilir. Lazer Güç ölçüm için bir güç ölçer kullanın. Lazer güç zamanla ilgili bir bozulma etkisini önlemek için lazer güç onaylamak önemlidir.</li>
		<li>"Küçük Rect" (Tamamlayıcı Şekil 1) uyarıcı ayar panelinde tıklatın. Faiz (ROI; kırmızı; bölgesi ayarlayın YG #1B) 40 x 40 piksel (7.6 µm2) olarak. Hazırlamak bir başvuru bölgesi (REF; yeşil; Yatırım getirisi #2) ve bir arka plan (BG; mavi; Yatırım getirisi #3) kullanarak "ROI" kopyalayıp "ROI" (fare sağ tıklatma düğmesi). Not: Piksel boyutunu imleç yatırım getirisi üzerinde olduğunda fare sağ tuşa basarak denilen "ROI Yöneticisi" aracılığıyla ayarlanabilir. Daha büyük ROIs zFRAP puan dağılımı standartlaştırmak bu yana daha iyi olduğu düşünülür. Çekirdekçik habercisi vücut (NEH) önlemek zorlaştırıyor çünkü ancak, çok büyük bir yatırım getirisi, bu çözümleme için kullanılamaz. eGFP-H2B bu yerde kromatin ücretsiz olduğu düşünülen ve dikkate değer daha yüksek hareketlilik3gösterdi. Yatırım getirisi ve REF alanları mümkün olduğunca ayrılmalıdır. Bu iki bölgeye yakın iseniz, ağartma REF bölge da etkileyebilir.</li>
		<li>"Canlı" araç çubuğunda tıklatın ve "Live çıkart" (Tamamlayıcı Şekil 1) başlatın. Not: Canlı çizim floresans sinyal yoğunluğu içinde her yatırım getirisini gösterir ve lazer güç HV kullanarak ayarlamak için kullanılır. Yatırım getirisi seçilmemişse, hiçbir yoğunluğu canlı Arsa panelde algılanan unutmayın.</li>
		<li>Yatırım getirisi konum belirleme Not: Yatırım getirisi pronuclei istediğiniz konuma sürükleyerek hareket edebilir. (1) olmak emin çekirdekçik önlemek ve uygun (2) tüm ROI nucleoplasm. ROI içinde nükleer membran (sitoplazma) alanı dışında bölge içermez. Böylece ROI sitoplazma içerir olup olmadığını ya da değil eGFP-H2B floresans bulmak kolay eGFP-H2B lokalizasyonu nucleoplasm son derece sınırlıdır. Erkek pronuclei kez 2nd kutup cesedin yanında lokalize kadın daha büyük olma eğilimindedirler. Bu kriterler kullanırken, erkek veya kadın pronuclei Yargıç.</li>
		<li>"Odak x 2" tıklatın (Tamamlayıcı Şekil 1) ve sonra HV güç gage kanal için EGFP içine floresan yoğunluğu yaklaşık 2000'e ayarlayın (floresan yoğunluğu "canlı komplo" penceresinde görülebilir).</li>
	</ol>
</li>
	<li>ZFRAP analiz başlamak için "Zaman" ve sonra "XY" (Tamamlayıcı Şekil 1)'i tıklatın. Not: "Zaman" düğmesini uygun seçtiyseniz, "t" "XY" butonunu görünür.<ol>
<li>"Sıkı bağlamak görüntüleme"XY düğmesi"yakın ve sıkı bağlamak analiz verileri elde etmek sonra görünen bitmiş serisi" (Tamamlayıcı Şekil 1),'ı tıklatın.</li>
		<li>Kurtarmak belgili tanımlık eğe "2B görünümü-görüntü XXXXX" tarafından tercih edilen adlandırılmış dosya (ÖİB. dosya biçimi) olarak "farklı kaydet" (Ctrl + Shift + S da kullanılabilir).</li>
		<li>Yatırım getirisi, REF ve BG seçin ve tıklatın (Ctrl + A da kullanılabilir) "2B görünümü görüntü" penceresinde "serisi analizi".</li>
		<li>Satır sıkı bağlamak veri elde etmek ve sonra "Kaydet" canlı çizim penceresinde düğmesini tıklatın. Not: Satır sıkı bağlamak nicel veri bir csv dosyası olarak kaydedilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ZFRAP kontrol için bazı etkisi floresans gözlem önlemek için cam alt yemekleri kenarında yakın açılan mRNA ile enjekte zigotları koymak.</li>
</ol>7. veri hesaplama
<ol><li>Kullanırken elde edilen nicel veri olun "kurtarma eğrisi" ve "mobil kısmı" tarafından Excel grafiği (bkz. aşağıdaki ile tamamlayıcı excel dosyası) bazı değişikliklerle başvurular3,7 gösterildiği gibi.</li>
	<li>Göreli yoğunluğunu 12 resimleri her zaman için yatırım getirisi ve REF BG değerini çıkararak hesaplar.</li>
	<li>ROI değeri bu hakem tarafından bölün. Sonuç olarak, her zaman bir noktada 12 standart göreli yoğunluğunu puanları elde edilebilir.</li>
	<li>3 görüntüleri ağartma fotoğraf daha önce alınan yatırım getirisi için göreli puan ortalamasını hesaplamak.</li>
	<li>Kurtarma oranını hesaplamak. 12 göreli puanları için yatırım getirisi, (7.1.2 elde edilen.) her zaman bir noktada (7.1.3 elde edilen.) fotoğraf beyazlatma daha önce göreli puanı ortalama tarafından çekilen görüntüler elde Böl. Bu sınavların kullanarak kurtarma eğri çizme (Şekil 2E).</li>
	<li>Ağartma oranını hesaplamak. Not: ağartma oranı (%) = 100 - 4th görüntü iyileşme oranı.</li>
	<li>Aşağıdaki10,11,12 olarak formül kullanarak mobil kesir (MF) hesaplama MF (%) = 12inci kurtarma oranı (bitiş noktası) - 4th iyileşme oranı / beyazlatma hızı × 100.</li>
</ol>8. embriyo transferi
<ol><li>8-12 ayda bir gece embriyo transferi önce gecede aynı kafese olmalarına izin vererek vasectomized erkek ICR fareler ile olgunlaştı ICR kadın dostum.</li>
	<li>ZFRAP analiz edilmiş ve iki hücreli aşamaya geliştirmek için kararlı embriyo toplamak.</li>
	<li>İntraperitoneally dişi fareler 0,35 - 0.75/4/5mg/kg medetomidine/midazolam/butorphanol karışık ajanların embriyo transferi önce 0,45 mL veya 0.7 - 0.9 mL % 1.2 tribromoethanol anestezi ile enjekte. Not: Anestezi hacmi fareler vücut ağırlığı tarafından belirlenir. Tribromoethanol: 0.2 mL/10 g vücut ağırlığının; medetomidine/midazolam/butorphanol ajanlar karışık: vücut ağırlığı 0.1 mL/10 g.<ol>
<li>Oviducts 0,5 gün sonrası coitum (dpc), vajinal bir fiş ile pseudopregnant kadın ICR farelerin içine bu iki hücreli sahne embriyo transfer.</li>
		<li>Embriyo transferi sonra onlar uyanıncaya kadar 37 ° C'de ayarla ısıtıcı dişi fareler koyun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>18,5 dpc, taşıyıcı anne tarafından servikal çıkığı kurban ve zFRAP analiz zigotları sezaryenle türetilmiş pups kurtarmak. Bazı ve kurtarılan yavrularını üvey annesine teslim edildi ve kendi vücut ağırlıkları her hafta değerlendirildi.</li>
</ol>

<ol><li>Burton, A., Torres-Padilla, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+reprogramming+and+development%3A+a+unique+heterochromatin+organization+in+the+preimplantation+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Brief+Funct+Genomics%22%5BJournal%5D)">Epigenetic reprogramming and development: a unique heterochromatin organization in the preimplantation mouse embryo.</a> Brief Funct Genomics. 9, 444-454 (2010).</li>
<li>Okada, Y., Yamaguchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+modifications+and+reprogramming+in+paternal+pronucleus%3A+sperm%2C+preimplantation+embryo%2C+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Epigenetic modifications and reprogramming in paternal pronucleus: sperm, preimplantation embryo, and beyond.</a> Cell Mol Life Sci. 74, 1957-1967 (2017).</li>
<li>Ooga, M., Fulka, H., Hashimoto, S., Suzuki, M. G., Aoki, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+chromatin+structure+in+mouse+preimplantation+embryos+by+fluorescent+recovery+after+photobleaching%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Analysis of chromatin structure in mouse preimplantation embryos by fluorescent recovery after photobleaching.</a> Epigenetics. 11, 85-94 (2016).</li>
<li>Meshorer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperdynamic+plasticity+of+chromatin+proteins+in+pluripotent+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Hyperdynamic plasticity of chromatin proteins in pluripotent embryonic stem cells.</a> Dev Cell. 10, 105-116 (2006).</li>
<li>Boskovic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Higher+chromatin+mobility+supports+totipotency+and+precedes+pluripotency+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Higher chromatin mobility supports totipotency and precedes pluripotency in vivo.</a> Genes Dev. 28, 1042-1047 (2014).</li>
<li>Yamagata, K., Ueda, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+live-cell+imaging+of+mammalian+preimplantation+development+and+derivation+process+of+pluripotent+stem+cells+from+the+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Long-term live-cell imaging of mammalian preimplantation development and derivation process of pluripotent stem cells from the embryos.</a> Dev Growth Differ. 55, 378-389 (2013).</li>
<li>Ooga, M., Wakayama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRAP+analysis+of+chromatin+looseness+in+mouse+zygotes+that+allows+full-term+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">FRAP analysis of chromatin looseness in mouse zygotes that allows full-term development.</a> PLoS One. 12, e0178255(2017).</li>
<li>Quinn, P., Begley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+human+seminal+plasma+and+mouse+accessory+gland+extracts+on+mouse+fertilization+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Australian+journal+of+biological+sciences%22%5BJournal%5D)">Effect of human seminal plasma and mouse accessory gland extracts on mouse fertilization in vitro.</a> Australian journal of biological sciences. 37, 147-152 (1984).</li>
<li>Chatot, C. L., Lewis, J. L., Torres, I., Ziomek, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+1-cell+embryos+from+different+strains+of+mice+in+CZB+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+reproduction%22%5BJournal%5D)">Development of 1-cell embryos from different strains of mice in CZB medium.</a> Biology of reproduction. 42, 432-440 (1990).</li>
<li>Bae, J., Sung, B. H., Cho, I. H., Song, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((F-actin-dependent+regulation+of+NESH+dynamics+in+rat+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">F-actin-dependent regulation of NESH dynamics in rat hippocampal neurons.</a> PLoS One. 7, e34514(2012).</li>
<li>Dieteren, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+mitochondrial+translation+differently+affects+the+live+cell+dynamics+of+complex+I+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Defective mitochondrial translation differently affects the live cell dynamics of complex I subunits.</a> Biochim Biophys Acta. 1807, 1624-1633 (2011).</li>
<li>Subramanian, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H2A.Z+acidic+patch+couples+chromatin+dynamics+to+regulation+of+gene+expression+programs+during+ESC+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">H2A.Z acidic patch couples chromatin dynamics to regulation of gene expression programs during ESC differentiation.</a> PLoS Genet. 9, e1003725(2013).</li>
<li>Hayashi-Takanaka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+epigenetic+histone+modifications+in+single+cells+using+Fab-based+live+endogenous+modification+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Tracking epigenetic histone modifications in single cells using Fab-based live endogenous modification labeling.</a> Nucleic Acids Res. 39, 6475-6488 (2011).</li>
<li>Yamazaki, T., Yamagata, K., Baba, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+and+retrospective+analysis+of+DNA+methylation+in+mouse+preimplantation+embryos+by+live+cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Time-lapse and retrospective analysis of DNA methylation in mouse preimplantation embryos by live cell imaging.</a> Dev Biol. 304, 409-419 (2007).</li>
<li>Puschendorf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRC1+and+Suv39h+specify+parental+asymmetry+at+constitutive+heterochromatin+in+early+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">PRC1 and Suv39h specify parental asymmetry at constitutive heterochromatin in early mouse embryos.</a> Nat Genet. 40, 411-420 (2008).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu çalışmada ortaya gibi zFRAP analiz bu yöntem Birliği arasında moleküler olaylar ve embriyonik gelişim potansiyeli ortaya çıkarmak için çok yararlı bir araçtır düşündüren tam dönemlik gelişmeye kritik hasar neden olmaz. , ES hücre hangi tarafından bu hücreleri fark potansiyeli bu iki hücreli sahne embriyolar, olarak yüksek olur, devlet gibi iki hücresine yeniden programlama sırasında kromatin gevşekliği bu iki hücreli sahne embriyo5ile karşılaştırılabilir değiştirir. Buna göre zygotic kromatin g...

Gübreleme sonra dinamik olarak değişmiş kromatin yapısı, ve zygotic kromatin yapısı sonra sonunda kurulan1,2. Baba tarafından pronuclei, bu döneminde sırasında baskın kromatin protein histon protamine değiştirilir. Elde edilen kromatin son derece spermlerinin ve birkaç puan (Örneğin, histon varyant kompozisyon, histon değişiklik) dişi yumurta farklıdır. Böylece, kurulan zygotic kromatin sonraki embriyonik geliştirme için önemli olduğu düşünülmektedir. Ancak, uzun sürelerle zygotic kromatin yapısı ayrıntıları ortaya çıkarmak için çabalara rağmen yöntemleri zigotları niteliğini değerlendirmek için veya onların kromatin yapısı analiz ederek tam dönemlik gelişimleri tek hücreli aşamada tahmin etmek hiç var kurulan.
Önceki çalışmada, bu zigotları son derece gevşetti kromatin yapısı3var keşfedilir. Şu anda, kromatin gevşeklik veya açıklık hücresel farklılaşma (ES) embriyonik kök hücreleri4' te potansiyel için önemli bir faktör olduğuna inanılıyor. ES hücreleri homojenliği doğada sergi değil, ama oldukça heterojen; ES Hücre koloniler halinde bazı geçici bir daha yüksek farklılaşma potansiyeli iki hücreli sahne embriyo blastomeres için karşılaştırılabilir elde etmek. Devlet gibi iki hücresine bu geçiş sırasında ES kromatin gevşekliği iki hücreli sahne embriyo5ile karşılaştırılabilir nedir içine değişiklikler hücreleri. Böylece, kromatin gevşekliği önemli hücresel farklılaşma potansiyeli için kapsamlı kromatin zigotları içinde açmak mümkün olduğu zygotic gelişim potansiyeli değerlendirme için yararlı gibi görünüyor.
Canlı görüntüleme sonraki geliştirme ve hatta tam dönemlik geliştirme6için bu yöntem sağlar beri moleküler olayların analizi için ontogeni sırasında sağlayan güçlü bir araçtır. Canlı görüntüleme yöntemlerinden birini kromatin gevşekliği Preimplantasyon embriyo ve ES hücreleri3,4,5incelemek için sıkı bağlamak Analizi kullanılmıştır. Zygotic kromatin gevşekliği tam dönemlik geliştirme üzerinde zararlı bir etkisi olmadan sıkı bağlamak analiz tarafından çözümlenebilir, embriyo kalitesi değerlendirme tek hücreli aşamada için değerli bir araç olabilir. Ancak, bu deneysel yöntem tarafından tam dönemlik geliştirme etkileri inceledik değil. Son zamanlarda, deneysel bir sistemi zygotic kromatin gevşekliği değerlendirmek için sıkı bağlamak kullanarak geliştirilmiştir. Çünkü bu zigotları için yeni bir gözlem sistemi, zygotic sıkı bağlamak (zFRAP) olarak adlandırdığı oldu. zFRAP eleştirel tam dönemlik geliştirme etkilemez mi ve oldu başka bir yerde7bildirdi. Bu raporda, bu deneysel yöntemin protokolü tanımlanır.

<table><tbody><tr><td>Konfokal lazer tarama mikroskobu</td><td>Olympus</td><td>FV1200</td><td>FV1000, FRAP analizi için de kullanılabilir (referans #7)</td></tr><tr><td>Termo plaka</td><td>Tokai Hit</td><td>TP-110RH26</td><td></td></tr><tr><td>Ters mikroskop</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>Mikro manupilatör</td><td>Narishige</td><td>MMO-202ND</td><td></td></tr><tr><td>Pieze Mikro Mikromanipülatör</td><td>Prime tech</td><td>PMAS-CT150</td><td></td></tr><tr><td>35 mm kültür çanağı</td><td>Falcom</td><td>351008</td><td>35 x 100 mm stili; IVF</td></tr><tr><td>için 60 mm kültür kabı</td><td>Falcom</td><td>351007</td><td>60 x 15 mm stili; embriyo kültürü için</td></tr><tr><td>50 mm kültür kabı</td><td>Falcom</td><td>351006</td><td>50 x 9 mm stili; sahnede manipülasyon için</td></tr><tr><td>50 mm cam alt çanak</td><td>Matsunami</td><td>D910400</td><td>50 mm çanak, 27 mm ve phi; delik boyutu; FRAP analizi için</td></tr><tr><td>Mineral yağ</td><td>Organik baharat kimyasalları</td><td>625071</td><td>Cam alt tabaklarda FRAP analizi için</td></tr><tr><td>Mineral yağ</td><td>Sigma</td><td>M8410-1L</td><td>IVF ve embriyo kültürü için</td></tr><tr><td>cam kılcal</td><td>Drummond</td><td>1-000-1000</td><td>Fare zigotlarını işlemek için</td></tr><tr><td>Borosilikat cam</td><td>Prime tech</td><td>B100-75-10-PT</td><td>mRNA mikroenjeksiyonu için Mikropipet</td></tr><tr><td>çektirme</td><td>Sutter aleti</td><td>P-97/IVF</td><td>Enjeksiyonun hazırlanması veya neadle tutulması için (dış yan çap: 80 & mikro; m, iç çap: 10 & m)&nbsp;</td></tr><tr><td>Microforge</td><td>&nbsp; Narishige</td><td>MF-900</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE MACHINE SP6 Transkripsiyon kiti</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>Poly (A) kuyruk kiti</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>AM1350</td><td></td></tr><tr><td>PVP çözeltisi %10 (PVP-HTF)</td><td>IrvineSceientific</td><td>99311</td><td>%10 PVP içeren HEPES tamponlu HTF</td></tr><tr><td>Sodyum HEPES Sigma</td><td></td><td>H3784</td><td></td></tr><tr><td>eGFP-H2B mRNA için pTOPO eGFP-H2B</td><td></td><td></td><td>Şablon plazmidi (referans #6)</td></tr><tr><td>NorthernMax Gly Numune yükleme Boyası&nbsp;</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>AM8551</td><td>İn vitro transkribe mRNA'nın elektroforezi için</td></tr><tr><td>Fenol kloroform izamil alkol</td><td>nacalai tesque</td><td>25970-14</td><td></td></tr><tr><td>Kloroform</td><td>nacalai tesque</td><td>&nbsp; 08401-65</td><td></td></tr><tr><td>Değil I</td><td>TOYOBO</td><td>NOT-111X</td><td></td></tr><tr><td>Ethachinmate</td><td>WAKO</td><td>318-01793</td><td></td></tr><tr><td>3664 Otical güç ölçer</td><td>Hioki</td><td>3664</td><td>&nbsp; Lazer gücü için güç ölçer</td></tr><tr><td>Stereomicmicroscope</td><td>Olympus</td><td>SZX16</td><td></td></tr></tbody></table>

zygotic floresan kurtarma fotoğraf ağartma sonra analiz için tam dönemlik geliştirme sağlar kromatin gevşeklik

Zygotic Fluorescence Recovery After Photo-bleaching Analysis for Chromatin Looseness That Allows Full-term Development

Canlı görüntüleme moleküler olayların analizi için ontogeni sırasında sağlayan güçlü bir araçtır. Son zamanlarda, kromatin gevşeklik veya açıklık pluripotent embriyonik kök hücre hücresel farklılaşma potansiyeli dahil olmak gösterilmiştir. Bu daha önce kıyasla bildirildi embriyonik kök hücreleri ile onların totipotency ile dernek düşündüren bir son derece gevşetti kromatin yapısı zigotları liman. Bu son derece gevşetti/aç kromatin yapısı embriyonik gelişim potansiyeli için önemli olup olmadığını ancak, şimdiye kadar bu giderilmiş değil. Bu da çalışmanın, floresans tarafından analiz edildi hangi zigotları içinde fotoğraf ağartma sonra kurtarma terime önemli zarar vermeden gelişebilir bir deneysel sistem bu hipotez incelemek için geliştirilmiştir. Önemlisi, bu deneysel sistem sadece bir termos-tabak ısıtıcı ek olarak confocal bir lazer mikroskobu tarama gerekir. Sonra çözümleme (sıkı bağlamak) fotoğraf ağartma zygotic kromatin moleküler olaylarda tam dönemlik geliştirme için önemli olup olmadığını araştırmak için kullanılabilir Bu çalışma bulguları bu floresan kurtarma öneririz.

eGFP-H2B ile zFRAP Analizi
Düzgün üretilen eGFP-H2B, ötelenen bir grup tarafından poly bir takip (Şekil 2A) neden olduğu gibi görülen kodlama mRNA zigotları 1-3 h 2 bir kutup gövdeli sitoplazma içine tohumlama (Şekil 2B) sonra enjekte ettiler. 8'e 12 h tohumlama sonra 2 pronuclei eGFP-H2B ifade gösterilen ile zigotları toplanmış ve zFRAP Analize (Şekil...

Kromatin gevşeklik blastomeres gelişim potansiyelini yer gibi görünüyor. Ancak, kromatin gevşekliği güvenilir bir dizin olarak embriyoların gelişim potansiyeli için kullanılıp kullanılamayacağını bilinmemektedir. Burada, kromatin gevşekliği tarafından değerlendirilmiş zigotları tam dönem için gelişebilir bir deneysel sistem tarif edilmiştir.

Zygotic floresan kurtarma fotoğraf ağartma sonra analiz için tam dönemlik geliştirme sağlar kromatin gevşeklik

Live imaging is a powerful tool that allows for the analysis of molecular events during ontogenesis. Recently, chromatin looseness or openness has been ...

Bu zigotik FRAP veya zFRAP'ın genel amacı, zigotik kromatin gevşekliği ile embriyonik gelişim potansiyeli arasındaki ilişkiyi incelemektir. Bu yöntem, embriyonik gelişim gibi gelişimsel biyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, analiz edilen zigotun önemli bir hasar olmadan tam vadeye kadar gelişmesine izin vermesidir.Bu yöntemin görsel gösterimi, zFRAP analiz adımlarının öğrenilmesi zor olduğundan, bu analiz için deneysel koşul ayarı ve işlemi çok karmaşık olduğundan kritik öneme sahiptir. eGFP-H2B RNA'yı metin protokolüne göre hazırladıktan sonra, mikrolitre başına 250 nanograma seyreltmek için nükleaz içermeyen su kullanın. 60 milimetrelik bir tabağa, her birine iki ila üç damla PVP-HTF, beş ila altı damla Hepes tamponlu CZB ve eGFP-H2B mRNA yerleştirin.Ardından, damlaları kapatmak için mineral yağ kullanın. Bir pipet çektirmesi kullanarak borosilikat camı çekin. Ucu kırdıktan sonra, cam pipeti yaklaşık 30 dereceye kadar bükmek için bir microforge kullanın.Mikroenjeksiyondan önce, mRNA enjeksiyonu sırasında zigotların öldürülmesini önlemek için mikromanipülatörün tablasındaki plaka ısıtıcısının kapalı olduğunu doğrulayın. A

zygotic-fluorescence-recovery-after-photo-bleaching-analysis-for

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Biz Photobleaching sonra Floresan Kurtarma (sıkı bağlamak) ve embriyonik kök hücreleri (ES) kromatin protein dinamiklerini izlemek için (FLIP) Photobleaching Floresan kaybı da dahil olmak üzere photobleaching yöntemleri açıklanmaktadır. Kromatin plastisite çalışma araçlarının biri olarak kabul edilir Kromatin protein dinamiği, pluripotent hücreler geliştirilmiş.

Embriyonik Kök Hücreler Yaşayan Kromatin Protein Dynamics Tedbir Tahliller (sıkı bağlamak ve FLIP) Photobleaching

SAC kardeş kromatidler arasında mitotik segregasyon izlenmesi, sinyali başlatır nerede kinetochore olduğunu. A metodunda kromozom hareketi ile kinetochore proteinler ve koordinasyon birinin seçilmesi ve devir görselleştirme tarif...

Living Görselleştirilmesi Dinamik Kinetochore Protein Davranış ve Kromozom Hareket tarafından Mitotik Checkpoint incelenmesi<em&gt; Drosophila</em&gt; Sinsityal Embriyolar

Hücre ve dokularda protein seviyeleri, çoğu zaman sıkı bir şekilde protein üretimi ve temizlenmesi dengesi ile düzenlenir. Fotoçevrim (FDAP) sonra floresans Bozunma kullanan proteinlerin temizlenme kinetiği deneysel in vivo olarak ölçülebilir.

Fotoçevrim sonra Floresans Bozunma kullanarak Oturma balığı Embriyolar protein stabilitesi ölçümü (FDAP)

Yüksek derecede sıkıştırılmış mitotik kromatinin deyoğunlaşmasının moleküler mekanizmaları tam olarak tanımlanmamıştır. HeLa hücrelerinden izole edilen mitotik kromatin kümelerine ve in vitro dekondensasyon sürecini aslına uygun olarak yeniden oluşturan Xenopus laevis yumurta ekstraktına dayanan hücresiz bir test sunuyoruz.

Hücre Testi Mitoz Sonu Kromatin dekondenzasyon Eğitim için

Işık levha bazlı floresan mikroskobu ile böcek embriyonlarından morfojenezini Görüntüleme tekniğin durumu haline gelmiştir. Bu protokol ana hatlarıyla ve Tribolium castaneum embriyolar için uygun üç montaj teknikleri karşılaştırır, canlı görüntüleme için uygun iki yeni ısmarlama transjenik çizgileri sunar, önemli bir kalite kontrol anlatılır ve mevcut deney sınırlamaları gösterir.

Işık Levha tabanlı Floresan Yaşayanlar Mikroskopi veya Sabit ve Lekeli<em&gt; Tribullum castaneum</em&gt; Embriyolar

Oogenesis memelilerde özellikle kromozom missegregation nedeniyle hataya, olduğu bilinmektedir. Bu el yazması için fare profaz, yaymak Kromatin hazırlama yöntemleri açıklar metafaz ı ve II sahnelenen yumurtalar. Bu temel teknikler Kromatin bağlı proteinler ve kromozom morfolojisi memeli oogenesis boyunca çalışma sağlar.

Kromatin fare oosit ilerleme profaz metafaz II analizi için hazırlıklar yaymak

Bu el yazması Xoluşturmak için ayrıntılı bir yöntem sunuyor-kromozom kol sonda ve kız kardeşi durumunu incelemek için performans gösteren Floresans in situ hibridizasyon (balık) Kromatit uyum içinde prometafaz ve metafaz tutuklandı Drosophila yumurta. Bu iletişim kuralı segregasyonun kol uyum bozulmamış veya kesintiye farklı genotip içinde olup olmadığını belirlemek için uygundur.

Kol uyum içinde prometafaz ve metafaz durumunu izlemek için Floresans In Situ hibridizasyon (balık) kullanarak ben Drosophila yumurta

Biz nasıl sıkı BAĞLAMAK ve photoactivation gibi mikro - ve photomanipulation teknikleri hareketliliği parametreleri belirlenmesi etkinleştirmek ve proteinler geçiş içinde kronolojik zamanmekansal dinamikleri hücreleri tanımlamak. Deneysel veriler hücre altı dinamikleri ve ciro hareketliliği düzenleyiciler veya temel aktin sitoiskeleti içerir.

Morfogenetik dinamiklerini analiz ve hücre iskeleti düzenleyiciler ciro sağlayan Embriyolardan teknikleri

Bu tek molekül floresans in situ hibridizasyon Protokolü bitkisel büyüme ve mayoz sırasında RNA molekülleri mayası sayısını ölçmek için optimize edilmiştir.

Tek molekül floresans In Situ hibridizasyon (smFISH) analizi Budding Maya bitkisel büyüme ve mayoz

Hızlandırılmış mikroskopi, tomurcuklanan mayadaki mayozu incelemek için değerli bir araçtır. Bu protokol, mayotik kromozom ayrışması sırasında belirli bir proteinin işlevinin nasıl çalışılacağını göstermek için hücre döngüsü senkronizasyonunu, hızlandırılmış mikroskopiyi ve bir hedef proteinin koşullu tükenmesini birleştiren bir yöntemi açıklar.

S. cerevisiae'de Mayozu İncelemek için Hızlandırılmış Mikroskopi ve Proteinlerin Aşamaya Özgü Nükleer Tükenmesinin Kullanılması

Sinapslardaki mayotik hatalar ve rekombinasyon, memeli oositlerinde yaygındır. Bu süreçlerde yer alan proteinlerin titiz analizi, oogenezin nasıl ve neden sıklıkla yanlış gittiğini anlamak için çok önemlidir. Burada sunulan teknikler, farelerde oosit kalitesini değerlendirmek için rekombinasyon ve sinapsların kapsamlı bir şekilde izlenmesine izin verir.

Sinapsis ve Rekombinasyonun Değerlendirilmesi için Fare Oositlerinden Mayotik Kromozom Yayılımlarının Hazırlanması

Öğrenin zFRAP yöntemiyle zigot kromatin gevşekliğini embriyonik gelişim potansiyeliyle ilişkilendirmeyi. Bu teknik analiz edilen zigotların tam döneme zarar görmeden gelişmesini sağlar.

Zygotic floresan kurtarma fotoğraf ağartma sonra analiz için tam dönemlik geliştirme sağlar kromatin gevşeklik

Daha fazla video keşfet