Name: Kimyasal ve genetik eklenmesi en iyi duruma getirme GPCRs fotoğraf-çapraz eşleme ve canlı memeli hücreleri Bioorthogonal kimyada probları (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-09T14:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 2 s
Description: Öğrenin, memeli hücrelerinde GPCR'lerin fotoğraf-çapraz eşleme ve biyoortogonal etiketleme yöntemleriyle protein-protein etkileşim haritalaması ve canlı hücre görüntüleme uygulamaları.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu eser tarafından Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) hibe CO822/2-1 (Emmy Noether programı) ve CO822/3-1 için araç ten altında kurulan

Yazarlar herhangi bir çakışma olmadığını bildirmek için var.

Protokol ncAAs birleşme memeli hücrelerinde proteinlerin içine dik çiftleri verimliliğini değerlendirmek için basit ve güvenilir bir tahlil açıklar. Bu yöntem yaygın olarak kullanılan deneyleri FACS üzerinde dayalı açısından büyük avantajı bu eşzamanlı hazırlanması ve örnekleri daha büyük sayıda ölçüm sağlar ve kolayca sıradan bir yazılım kullanılarak analiz veri sağlar olduğunu. Dik memeli hücreleri çiftinde analiz etmek için bir orta-den geçerek yöntem kullanılabilirliği mevcutların geliştirilmesi ve yeni ortogonal çif...

Kimyasal probları genetik birleşme proteinlerin içine protein işlevi doğrudan canlı hücre yerli bağlamında yapısal ve dinamik yönleriyle incelenmesi kolaylaştırmak için güçlü bir yöntemdir. Günümüzde, kanonik olmayan amino asitler (ncAAs) en farklı kimyasal gruplar ile donatılmış yüzlerce site-specifically protein biyosentezi1,2,3,4tarafından eklenebilir. Aralarında, bir fotoğraf-crosslinkers5, fotoğraf Kafesli6,7,8,9 ve fotoğraf değiştirilebilir amino asitler10, gibi fotoğraf duyarlı ncAAs bulur 11, amino asitler taşıyan gergin alkenes ve alkynes catalyst-Alerjik bioorthogonal kimya2,12,13,14,15,16 ,17, dansyl18, coumarin9,19ve prodan20,21 fluorophores taşıyan amino asitleri ve amino asitler biyofiziksel diğer probları ile donatılmış sonrası translasyonel modifikasyonlar1,2,3,4,22,23,24,ile25gibi iyi.
Genetik bir ncAA kodlama bir adanmış amino-asil-tRNA-ncAA yanıt olarak bir kehribar kodonu düzenli ribozomal sentezi sırasında birleştirmek soydaş bir bastırıcı-tRNA için eşleştirilmiş sentetaz (AARS) tarafından etkinleştirilir. ncAARS/tRNA çiftleri konak canlı, Yani değil çapraz-endojen çiftiyle hadis dik olacak şekilde tasarlanmıştır. Prokaryotik ve ökaryotik ana bilgisayarlar ve kolayca uygulanabilir memeli hücreleri hem de iyi kurulmuş bir tekniktir. Memeli hücrelerinde ncAA birleşme için çift üç ana ortogonal sistemlerinde temel alır: E. coli26 TyrRS bir tyrosyl amber bastırıcı B. stearothermophilus27 (Ec ile birleştiren tyrosyl sistemi TyrRS /BstYam çift), E. coli leucyl sistemi (EcLeuRS/tRNALeuCUA çifti)6,18,28 ve arke pyrrolysyl sistemi (PylRS/tRNA Pyl çifti)3, tRNAPyl bu sayede doğal kehribar bastırıcı. Genel olarak, her ncAA tarafından özel bir ncAARS tanınır. Her ne kadar bazı sentetaz birden fazla ncAA kabul edebilir ncAA yapısına bağlı olarak, ncAARS TyrRS, LeuRS veya PylRS, yönlendirilmiş evrim elde edilir.
Ortogonal çifti sadece bir plazmid vektör kullanarak hücre içine alınır. En yaygın ve etkin plazmid ortogonal çifti29şekillendirme tRNA sentetaz hem de encode ve bicistronic vardır. Kodlama değişikliği için belirlenmiş sitesinde bir kehribar kodon faizli protein için ikinci plazmid co transfected. NcAA sadece hücre büyüme ortamına eklenir. Ancak, farklı özel gruplar genellikle plazmid yapıları farklı türevleri bile aynı ncAA birleşme için kullanın. Düzenleme vektör, sentetaz türünü, kodon kullanım sentetaz gen, organizatörü kullanımı, değişken tRNA ve tRNA ifade kaset sayısı genlerin yapıları farklı. Ayrıca, farklı ncAAs birleşme verimliliği nedeniyle farklı katalitik verimini farklı sentetaz, tRNA ve diğer faktörler30kalitesini büyük ölçüde değişebilir. Bu nedenle, el altında dik çiftinin en uygun sistemi için istediğiniz uygulamayı seçin ve genel protein ifade geliştirmek bazı optimizasyon adımları gerçekleştirmek için verimliliğini değerlendirmek için hızlı ve güvenilir bir yöntem olması önemlidir verir.
Biz dik çiftleri29 (şekil 1) verimliliğini değerlendirmek için bir basit ve sağlam Floresans tabanlı tahlil kurduk. Assay olarak, plazmid ile birlikte her ikisi için bir kehribar kodonu izin veren bir konumda (EGFPetiketi) taşıyan yeşil flüoresan protein kodlama bicistronic muhabir plazmid ortogonal çifti için kodlama ile ortak transfected hücrelerdir ve mCherry gen. Bütün hücreli lysates kırmızı ve yeşil floresan bir plaka okuyucu bir 96-şey plaka üzerinde ayrı kanallarda okuyun. Kırmızı Floresans yoğunluğunu transfection etkinlik ve ölçülen örnek boyutunun doğrudan bir tahmin verir ise yeşil floresan yoğunluğu doğrudan kehribar giderme, verimliliği ile karşılıklı olarak ilişkilendirir. Floresans üzerinde dayalı benzer deneyleri ile ilgili olarak yardımlı hücre (FACS) sıralama okumak31,32, tahlil protein ifade acil ve kapsamlı bir değerlendirmesini daha fazla olan tüm cep telefonu topluluk içinde verir. Her zamanki deneysel koşullar, temsilcisi ve bir daha kolay veri toplama ve işleme standart yazılım ile sunmaktadır. Genel olarak, en büyük avantajı tahlil örnekleri çok sayıda orta paralel olarak analiz edilebilir olduğunu. Bu tahlil kullanarak, bastırıcı-tRNA Pyl ortogonal sistem30verimliliğini artırmak için mantıklı bir şekilde tasarlanmış bir kütüphane ekranlı. Bu eser bu tahlil gerçekleştirmek ve fotoğraf-crosslinking ncAA p-azido-L-fenilalanin (Polat) birleşme ortogonal çiftinin optimizasyonu ve karşılaştırılması gibi onun uygulama örnekleri göstermek için deneysel protokolünü açıklar birleşme verimliliği farklı amino asit (Şekil 2).
Geçen yıllar boyunca, yapısal araştırmak için çok güçlü kanıtlanmış ncAA araçları ve reseptörleri (GPCRs)33,34,35,36,37 G-protein fonksiyonel yönleri birleştiğinde , 38. insanlarda, GPCRs membran reseptörleri (800 üye) büyük bir aile oluşturmak ve tedavi edici ilaçlar için ana hedefleri temsil eder. GPCRs doğrudan yapısal karakterizasyonu hala meydan okuyor ve tamamlayıcı biyokimyasal yöntem son derece onların soruşturma için ihtiyaç vardır. Fotoğraf-çapraz ncAAs GPCR yüzeyler harita ve ligand bağlayıcı cepler34keşfetmek için kullanılmasına öncülük etmiştir. Polat birleşme için en iyi duruma getirilmiş sistemimizi kullanarak, biz sistematik olarak Polat GPCR canlı memeli hücrelerinde doğrudan, Bütün juxtamembrane etki alanı dahil. UV ışınlama Polat komşu molekülleri kovalent yakalar bir büyük ölçüde reaktif nitrene tür oluşturur. Ligand sisteme eklendiğinde, Polat hangi pozisyonlar reseptör ilişkili ligand yakın gel ortaya çıkarmak için bir yakınlık sonda olarak hizmet vermektedir. Bu şekilde, peptit hormon Urocortin ı (Ucn1) Sınıf B GPCR kortikotropin-serbest-faktör reseptör tarihinde 1 (CRF1R)33 tipi bağlama modu ilk açıldı. Son zamanlarda, farklı bağlama kalıpları agonistleri ve antagonistleri tarihinde aynı reseptör38ifşa. Benzer bir yaklaşım, orthosteric ve allosteric bağlayıcı siteleri diğer peptidler ve küçük molekül ligandlar tarihinde diğer GPCRs39,40,41,42ortaya çıkarmak için başkaları tarafından uygulanmıştır. Bu el yazması GPCR yüzeyler, fotoğraf-crosslinking eşleştirilmesine bizim laboratuvarında uygulanan deneysel protokolünü açıklar. Yöntem nispeten hızlı, basit ve böylece standart Biyokimya laboratuvarlarında uygulanabilir herhangi bir özel bir donanım gerektirmez. Önemlisi, yaklaşım sadece 3D yapısal verileri nerede kıt ligand bağlayıcı siteleri tanımlamak için aynı zamanda tam olarak post-translationally tarihinde reseptörleri üzerinden bilgileriyle varolan vitro verileri ek olarak değerli bir araç sağlar canlı hücre fizyolojik ortamı.
Roman ncAAs yan zinciri kimyasal gruplarında ultrafast katalizör-Alerjik bioorthogonal Kimya için uygun taşıyan son gelişme olasılığı son nesil fluorophores süper kararlılık düşsel için protein yüklemek için açtı 2,43doğrudan canlı hücreleri. Bu tür kimyasal dübel gergin cyclooctyne dahil SCOK14, bicyclo [6.1.0] nonyne BCNK12,17ve trans-cyclooctenes toplam sahip olma maliyeti içinde * K13,15,17 diğer ncAAs arasında norbornene16,17,44 veya cyclopropene45,46 yan yataklık. Bioorthogonal kimya hantal ncAAs genellikle PylRSAF ile belirtilen PylRS varyanta göre dahil (mutasyon gösteren Y271A ve M. barkeri PylRS Y349F), yanı sıra diğer gelişti geçici ncAARSs tarafından17 gibi , 44. bioorthogonal çapa yüksek etiketleme verim içinde birkaç dakika43,48vermek için ters elektron isteğe Diels-Alder cycloaddition via tetrazine reaktifler47 ile tepki. Ancak, uygulama için etiket GPCRs güçlü Bu yaklaşımın ortogonal ncAA birleşme sistem düşük bir genel verimliliğini nedeniyle zor oldu. Gelişmiş Pyl sistemimizi kullanarak, son zamanlarda yüksek verimli birleşme gibi amino asitler GPCRs ve ultrafast GPCR canlı memeli hücreleri30yüzeyinde etiketleme göstermiştir. Fizyolojik bir agonist ile reseptör aktif hale getirildiğinde içselleştirilmiş gibi etiketli reseptörleri hala fonksiyonel. Deneysel protokol bioorthogonal birleşme GPCRs tutturur ve aşağıdaki etiketleme adımları burada açıklanmıştır. GPCRs küçük parlak fluorophores ile donatılması ilk temel doğru GPCR yapısal dinamiklerin canlı hücredeki çalışma yolu ile gelişmiş mikroskobu teknikleri adımdır.

<table><tbody><tr><td><güçlü > Kimyasallar< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Akrilamid / Bisakrilamid %30 (37,5:1)</td><td>Carl Roth</td><td>3029.1</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum persülfat (APS)</td><td>Carl Roth</td><td>9592.2</td><td></td></tr><tr><td>p-Azidofenilalanin (Azi)</td><td>Bachem</td><td>F-3075.0001</td><td></td></tr><tr><td>Borik asit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B6768</td><td></td></tr><tr><td>Bromphenolblue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0126-25G</td><td></td></tr><tr><td>Sığır serum albümini (BSA)</td><td>Carl Roth</td><td>8076.2</td><td></td></tr><tr><td>Karbobenziloksi-L-lizin (Lys(Z))</td><td>NovaBiochem</td><td>8540430100</td><td></td></tr><tr><td>Siklooktin-L-lizin (SCOK)</td><td>Sichem</td><td>SC-8000</td><td></td></tr><tr><td>DMM</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>41966052</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Carl Roth</td><td>A994.2</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Carl Roth</td><td>6908.1</td><td></td></tr><tr><td>geliştirilmiş kemilüminesans reaktifi (ECL)&nbsp;</td><td></td><td>0.1 M Tris-HCl pH 8.6'da ev yapımı 10 mg / l luminol; DMSO'da 1100 mg / l ve nbsp; p-kumarik asit; 30&nbsp;% H2O2 (1.000: 100: 0.3)</td>EDTA Carl Roth 8043.1 EGTA Carl Roth 3054.1 endo-bisiklo [6.1.0] nonin-L-lizin (BCNK) Sichem SC-8014 FBS Thermo Fisher (<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> Gibco)</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>FluoroBrite DMEM</td><td>Thermo Fisher (Gibco)</td><td>A1896701</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Carl Roth</td><td>7533.1</td><td></td></tr><tr><td>Glisin</td><td>Carl Roth</td><td>3908.3</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth</td><td>9105.3</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Carl Roth</td><td>6781.3</td><td></td></tr><tr><td>Lipofiktamin 2000&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Luminol</td><td>Uygulaması</td><td>A2185,0005</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Carl Roth</td><td>0082.3</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</sub</td><td>>Carl Roth</td><td>2189.2</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Carl Roth</td><td>HN00.2</td><td></td></tr><tr><td>Na-Laktat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71718-10G</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Gr&uuml; ssing</td><td>121551000</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5493-1L</td><td></td></tr><tr><td>p-Kumarik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9008-1G</td><td></td></tr><tr><td>poli-D-lizin hidrobromür</td><td>Corning</td><td>354210</td><td></td></tr><tr><td>PEI</td><td>Polysciences</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin</td><td>Thermo Fisher (Gibco)</td><td>11548876 (15140-122)</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Carl Roth</td><td>6367.1</td><td></td></tr><tr><td>PNGase F</td><td>NEB</td><td>P0704L</td><td></td></tr><tr><td>Proteaz İnhibitörü</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>PVDF membran Immobilon-P</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>Yağsız Süt Tozu&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>70166</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum dodesil sülfat (SDS)</td><td>Carl Roth</td><td>CN30.2</td><td></td></tr><tr><td>Tetrazin-Cy3</td><td>Jena Bioscience</td><td>CLK-014-05</td><td></td></tr><tr><td>Tetrametiletilendiamin (TEMED)</td><td>Carl Roth</td><td>2367.3</td><td></td></tr><tr><td>trans-Siklookten-L-lizin (TCO*K)</td><td>Sichem</td><td>SC-8008</td><td></td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Carl Roth</td><td>3051.4</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin% 2.5</td> <td>Thermo Fisher (Gibco</td> <td>15090046</td><td></td>),</tr><tr><td>Tween 20</td><td>Carl Roth</td><td>9127.2</td><td></td></tr><tr><td>Wasserstoffperoxid (% 30)</td> <td>Merck</td><td>1.07210.0250</td><td></td></tr><tr><td><güçlü > Hücre hatları< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK293 hücreleri</td><td>Alman Koleksiyonu Mikroorganizmalar ve Hücre Kültürleri GmbH (DSMZ)</td><td>ACC-305</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T hücreleri</td><td>Alman Mikroorganizmalar ve Hücre Kültürleri Koleksiyonu GmbH (DSMZ)</td><td>ACC-635</td><td></td></tr><tr><td>Ekipman</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Crosslinker Bio-Link 365 nm</td><td>Bio-Budget Technologies GmbH</td><td>40-BLX-E365</td><td>5 x 8 Watt tüpler</td></tr><tr><td>Plaka Okuyucu BMG LABTECH FLUOstar Omega&nbsp;</td><td>BMG LABTECH</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>strong>Plasmids</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasmid E2AziRS</td> için huminize edilmiş gen, <td>insan U6 promotörü tarafından tahrik edilen baskılayıcı tRNA Bst-Yam'ın 4 tandem kopyasını ve bir PGK promotörü tarafından tahrik edilen Azi-tRNA sentetazın (EAziRS) geliştirilmiş varyantı için insanlaştırılmış bir genin bir kopyasını içeren</td> <td>Geneart (Life Technologies)</td><td></td> tarafından sentezlendi</tr>.<tr><td>POI-TAG mutant plazmitleri</td><td></td><td></td><td>CMV promotörü tarafından tahrik edilen POI'yi kodlayan plazmid, C-terminal olarak FLAG-tag'e kaynaşmış, istenen pozisyonda bir TAG kodonu taşıyan&nbsp;</td></tr><tr><td>PC3.1'in MCS'sinde Klonlanan</td> <td>CRF1R-95TAG-EGFP</td> PCDNA3.1 Arrestin3-FLAG'in MCS'sinde Klonlanan CRF1R-EGFP <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Genart (Life Technologies) tarafından sentezlendipcDNA3.1'in</td><td></td> <td>MCS'sinde klonlandı</td></tr><tr><td><güçlü>Antikorlar</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-FLAG-HRP M2 antikor konjugatı&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8592&nbsp;</td><td>monoklonal, fare klonu M2'de üretilir</td></tr><tr><td>Keçi-anti-tavşan-HRP antikoru</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2004</td><td></td></tr><tr><td>Tavşan-anti-CRF antikoru</td><td>ev yapımı</td><td>PBL #rC69</td><td>poliklonal Turnbull, A.V., Vaughan, J., Rivier, J.E. ve Vale, W.W. Endokrinoloji, 140, (1), 71-78 (1999)</td></tr><tr><td>Tavşan-anti-Ucn1 antikoru</td><td>ev yapımı</td><td>PBL #5779</td><td>poliklonal Turnbull, A.V., Vaughan, J., Rivier, J.E. ve Vale, W.W. Endokrinoloji, 140, (1), 71-78 (1999)</td></tr></tbody></table>

kimyasal ve genetik eklenmesi en iyi duruma getirme gpcrs fotoğraf-çapraz eşleme ve canlı memeli hücreleri bioorthogonal kimyada probları

Optimizing the Genetic Incorporation of Chemical Probes into GPCRs for Photo-crosslinking Mapping and Bioorthogonal Chemistry in Live Mammalian Cells

Kanonik olmayan amino asitler (ncAAs) yolu ile amber stop kodonu bastırma genetik birleşme yapay sonda ve reaktif moieties proteinleri üzerine doğrudan canlı hücre içinde yüklemek için güçlü bir tekniktir. Her ncAA ana bilgisayar organizma ithal bir adanmış ortogonal bastırıcı-tRNA/amino-asil-tRNA-sentetaz (AARS) çifti tarafından kurulmuştur. Farklı ncAAs birleşme verimliliğini büyük ölçüde farklılık gösterebilir ve bazı durumlarda yetersiz. Ortogonal çiftleri AARS veya tRNA manipüle ederek geliştirilebilir. Ancak, yönlendirilmiş evrim tRNA veya büyük kütüphaneler ve ölü/canlı seçim yöntemlerini kullanarak AARS değildir uygun memeli hücrelerinde. Burada, dik memeli hücreleri çiftinde verimliliğini değerlendirmek için bir facile ve sağlam Floresans tabanlı tahlil sunulur. Tahlil onlarca AARS/tRNA değişik bir orta çaba ile ve makul bir süre içinde yüzlerce tarama sağlar. Kullanım pyrrolysine ortogonal sisteminin performansını önemli ölçüde artıran yeni tRNA oluşturmak için bu testin anlatılan, ncAAs uygulamaya G-protein çalışmanın yanı sıra nesneleri ncAA için zorlu reseptörleri (GPCRs), birleşince mutagenesis. İlk olarak, sistematik bir reseptör ekstraselüler yüzeyi boyunca fotoğraf-crosslinking ncAA birleşmeyle, bozulmamış reseptör üzerinde farklı ligandlar bağlama siteleri doğrudan canlı hücre içinde eşleştirilir. İkinci, son nesil ncAAs bir GPCR birleşmeyle, floresan bir boya ile ultrafast katalizör-Alerjik reseptör etiketleme, hangi bioorthogonal zorlanma terfi ters Diels Alder cycloaddition (SPIEDAC) canlı hücre üzerinde olağanüstü başarı gösterilmiştir. NcAAs genellikle herhangi bir protein boyutuna üzerinde bağımsız olarak uygulanabilir gibi uygulamalar için genel ilgi yöntemidir. Buna ek olarak, ncAA birleşme herhangi bir özel ekipman gerektirmez ve standart Biyokimya laboratuvarlarında kolayca gerçekleştirilir.

Floresans tahlil anahat şekil 1' de tasvir edilir. Tahlil üç uygulamalarda istihdam edilmektedir. İlk etapta tRNA türevleri Lys(Boc) Pyl ortogonal çifti tarafından birleşme için bir dizi ekranlı. Lys(Boc) Pyl için sterically benzer bir amino asittir. Pyl ticari olarak mevcut olmadığı gibi Lys(Boc) standart bir substrat PylRS için yaygın olarak kullanılır. Filtrelenmiş tRNA tRNA üzerinde temel alanPyl. Her tRNA değişken tek üsleri veya baz-çifti dön...

Facile Floresans tahlil kanonik olmayan amino-asit (ncAAs) memeli hücrelerinde proteinlerin içine birleşmeyle amino-asil-tRNA-sentetaz/tRNA çiftleri verimliliğini değerlendirmek için sunulmuştur. G-protein birleştiğinde reseptörleri (GPCRs) çalışmaya ncAAs uygulanması siteleri ve bioorthogonal GPCR canlı hücreleri üzerinde etiketleme bağlama fotoğraf-çapraz eşleme dahil olmak üzere açıklanır.

Kimyasal ve genetik eklenmesi en iyi duruma getirme GPCRs fotoğraf-çapraz eşleme ve canlı memeli hücreleri Bioorthogonal kimyada probları

The genetic incorporation of non-canonical amino acids (ncAAs) via amber stop codon suppression is a powerful technique to install artificial probes and ...

Bu protokolün genel amacı, protein-protein etkileşim yüzeylerinin haritalanması ve yüzey reseptörlerinin biyoortogonal etiketlenmesi dahil olmak üzere canlı hücre ortamlarındaki biyolojik soruların üstesinden gelmek için memeli hücrelerine kanonik olmayan amino asitlerin dahil edilme oranını arttırmaktır. Kehribar kodon bastırma kullanılarak, farklı kanonik olmayan amino asitler farklı verimliliklerle birleştirilir. Memeli hücrelerinde kanonik olmayan amino asitlerin dahil edilme oranlarını kısa sürede kolayca karşılaştırmak için floresan testi oluşturduk.Foto-çapraz bağlanan, kanonik olmayan amino asitlerin GPCR yüzeylerimiz boyunca sistematik olarak dahil edilmesi, ligand bağlanma bölgelerinin haritalanmasına olanak tanır ve doğrudan yaşam hücresinden alım reseptörü hakkında değerli bilgiler sağlar. Biyoortogonal kimya için son nesil, kanonik olmayan amino asitleri dahil ederek, canlı memeli hücrelerinde üst düzey görüntüleme uygulamaları için küçük, parlak floroforlarla GPCR'lerin bölgeye özgü, süper hızlı, katalizörsüz etiketlemesini sağlıyoruz. İlk olarak, iki altı oyuklu plakada oyuk başına iki mililitre tam büyüme ortamında 600.000 HEK 293 hücresi tohumlayın.Numune sayısı ka

optimizing-genetic-incorporation-chemical-probes-into-gpcrs-for-photo

Research

JoVE Journal

Chemistry

Kimya

Işıksal çözülmesi iki foton mikroskobu görüntüleme sistemi kullanılarak, piksel düzeyinde Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET) verimlilik haritaları, homo-oligomerik komplekslerini oluşturmak için hipotez membran reseptörleri hücre elde edilir. Verimlilik haritaları FRET, çalışma kapsamında oligomer kompleksi hakkında stokiyometrik bilgi tahmin etmek mümkün.

Işıksal Çözülmüş İki foton Mikroskop kullanarak G Protein Coupled Reseptör Etkileşmeleri in vivo Niceleme

Biz GPCRs çeşitli hedef konumlarda doğal olmayan amino asit, p-azido-L-fenil alanin-kodlayan ve genetik olarak farklı uygulamalarda Azido grubunun çok yönlülüğünü gösterir. Bunlar, bir GPCR olan ligand bağlama cebinde tortuları tanımlamak için hedef foto-çapraz teknolojisi ve bir peptid epitop ya da flüoresan probu ile GPCRs alana özgü bioorthogonal modifikasyonunu içerir.

Genetik olarak kodlanmış Molecular Probes G protein-bağlanmış alıcılar Çalışması için

Burada, fotoafinite etiketlemesi kullanarak küçük molekül bağlayıcı proteinlerin tanımlanması için bir yöntem açıklıyoruz. Bu tekniğin avantajı, hedef proteinlerin bağlanma ve kovalent etiketlemesinin canlı hücresel ortamda gerçekleşmesi ve hücre lizizi üzerine doğal protein yapısını ve bağlanma koşullarını bozma riskini ortadan kaldırmasıdır.

Canlı hücre fotoafinite Etiketleme tarafından Yerli Hücresel Ortamında Küçük Molekül bağlayıcı proteinlerin belirlenmesi

Burada, salınım bilgi hücre hücre aktarımı optogenetic denetimi tarafından analiz ve gen ifadesi izleme yaşamak için bir protokol mevcut. Bu yaklaşım çok hücreli sistemlerinde fonksiyonel önemini dinamik gen ifade programları test etmek için benzersiz bir platform sağlar.

Bir Optogenetic kontrol etmek ve hücre-hücre etkileşimleri gen ifade desenleri analiz yöntemi

GPCR-β-tutucu etkileşimleri GPCR uyuşturucu keşfi 'nde ortaya çıkan bir alandır. Canlı sistemlerde bu tür etkileşimleri izlemek için doğru, hassas ve kolay ayarlanabilir Yöntemler gereklidir. Biz gerçek zamanlı yaşam hücrelerinde GPCR-β-tutucu etkileşimleri izlemek için yapısal bir uluslara tahlil göstermek, ve herhangi bir GPCR uzatılabilir.

İzleme GPCR-β-arrestin1/2 etkileşimleri gerçek zamanlı yaşam sistemleri Ilaç Discovery hızlandırmak için

cDNA'nın kinetik çapraz bağlanması ve analizi, canlı hücrelerdeki protein-RNA etkileşimlerinin dinamiklerinin yüksek zamansal çözünürlükte araştırılmasını sağlayan bir yöntemdir. Burada protokol, maya hücrelerinin büyümesi, UV çapraz bağlama, hasat, protein saflaştırma ve yeni nesil dizileme kütüphanesi hazırlama adımları dahil olmak üzere ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.

χCRAC Kullanarak Yüksek Zamansal Çözünürlükte Protein-RNA Etkileşim Dinamiğinin İn Vivo İzlenmesi

Işığa duyarlı memeli hücrelerini güvenilir bir şekilde kontrol etmek, optogenetik yöntemlerin standardizasyonunu gerektirir. Bu amaca yönelik olarak, bu çalışma, negatif geri beslemeli bir optogenetik gen devresini vaka çalışması olarak kullanarak ışığa bağlı gen ekspresyonunun çalışmasını standartlaştırmak için gen devresi yapımı, hücre mühendisliği, optogenetik ekipman çalışması ve doğrulama testlerinin bir boru hattını özetlemektedir.

Memeli Hücrelerinde Kararlı Optogenetik Gen Devrelerinin Güvenilir Mühendisliği ve Kontrolü

Modern floresan etiketleme tekniklerini kullanarak canlı hücrelerdeki membran reseptör dinamiklerini incelemek için Förster Rezonans Enerji transferi (FRET) ile birlikte canlı hücre çift renkli floresan çapraz korelasyon spektroskopisi (FCCS) gerçekleştirmek için deneysel bir protokol ve veri analizi iş akışı sunuyoruz.

Canlı Hücrelerde Protein-Protein Etkileşimi ve Protein Dinamiklerini incelemek için Çift Renkli Floresan Çapraz Korelasyon Spektroskopisi

Bu makale, genetik kod genişlemesi (GCE) bölgesini kullanarak Salmonella salgılanan efektörlerini spesifik olarak etiketlemek ve doğrudan stokastik optik rekonstrüksiyon mikroskobu (dSTORM) kullanarak HeLa hücrelerinde salgılanan proteinlerin hücre altı lokalizasyonunu görüntülemek için basit ve açık bir protokol sunmaktadır...

Genetik Kod Genişlemesi Kullanılarak Bakteriyel Salgılanan Proteinlerin Süper Çözünürlüklü Görüntülenmesi

Bu çalışmada, rekombinant G proteinine bağlı reseptörler (GPCR'ler) üzerindeki küçük molekül kütüphanelerini taramak için 384 kuyucuklu plakalar için yüksek verimli, hücre içi kalsiyum floresan testi açıklanmaktadır. Hedef, sığır ateşi kenesinden kinin reseptörü, Rhipicephalus microplus, CHO-K1 hücrelerinde eksprese edilir. Bu tahlil, aynı hücreleri tek bir "çift eklemeli" tahlilde kullanarak agonistleri ve antagonistleri tanımlar.

Rekombinant G Proteinine Bağlı Reseptörlerin Yüksek Verimli Taraması için "Çift İlaveli" Bir Kalsiyum Floresan Testi

Bu çalışma, HEK293T hücrelerinde ışıkla indüklenebilir gen ekspresyonunu optimize etmek için 3D baskılı bir LED dizisi kullanan yüksek verimli deneyler için bir yöntemi açıklamaktadır.

Memeli Gen Ekspresyonunu Kontrol Etmek için Işıkla İndüklenebilir Bir Sistemin Hızlı Optimizasyonu

Öğrenin, memeli hücrelerinde GPCR'lerin fotoğraf-çapraz eşleme ve biyoortogonal etiketleme yöntemleriyle protein-protein etkileşim haritalaması ve canlı hücre görüntüleme uygulamaları.

Kimyasal ve genetik eklenmesi en iyi duruma getirme GPCRs fotoğraf-çapraz eşleme ve canlı memeli hücreleri Bioorthogonal kimyada probları (Video) | JoVE Journal

Kimyasal ve genetik eklenmesi en iyi duruma getirme GPCRs fotoğraf-çapraz eşleme ve canlı memeli hücreleri Bioorthogonal kimyada probları

Daha fazla video keşfet