Situ dinamik ışık saçılma ile birleştiğinde kristalizasyon büyüyen Protein kristalleri kullanarak farklı boyutları ile otomatik

Bu yöntem, Hamburg Ultra Hızlı Görüntüleme Merkezi tarafından araştırıldığı gibi, çekirdeklenme zaman noktası, kristal büyüme mekanizması veya nano / mikro kristallerin nasıl hazırlanacağı gibi protein kristalizasyonu alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, numune evriminin gerçek zamanlı olarak izlenmesi ve farklı kristalleşme aşamalarında çözeltideki partiküllerin radyal dağılımı gibi değerli bilgilerin elde edilmesini sağlamasıdır. Bu yöntem, protein mikro kristalizasyonu hakkında bilgi sağlayabilse de, klasik kristalografi için kullanılan proteinler veya nötron kırınımı için kullanılacak büyük protein kristallerinin büyümesi için de kullanılabilir.

Bu yöntemin görsel gösterimi, benzersiz bir kristalizasyon cihazının çalışma prensibini gösterdiği için önemlidir. Başlamak için, 2 mikron steril şırınga filtresi kullanarak 16 mililitre 1.2 molar sodyum tartrat çözeltisi ve 16 mililitre damıtılmış suyu süzün. Çökeltici ve su şişelerini filtrelenmiş çözeltilerden beş mililitre ile doldurun.

Ardından şişeleri deney odasının pompa tutucularına monte edin. Yazılım penceresinde, deneysel parametreleri 20 santigrat derece sıcaklık, 20 bağıl nem ve çözücü olarak su ile ayarlayın. Deney odasının ön kapısını açın ve lamel taşıyıcıyı çıkarın.

Taşıyıcının üzerine temiz ve silikonlu bir lamel yerleştirin ve tekrar cihaza yerleştirin. Çevresel koşulları güvence altına almak için deney odasını kapatın. Metin protokolünde bulunan ana pompa özelliklerini kullanarak Pompa Sıfır'ı açın ve bir su akışı oluşturun.

Belirlenen ayar vidasını manuel olarak çalıştırarak konumu lamel merkezine doğru hedefleyerek su akışını ayarlayın. Pompa Sıfır'ı kapatın, ardından Pompa Bir'i açın ve daha önce olduğu gibi bir sıvı akışı oluşturun. Pompa Bir'in akış konumunu Pompa Sıfır için sabitlenen konuma ayarlayın.

Pompa Bir'i kapattıktan sonra, kristalleşme deneyi için kullanılmış lamel yeni, temiz bir lamel ile değiştirin. Yazılım paketini kullanarak yeni bir deneysel dosya oluşturun. Deney dosyasında, proteini Thaumatococcus daniellii'den Thaumatin olarak girin; protein konsantrasyonu mililitre başına 14 miligram, çökeltici sodyum tartrat ve çökeltici konsantrasyonu 1.2 molar'dır.

Bu bilgiyi etkinleştirmek için yeni deney dosyasını yükledikten sonra, Pompa Sıfır'ı kullanarak küçük bir su damlası ekleyerek protein damlası üzerindeki konumu işaretleyin. Mikro teraziyi sıfırlamak için Tara'düğmesine basın. Deney odasının üst kapağını açın ve su işaretinin üzerine 8 mikrolitre Thaumatin solüsyonu pipetleyin.

Yeni Thaumatin damlasını kaydetmek için, önce Yeni Damla'deneysel dosyadan başlangıç koşullarını ilişkilendirmek için. Ardından, damlacıktan suyun doğal buharlaşmasını telafi etmek için Sabit' düğmesine tıklayın. Pump Zero'nun protein damlasını hedefleyip hedeflemediğini kontrol etmek için CCD kamerayı kullanın.

Su akışı damlanın dışına nişan alıyorsa Pompa Sıfır'ın konumunu yeniden ayarlayın. DLS lazeri açın ve ayar vidalarını kullanarak lazer ışınını protein damlasına yerleştirin. 60 saniyelik ölçüm süresi, iki ölçüm arasında bekleme süresi 10 saniye ve ölçüm sayısı 300 olan DLS parametrelerini girin.

DLS ölçümlerini başlatmak için Başlat düğmesine tıklayın. DLS grafik gösterimlerinden birini seçerek örneğin kalitesini kontrol edin. Buharlaşma adımının koşullarını, metin protokolünde gösterildiği gibi program tablosuna girin.

Ardından Otomasyon düğmesine tıklayarak numune buharlaştırma adımını etkinleştirin. Numune buharlaştırma adımı bittiğinde Durdur düğmesine tıklayın. Damlacığın ağırlığını sabit tutmak için sabit düğmesini etkinleştirin.

Bu özellik, doğal numune buharlaşması olasılığını telafi edecek ve daha fazla önlem alınana kadar herhangi bir konsantrasyon değişikliğinin meydana gelmemesini sağlayacaktır. Ardından, metin protokolünde listelendiği gibi zamanlama tablosuna çökeltici ekleme adımının koşullarını girin. Otomasyon düğmesine tıklayarak hızlı toplama adımını etkinleştirin.

Kristalleşme damlacığının zaman içindeki gelişimini izlemek için, CCD kamerayı kullanarak Taumatin kristallerinin görünümünü kontrol edin. DLS grafik gösterimlerini kullanarak parçacık boyutu dağılımını kontrol edin. Ayrıca, ekran penceresini kullanarak ağırlık ve deneysel parametrelerin gelişimini kontrol edin.

Bu pencerede gösterilen tüm bilgiler, kristalleşme sırasındaki ağırlık değişikliklerine dayalı olarak gerçek zamanlı olarak hesaplanır ve görüntülenir ve bu bilgiler ultra hassas terazi tarafından çevrimiçi olarak kaydedilir. Tabağa 3 mililitre parafin yağı ekleyerek temiz bir standart Terasaki plakasını kaplayın. Yağın 72 kuyunun tamamını kaplaması için plakayı farklı açılarda hafifçe hareket ettirerek parafin yağını plaka kuyularına boşaltın.

Plaka üzerinde yüzen yağı dökerek fazla parafin yağını çıkarın. Kristalizasyon deneyini bitirmek için Durdur düğmesine tıklayın. Kristalizasyon damlacığını içeren numune taşıyıcıyı dikkatlice çıkarın.

Bir pipet kullanarak, Terasaki plakasının kuyucuklarına kristalizasyon damlasının iki mikrolitrelik alokotunu yerleştirin. Yağ altındaki bir plakadaki kristalleşme damlasının geri kazanılmasıyla, numune, bir mikroskop veya Terasaki plakalarıyla çalışan diğer diyolist teknikler kullanılarak kristal büyümesinde stabilite açısından periyodik olarak kontrol edilebilir. Burada gösterilen, monomerik proteinden çekirdeklerin, nano-kristallerin ve mikro kristallerin oluşumuna doğru tüm kristalleşme süreci boyunca protein damlasındaki partikül boyutunun büyümesini gösteren bir yarıçap grafiği dağılımıdır.

Burada grafikler, hesaplanan protein konsantrasyonu ve çökeltici konsantrasyonu ile birlikte protein damlacığının ağırlığı için zaman içindeki evrimi temsil eder. Burada, deneyin sonunda Thaumatin mikro kristallerinin kaydedilmiş bir fotoğrafı gösterilmektedir. Damlacık, protein çözeltisine doymuş çok bol miktarda küçük mikro kristal gösterir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde yapılırsa bir saat 30 dakika içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, mikro dozaj sistemlerindeki DLS lazeri protein damlacığına ayarlamanız önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, bir protein örneğini başarılı bir şekilde kristalize etmek için bu kristalizasyon cihazının nasıl kolayca kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız.

Bu yöntem, kristalizasyon damlacığına doğrudan bağlı olan yerinde dinamik ışık saçılımı sayesinde mümkündür. Bu, yarıçap dağılımındaki tüm değişiklikleri izlememize olanak tanır ve bu nedenle, kristalleşme veya protein çökelmesi için belirli dağılım modellerini belirleyebiliriz. Bu prosedürü takiben, ek soruları yanıtlamak ve çözeltideki mikrometre altı boyutlu parçacıkların kristal durumunu doğrulamak için kriyo-elektron mikroskobu veya elektron kırınımı gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

Bu tekniğin çıkarımları, iki aşamalı çekirdeklenme teorisine doğru uzanır, çünkü DLS haritaları, kristal büyümesinden önce olan çözeltideki parçacıkların çift boyutlu bir dağılımının net bir modelini göstermektedir.