Laboratuvar konut, turkuaz Killifish (Nothobranchius furzeri) için bir iletişim kuralı

Bu protokolün genel amacı, yaşlanma ve yaşa bağlı hastalıkları hızlı ve yüksek verimli bir şekilde incelemek için turkuaz killifish'ten oluşan bir laboratuvar kolonisini başarılı bir şekilde yetiştirmektir. Bu yöntem, tek gen mutasyonlarının veya çevresel müdahalelerin omurgalı türlerinde yaşlanma sürecini modüle edip edemeyeceği gibi yaşlanma alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, temel protokollerimizi takip ederek, birkaç laboratuvarın artık turkuaz killifish kullanarak deneyler yapabilmesidir.

Genel olarak, bu yönteme yeni olan bireyler, killifish yetiştiriciliğinin bazı benzersiz özelliklere sahip olması nedeniyle mücadele edeceklerdir. Örneğin, embriyolar, zebra balığı gibi kanonik balık modellerinden çok farklı olan yumurtadan çıkmadan önce kuru bir alt tabaka üzerinde büyütülür. Başlamak için, her biri beş haftalık bir erkek ve iki altı ila yedi haftalık dişi ile 9,5 litrelik üreme tankları kurun.

Daha sonra plastik bir kabı yaklaşık iki ila üç santimetre derinliğinde otoklavlanmış kumla doldurun ve kum havuzunu üreme tankının ortasına yerleştirin. Turkuaz killifish'in sürekli üremesine izin verin ve embriyo kuluçkalığı için haftada bir kez embriyoları toplayın. Transgenik hatların enjeksiyonu ve üretilmesi için kullanılacak bir hücre aşaması embriyolarını hasat etmek için, az önce gösterildiği gibi bir erkek ve iki dişi balıkla bir üreme tankı kurun.

Embriyo toplamadan iki gün önce, erkeği ayrı bir tanka aktarın ve yetişkin dişilerle görsel temas halinde tutun. Toplama gününde, erkeği ve bir kum havuzunu üreme tankına ekleyin ve balığın iki saat boyunca yumurtlamasına izin verin. Yumurtladıktan ve kum havuzunu tanktan çıkardıktan sonra, kum havuzunu bir süzgecin içine boşaltın ve durulamak için sistem suyunu kullanın.

Daha sonra süzgeci kısmen sistem suyuna batırın ve embriyoların merkezde bir araya gelmesi için hafifçe döndürün. İki mililitrelik bir Pasteur pipeti kullanarak embriyoları toplayın ve yaklaşık 40 mililitre sistem suyu ile 90 milimetrelik bir Petri kabına aktarın. Işık mikroskobu altında, Petri kabındaki embriyoları inceleyin ve yırtılmış bir koryon ve hasar belirtileri gösterenleri çıkarın.

Embriyoları metin protokolüne göre ağarttıktan sonra, maviye boyanacak ölü embriyoları inceleyin ve çıkarın. Embriyoların taze metilen mavisi solüsyonunda inkübe edilmesine izin verildikten sonra, geliştirilen embriyoların görünür siyah gözlere sahip olup olmadığını kontrol edin. Daha sonra tek kullanımlık bir Pasteur pipeti veya ince kavisli cımbız kullanarak embriyoları bir filtre kağıdı plakasına aktarın.

Gelişmemiş embriyoları metilen mavisinde tutun ve günlük olarak izleyin. Siyah gözler geliştikten sonra, onları katı substrat ortamına aktarın. Forseps ile embriyoları yaklaşık beş milimetre aralıklarla 90 milimetrelik plaka başına 100 embriyoya kadar yayın.

Daha sonra çanağı kapatmak için parafin kullanın ve embriyoları tamamen altın süsen geliştirene ve yumurtadan çıkmaya hazır olana kadar iki ila üç hafta boyunca 28 santigrat derecede inkübe edin. Bir yıla kadar uzun süreli depolama için, metilen mavisi çözeltisinde üç gün boyunca inkübasyonun ardından, embriyoları az önce gösterildiği gibi katı substrat orta plakalarına aktarın ve 17 santigrat derecede inkübe edin. Balıkları yumurtadan çıkarmak için, 50 ila 100 gelişmiş embriyoyu kuluçka kutusuna dikkatlice aktarmak için ince kavisli cımbız kullanın ve bunları dört santigrat derecede iki santimetreden daha derin olmayan hümik asit çözeltisine tamamen daldırın.

Bu protokoldeki kritik bir adım, kuru bir substrat üzerinde inkübe edilen embriyoların yeterli havalandırma ile sağlanan hümik asit içeren bir kuluçka çözeltisine aktarılmasıyla elde edilen killifish embriyolarının kuluçkalanmasıdır. Kuluçka kutusunu bir kapakla örtün ve bir kuluçka makinesinde 28 santigrat derecede inkübe edin. Yeterli havalandırma sağlamak için kutuyu borulu bir hava kaynağına bağlayın.

Kuluçka kutusunda yeterli su kalitesini korumak için, yumurtadan çıktıktan sonraki günden itibaren günde bir kez, kutuyu iki santimetrelik bir nihai derinliği koruyarak bire bir oranında otoklavlanmış sistem suyu ile doldurun. Yumurtadan çıkmamış embriyoları katı alt tabakaya geri aktarın ve bir hafta sonra yumurtadan çıkmayı deneyin. Yavru ve yetişkin balıkları yumurtadan çıktıktan beş gün sonra yetiştirmek için, 400 mikrometre yavru süzgeci ile donatılmış 0,8 litrelik tank başına beş yavruyu dikkatlice aktarmak için tek kullanımlık plastik pipetler veya plastik bir kaşık kullanarak yavruları su devridaim sistemine taşıyın.

14 günlükken, yavru balıkları 850 mikrometre yavru süzgeci ile donatılmış 2,8 litrelik bir tanka aktarın. Bu noktadan itibaren, her tankı bir balık kimliği ile etiketleyin.Hayatta kalma tahlilleri için, her balığı ayrı ayrı tek bir tankta barındırın. Hayatta kalma testleri için yetiştirilen balıklar da ayrı ayrı 2,8 litrelik bir tankta barındırılır.

Takip eden yedi gün boyunca, yavruları günde iki kez, bir ila üç canlı kan kurdu ile desteklenmiş beş mililitre salamura karides ile besleyin. Dört haftalıkken, her balığı günde iki kez salamura karides ve bir mililitre kan kurdu ile besleyin. Bu aşamada, erkeklerde renklenme belirtileri olan büyük sırt, anal ve kuyruk yüzgeçlerinin ve dişilerde yumurta dolu yuvarlak karınların varlığını kontrol ederek balığın tam cinsel olgunlaşmaya ulaştığından emin olun.

Burada gösterilen, 70 erkek turkuaz killifish için temsili bir hayatta kalma eğrisidir. Uygun hayvancılık, GRZ suşunda 12 ila 28 hafta arasında değişen medyan sağkalım ile sonuçlanır. Ortalama sağkalımdaki değişiklikler diyete, beslenme sıklığına ve konut sıcaklığı koşullarına bağlıdır.

Yetersiz hayvancılık altında yetiştirilen balıklar için hayatta kalma eğrisi, optimal hayvancılık koşulları altında yetiştirilen balıklarla karşılaştırıldığında, erken ölüm oranlarında bir artış ve zaman içinde hayatta kalmada tekrarlayan ani düşüşler ortaya koymaktadır. Bu protokolü takip ederken, yumurtadan yeni çıkmış yavruların su durumunu ve fazla yiyeceği yakından izlemek önemlidir, çünkü bunların temiz bir ortamda muhafaza edilmesi çok önemlidir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, araştırmacıların turkuaz killifish'te transgenez, genom düzenleme ve diyet manipülasyonları dahil olmak üzere deneysel manipülasyonları keşfetmelerinin yolunu açtı.

Bu videoyu izledikten sonra, turkuaz killifish'in laboratuvarda nasıl başarılı bir şekilde yetiştirileceğini iyi anlamalı ve bu modeli, esaret altında yetiştirilebilecek en kısa ömürlü omurgalılarda yaşlanma biyolojisini keşfetmek için kullanmalısınız.