Name: Vivo içinde kalp özel gen manipülasyon farelerde Intramyocardial enjeksiyonla için basit ve etkili bir yöntem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-16T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 42 s
Description: Keşfedin yetişkin farelerde intramyokardiyal adenovirüs enjeksiyonu ile kardiyak spesifik gen manipülasyonu yöntemini. Bu teknik, kardiyovasküler araştırmalarda hızlı iyileşme ve tekrarlanabilirlik sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu eser Ulusal Bilim Fonu tarafından desteklenen ayırt edici genç akademisyenler (81625002), Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Çin (81470389, 81270282, 81601238), Program Shanghai akademik araştırma, lider (18XD1402400), Şangay belediye için Eğitim Komisyonu Gaofeng klinik tıp hibe desteği (20152209), Shanghai Shenkang hastane Geliştirme Merkezi (16CR3034A), Shanghai Jiao Tong Üniversitesi (YG2013MS42), Shanghai Jiao Tong Üniversitesi Tıp (15ZH1003 ve 14XJ10019), Shanghai yelken programı (18YF1413000) ve Bengbu Tıp Fakültesi (Byycx1722) yüksek lisans yenilik programı. Dr. Erhe Gao bizim laboratuarımızda onun önceki yardım için teşekkür ediyoruz.

Tüm hayvan deneyleri Ulusal Sağlık kurallarına Enstitüleri kullanım laboratuvar hayvanları üzerinde göre yapılmıştır ve Enstitü nün hayvan Etik Komitesi tarafından kabul edildi. Erkek C57BL/6J fareler (8-10 hafta yaşındaki) tüm deneyler için kullanılmıştır. Fareler 24 ° C ± 4 ° C, bir 12-h ışık/karanlık döngü, su ve gıda ücretsiz erişim altında patojen-Alerjik koşullarda muhafaza.
1. Adenovirus çözüm hazırlanması
<ol><li>Arıtılmış adenovirus çözüm gelişinden sonra çözüm-80 ° C dondurucuda saklayın. Not: Adenovirus enjeksiyon uygulanabilir farelerde gerçekleştirildi. Adenovirus vektör kısırlık emin olmak için adenovirus (kodlama luciferase, VDR veya VDR hedefleme shRNA) hazırlanmıştır ve ticari olarak9,10saf.</li>
	<li>İşlem gününde,-80 ° C dondurucudan arıtılmış adenovirus çözüm (3 x 1010 plak oluşturan birimler [pfu] /mL) almak ve adenovirus vektör çözüm buz çözme.</li>
	<li>Bir sağlamlılık, steril eldiven ve steril elbise giy.</li>
	<li>50 µL hazırlamak gün operasyon öncesi sterilize Hamilton şırınga. Not: sterilizasyon için Hamilton şırınga gazlı bez içinde sarılmış ve bir yüksek sıcaklık/yüksek basınç sterilizasyon yerleştirilir. "Sterilizasyon masif" modu seçildi ve sterilizasyon "Başlat" düğmesine basarak başladı.</li>
	<li>Tam saf adenovirus çözümü çözdürme sonra % 75 etanol ile adenovirus solüsyon içeren tüp sprey ve adenovirus çözüm laminar akış steril kukuIeta taşıyın.</li>
	<li>Laminar akış steril başlık, Hamilton şırınga 30 G iğne eki tarafından takip bir iğne olmadan Hamilton şırınga kullanarak 50 µL adenovirus çözüm Aspire edin.</li>
	<li>Şırınga 30 G iğne ile yukarı doğru tutun ve iğne (iğne ucu ilk çözüm Damlalar görünümünü tarafından teyit) adenovirus Çözümle doldurulana kadar şırınga pistonu yavaşça itin. Not: Bu 30 G iğne doldurmak için yaklaşık 45 µL çözüm alır hemen hemen hiçbir çözüm şırıngada görünür şimdi.</li>
	<li>Dikkatli bir şekilde başka bir 30 µL adenovirus çözüm Aspire için yukarıdaki hazır şırınga kullanın ve sonraki kullanım için buz üzerinde gevşek kepli şırınga yerleştirin.</li>
</ol>2. anestezi ve ameliyat hazırlığı
<ol><li>20 mL isoflurane isoflurane Buharlaştırıcı ekleyin ve bir oksijen tankı isoflurane Buharlaştırıcı bağlanın.</li>
	<li>Vana açacağız ve oksijen isoflurane Buharlaştırıcı oksijen tankı akış. Oksijen akış hızı 2 L/dk bir oksijen akışını monitörde isoflurane Buharlaştırıcı üzerinden korumak.</li>
	<li>Fare ile % 4 isoflurane % 100 oksijen (2 L/dak) anestezi isoflurane Buharlaştırıcı bağlı bir plastik kafes 2 min için ikna etmek.</li>
	<li>Plastik kafes imzalat fareden çıkar ve yüzükoyun bir laminar akış steril başlıklı plastik bir platform üzerinde güvenli ve anestezi % 2 isoflurane % 100 oksijen (2 L/dak) ile bir burun konisi korumak.</li>
	<li>Yeterli anestezi ayak çimdik yanıt yokluğunda tarafından onaylayın.</li>
	<li>Steril oftalmik krem kurumasını kornealar korumak için her göz için geçerlidir.</li>
	<li>Göğüs ve üst karın tıraş. 1 dk. kaldırmak için depilatory krem piyasada bulunan depilatory krem traş siteye uygulamak ve kürk ile ıslak gauzes kalan.</li>
	<li>Cerrahi sitesi (sol alt kısmında göğüs) iyot-klorheksidin dayalı antiseptik (örneğin entoiodine) 3 scrubs ile sterilize. Steril örtü ile cerrahi sitesi kapak.</li>
</ol>3. Intramyocardial enjeksiyon Adenovirus fare kalbinde
<ol><li>Eldivenleri çıkarma ve steril eldiven yenisini koymak.</li>
	<li>Sterilize forseps, bir mikro-sivrisinek hemostat, Cerrahi makas ve bir gün yüksek bir operasyonda önce iğne bağı sıcaklık/yüksek basınç Sterilizatör (Adım 1.4 nota bakın).</li>
	<li>0,5 cm cilt kesi xiphoid ve koltuk altı bağlanma hattı boyunca olun. Açık açık göğüs büyük ve küçük göğüs kasları forseps ve bir mikro-sivrisinek hemostat ile incelemek.</li>
	<li>İnterkostal alanlarda ortaya çıkarmak büyük göğüs ve göğüs küçük kasları geri çeker. Aracılığıyla işlemek ve dördüncü interkostal boşluk (veya geniş interkostal boşluk gözlem ile) bir mikro-sivrisinek hemostat ile açın.</li>
	<li>Kalp kalp sigara dominant el parmağı ile hafifçe göğüs duvarında sağ tarafına basarak yansıtmak için belgili tanımlık kesme doğru itin.</li>
	<li>Yavaşça externalized kalp sigara dominant el başparmak ve işaret parmağı ile güvenli.</li>
	<li>Toplam 30 µL adenovirus çözeltinin dominant el ile üç siteleri (ventral, dorsal ve lateral duvarına sol ventrikül) adenovirus (şekil 1 c) ile dolu Hamilton şırınga üzerinden sol ventrikül Miyokardiyum içine enjekte et.</li>
	<li>Enjeksiyon tamamlanmasından sonra hemen geri İntratorasik uzaya kalp yerleştirin.</li>
	<li>El ile göğüs duvarı cilt kesi site doğru yavaşça basarak İntratorasik uzayda hava tahliye edin. Not: Başarılı hava tahliye büyük göğüs ve göğüs küçük kasları tarafından sınırdışı hava neden çırparak tarafından kanıtlanan.</li>
	<li>Deri yatay Dikiş dikiş 5-0 ipek sütür ile yakın. Not: Büyük göğüs ve göğüs küçük kasları, onlar sadece açık açık disseke ve onların anatomik yapıları işlemi arada olmadığından sütüre değil.</li>
</ol>4. ameliyat sonrası yönetim
<ol><li>Buprenorfin (3 mg/kg) iki kez günlük işlem11' den sonra ilk 48 saat için operatif ağrı azaltmak için subkutan enjeksiyon yoluyla yönetmek.</li>
	<li>İşlemden sonra hemen tamamen iyileşti kadar fareler bir ısı yastık (37 ° C) üzerinde korumak. Tamamen kurtarır sonra fareyi kafese geri getirin.</li>
	<li>Sterilize kullanılan Hamilton şırınga ve bir yüksek sıcaklık/yüksek basınç sterilizasyon içinde 30 G şırınga iğne (Adım 1.4 nota bakın). Sterilize 30 G şırınga iğne "Sharps" kap içinde toplamak.</li>
</ol>5. kardiyak Luciferase ifade ölçmek için in Vivo görüntüleme
<ol><li>Gün 5 adenovirus enjeksiyon sonra biyoluminesans 15 mg/mL Dulbecco'nın fosfat tamponlu tuz çözeltisi (DPBS), taze stok çözeltisi hazırlamak. Çözüm 0.2 µm filtreden filtre.</li>
	<li>İntra peritoneally uyanık fareler biyoluminesans eriyik vasıl 150 mg/kg vücut ağırlığı ile enjekte.</li>
	<li>Görüntüleme sistemi açın.</li>
	<li>Otomatik görüntüleme sistemi kendi kendini sınama sonra "Işıklı" olarak görüntüleme modunu seçin ve aşağıdaki ayarları yapın: pozlama: otomatik; Binning: 8; FStop: 1; Uyarma: Blok; Emisyon: açık.</li>
	<li>Biyoluminesans enjeksiyon sonra 10 dk, fareler kloral hidrat enjeksiyon (300 mg/kg vücut ağırlığı) anestezi. Yeterli anestezi ayak çimdik yanıt yokluğunda tarafından onaylayın.</li>
	<li>İmzalat fareler bir ısıtmalı görüntüleme sahnede kamera doğru yönetmen göğüs ile yüzükoyun sígara güvenli.</li>
	<li>Görüntüleri (her fare için 1 resim) toplamak ve göğüs aynı dairesel ölçüm bölgeleri (ROI) ilgi çizerek sinyalleri yoğunluğunu ölçmek.</li>
	<li>Fotoğraf topluluğu sonra farelerin kurban ve aşağıdaki bölümünde belirtildiği gibi dokularda toplamak.</li>
</ol>6. hasat dokular
<ol><li>Noktalarda farklı zaman virüs enjeksiyon (şekil 1B) sonra fare ile % 4 isoflurane, anestezi ve anestezi ile % 2 isoflurane burun konisi üzerinden korumak ve yüzükoyun plastik bir platform üzerinde güvenli.</li>
	<li>Ventral Ensizyon ön boyun olun. Şu ortak Karotid arter omohyoid ve boyun kasları geri çeker tarafından maruz.</li>
	<li>Fareler şu ortak Karotid arter transecting ve kan boşaltılmasına kurban.</li>
	<li>Ventral Ensizyon karın içinde olun. Göğüs kafesi midclavicular hattı boyunca her iki kaburga kesme ve diyafram transect.</li>
	<li>Kalp xiphoid kaldırarak maruz. Artan aort bulmak ve Perivasküler yağ dokusu yavaşça çıkarın.</li>
	<li>Aort cannulate ve retrogradely 0.5 mL 4 ° C fosfat tampon çözeltisi (PBS) ile dolu bir 1 mL şırınga bağlı 30 G iğne ile kalp sıvı.</li>
	<li>Perfüzyon sonra kalp tüketim ve sol ve sağ ventrikül bölmek. Karaciğer, akciğer ve dalak tüketim.</li>
	<li>Soğuk PBS (4 ° C) olarak iki yıkamadan sonra toplanan dokulara sıvı azot kriyojenik şişeleri ayrı ayrı saklayın.</li>
</ol>7. Protein ifade tespiti
<ol><li>Homojenizasyon arabellek piyasada bulunan lizis arabellek 1: 100 oranında içine proteaz inhibitörü kokteyl ekleyerek hazırlayın. İşlenecek örnekleri sayısına göre Toplam hacim hesaplamak. Hazırlanan homojenizasyon arabellek sonraki kullanım için 4 ° C'de tutun.</li>
	<li>Sıvı azot tankı dokulardan dışarı çıkar. Yüksek hassasiyetli ölçeklerde (yaklaşık 60 mg doku her parça için) doku tartın.</li>
	<li>Doku için yeni bir 1.5 mL microcentrifuge tüp aktarın. Hemen 200 µL homojenizasyon tampon ve precooled 1.5 mm çelik bilyalar (4 ° C) microcentrifuge tüp içine ekleyin.</li>
	<li>Precooled (4 ° C) microcentrifuge tüplerde otomatik bir doku Bileme Makinası metal sahipleri güvenli ve aşağıdaki ayarlarla makine başlatarak homojenizasyon başlamak: frekans: 70 Hz; süre: 120 s.</li>
	<li>Homojenizasyon sonra homogenate (16.000 × g, 4 ° C) santrifüj kapasitesi ve dikkatle süpernatant yeni 1.5 mL tüp 100 µL pipet ile aktarın.</li>
	<li>Yükleme eklemek tampon çözüm (5 x) süpernatant protein oranı 1:4 ve 5 min için 100 ° C'de protein denatüre.</li>
	<li>Kalp ve diğer organ dokulara protein ifade seviyelerinde daha da Western blot analizi (-den sonuçlanmak göstermek şekil 2C ve şekil 3temsilcisi) tarafından izlenen protokole göre daha önce12açıklanan.</li>
</ol>

<ol><li>Yancy, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2017+ACC%2FAHA%2FHFSA+Focused+Update+of+the+2013+ACCF%2FAHA+Guideline+for+the+Management+of+Heart+Failure%3A+A+Report+of+the+American+College+of+Cardiology%2FAmerican+Heart+Association+Task+Force+on+Clinical+Practice+Guidelines+and+the+Heart+Failure+Society+of+America%5BTitle%5D)+AND+%22J+Card+Fail%22%5BJournal%5D)">2017 ACC/AHA/HFSA Focused Update of the 2013 ACCF/AHA Guideline for the Management of Heart Failure: A Report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on Clinical Practice Guidelines and the Heart Failure Society of America.</a> J Card Fail. 23 (8), 628-651 (2017).</li>
<li>Pu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyocyte-expressed+farnesoid-X-receptor+is+a+novel+apoptosis+mediator+and+contributes+to+myocardial+ischaemia%2Freperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Heart+J%22%5BJournal%5D)">Cardiomyocyte-expressed farnesoid-X-receptor is a novel apoptosis mediator and contributes to myocardial ischaemia/reperfusion injury.</a> Eur Heart J. 34 (24), 1834-1845 (2013).</li>
<li>He, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nuclear+melatonin+receptor+ROR%CE%B1+is+a+novel+endogenous+defender+against+myocardial+ischemia_reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pineal+Res%22%5BJournal%5D)">The nuclear melatonin receptor RORα is a novel endogenous defender against myocardial ischemia_reperfusion injury.</a> J Pineal Res. (3), 313-326 (2016).</li>
<li>Yao, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+D+receptor+activation+protects+against+myocardial+reperfusion+injury+through+inhibition+of+apoptosis+and+modulation+of+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Vitamin D receptor activation protects against myocardial reperfusion injury through inhibition of apoptosis and modulation of autophagy.</a> Antioxid Redox Signal. 22 (8), 633-650 (2015).</li>
<li>He, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+liver-X-receptor+alpha+but+not+liver-X-receptor+beta+protects+against+myocardial+ischemia%2Freperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Heart+Fail%22%5BJournal%5D)">Activation of liver-X-receptor alpha but not liver-X-receptor beta protects against myocardial ischemia/reperfusion injury.</a> Circ Heart Fail. 7 (6), 1032-1041 (2014).</li>
<li>Ding, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+rAAV9+to+Overexpress+or+Knockdown+Genes+in+Mouse+Hearts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts.</a> J Vis Exp. (118), (2016).</li>
<li>Bish, L. T., Sweeney, H. L., Muller, O. J., Bekeredjian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+vector+delivery+to+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus vector delivery to the heart.</a> Methods Mol Biol. 807, 219-237 (2011).</li>
<li>Michael, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+gene+delivery+with+cardiopulmonary+bypass%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Cardiac gene delivery with cardiopulmonary bypass.</a> Circulation. 104 (2), 131-133 (2001).</li>
<li>Lei, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+Hepatic+Fatty+Acids+Uptake+and+Oxidation+by+LRPPRC-Driven+Oxidative+Phosphorylation+Reduces+Blood+Lipid+Levels%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">Increased Hepatic Fatty Acids Uptake and Oxidation by LRPPRC-Driven Oxidative Phosphorylation Reduces Blood Lipid Levels.</a> Front Physiol. 7, 270(2016).</li>
<li>Zhang, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+the+contractile+phenotype+in+corpus+cavernosum+smooth+muscle+cells+by+Myocardin+gene+therapy+ameliorates+erectile+dysfunction+in+bilateral+cavernous+nerve+injury+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Andrology%22%5BJournal%5D)">Maintenance of the contractile phenotype in corpus cavernosum smooth muscle cells by Myocardin gene therapy ameliorates erectile dysfunction in bilateral cavernous nerve injury rats.</a> Andrology. 5 (4), 798-806 (2017).</li>
<li>Virag, J. A., Lust, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronary+artery+ligation+and+intramyocardial+injection+in+a+murine+model+of+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Coronary artery ligation and intramyocardial injection in a murine model of infarction.</a> J Vis Exp. (52), (2011).</li>
<li>Mahmood, T., Yang, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blot%3A+technique%2C+theory%2C+and+trouble+shooting%5BTitle%5D)+AND+%22N+Am+J+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Western blot: technique, theory, and trouble shooting.</a> N Am J Med Sci. 4 (9), 429-434 (2012).</li>
<li>Gao, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+and+efficient+model+of+coronary+artery+ligation+and+myocardial+infarction+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">A novel and efficient model of coronary artery ligation and myocardial infarction in the mouse.</a> Circ Res. 107 (12), 1445-1453 (2010).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+protective+role+of+nuclear+melatonin+receptor+ROR%CE%B1+in+diabetic+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pineal+Res%22%5BJournal%5D)">Novel protective role of nuclear melatonin receptor RORα in diabetic cardiomyopathy.</a> J Pineal Res. 62 (3), (2017).</li>
<li>Nduhirabandi, F., Lamont, K., Albertyn, Z., Opie, L. H., Lecour, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+toll-like+receptor+4+in+melatonin-induced+cardioprotection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pineal+Res%22%5BJournal%5D)">Role of toll-like receptor 4 in melatonin-induced cardioprotection.</a> J Pineal Res. 60 (1), 39-47 (2016).</li>
<li>Wu, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JNK-TLR9+signal+pathway+mediates+allergic+airway+inflammation+through+suppressing+melatonin+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pineal+Res%22%5BJournal%5D)">JNK-TLR9 signal pathway mediates allergic airway inflammation through suppressing melatonin biosynthesis.</a> J Pineal Res. 60 (4), 415-423 (2016).</li>
<li>de Luxan-Delgado, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melatonin+reduces+endoplasmic+reticulum+stress+and+autophagy+in+liver+of+leptin-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pineal+Res%22%5BJournal%5D)">Melatonin reduces endoplasmic reticulum stress and autophagy in liver of leptin-deficient mice.</a> J Pineal Res. (1), 108-123 (2016).</li>
<li>Scofield, S. L., Singh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confirmation+of+Myocardial+Ischemia+and+Reperfusion+Injury+in+Mice+Using+Surface+Pad+Electrocardiography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Confirmation of Myocardial Ischemia and Reperfusion Injury in Mice Using Surface Pad Electrocardiography.</a> J Vis Exp. (117), (2016).</li>
<li>Cai, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+noncoding+RNA+H19+mediates+melatonin+inhibition+of+premature+senescence+of+c-kit%28%2B%29+cardiac+progenitor+cells+by+promoting+miR-675%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pineal+Res%22%5BJournal%5D)">Long noncoding RNA H19 mediates melatonin inhibition of premature senescence of c-kit(+) cardiac progenitor cells by promoting miR-675.</a> J Pineal Res. 61 (1), (2016).</li>
<li>Chua, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cardioprotective+effect+of+melatonin+and+exendin-4+treatment+in+a+rat+model+of+cardiorenal+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pineal+Res%22%5BJournal%5D)">The cardioprotective effect of melatonin and exendin-4 treatment in a rat model of cardiorenal syndrome.</a> J Pineal Res. 61 (4), 438-456 (2016).</li>
<li>Pei, H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melatonin+attenuates+postmyocardial+infarction+injury+via+increasing+Tom70+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pineal+Res%22%5BJournal%5D)">Melatonin attenuates postmyocardial infarction injury via increasing Tom70 expression.</a> J Pineal Res. 62 (1), (2017).</li>
<li>Yu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+receptor-dependent+Notch1_Hes1+activation+by+melatonin+protects+against+myocardial+ischemia-reperfusion+injury_+in+vivo+and+in+vitro+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pineal+Res%22%5BJournal%5D)">Membrane receptor-dependent Notch1_Hes1 activation by melatonin protects against myocardial ischemia-reperfusion injury_ in vivo and in vitro studies.</a> J Pineal Res. 59 (4), 420-433 (2015).</li>
<li>Yu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melatonin+rescues+cardiac+thioredoxin+system+during+ischemia-reperfusion+injury+in+acute+hyperglycemic+state+by+restoring+Notch1%2FHes1%2FAkt+signaling+in+a+membrane+receptor-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pineal+Res%22%5BJournal%5D)">Melatonin rescues cardiac thioredoxin system during ischemia-reperfusion injury in acute hyperglycemic state by restoring Notch1/Hes1/Akt signaling in a membrane receptor-dependent manner.</a> J Pineal Res. 62 (1), (2017).</li>
<li>Poggioli, T., Sarathchandra, P., Rosenthal, N., Santini, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intramyocardial+cell+delivery%3A+observations+in+murine+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Intramyocardial cell delivery: observations in murine hearts.</a> J Vis Exp. (83), e851064(2014).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Geçerli raporu miyokard infarktüsü indüksiyon bir yönteminden Gao vd tarafından güncellenmiştir kardiyak gen manipülasyon için viral vektörler intramyocardial enjeksiyon için değiştirilmiş bir teknik gösterir 13 şu anda, karakterizasyonu vivo içinde belirli bir gen fonksiyonları en sık dahil nakavt veya transgenik fareler3,14,15,16,<sup class...

Kalp hastalığı morbidite ve mortalite dünya çapında1,2önde gelen nedenidir. Miyokard İnfarktüsü ve kalp yetmezliği gibi ölümcül kalp sorunları için etkili tedavi stratejileri eksikliği temel pathomechanisms yoğun keşfi ve kimliği roman tedavi olanakları3çekiyor. Bu bilimsel keşifler için yaygın olarak kullanılan4,5kalp özel gen manipülasyon olduğunu. Kardiyak gen manipülasyon güçlü transkripsiyon harekete geçirmek gibi efektör nükleaz (TALEN) kullanarak genom düzenleyerek elde edilebilir ve düzenli olarak interspaced kısa palindromik yineler (CRISPR) kümelenmiş / CRISPR ilişkili protein 9 (Cas9) araçları, ya da Ektopik genetik malzemelerin (örneğin, virüs vektörel çizimler proteinler ilgi kodlama genleri taşıyan) teslim edilmesi6. Genom düzenleme kesin ve kronolojik zamanmekansal genom değişiklikler yaşayan fareler sağlar rağmen hala bir zaman alıcı ve emek yoğun pratik6olduğunu. Alternatif olarak,6kalp özel gen manipülasyon virüs vektör veya küçük müdahale RNA (siRNA) karmaşık teslim rutin tarafından gerçekleştirilen.
Virüs vektör teslim yetişkin fare kalp için kabaca iki stratejileri ile elde edilir: sistemik veya yerel enjeksiyon. AAVs AAV9 gibi cardiotropic serotip sistemik enjeksiyon noninvaziv kardiyak belirli bir gen manipülasyon7için. Ancak, bu yöntem vektör verimli iletim ve gen ekspresyonu için gerekli nispeten yüksek miktarda gerektirir ve kas ve karaciğer7gibi nontarget organların önemli iletim neden olabilir. Yerel virüs enjeksiyon intramyocardial enjeksiyon veya intrakoroner teslim7tarafından sağlanır. İntrakoroner teslim virüs intramyocardial enjeksiyon için karşılaştırıldığında kalp içinde daha eşit dağılımı yol açar. Ancak, bu teknik dezavantajları sistemik dolaşım ve iletim nontarget organları8ve onun gereksinimi için basınç ölçüm işlemi sırasında aygıt için viral vektörler dışarı hızlı yıkama vardır. Buna karşılık, viral olarak dağıtabilmenizi daha iyi virüs saklama Miyokardiyum yanı sıra site belirli teslim, ama başarısız intramyocardial enjeksiyon sağlar7vektör. Küçük hayvanlar için intrakoroner teslimat sistemik AAV9 enjeksiyon ve intramyocardial enjeksiyon daha yaygın olarak uygulanan4,5,7iken yapmak teknik olarak zor olur. Sistemik enjeksiyon gerçekleştirmek kolay olsa da, geleneksel intramyocardial enjeksiyon mekanik havalandırma ve Torakotomi gerektiren, geniş doku hasarına neden olur ve zaman alır.
Bu raporda, intramyocardial enjeksiyon için bir kolay, zaman tasarrufu ve yüksek verimli yöntemi açıklanmıştır. Luciferase ve VDR veya VDR, hedefleme shRNA kodlama adenovirus kardiyak gen ekspresyonu işlemek için enjekte ettiler. Hakim sonra gene manipülasyon, aynı zamanda hücreleri ve fare kalp diğer maddeleri enjeksiyonu için bu yöntem kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>< güçlü > Ekipmanlar< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Laminer akış steril başlık</td><td>Fengshi Hayvan Deneyi & nbsp; Equipment Techonology Co., Ltd. (Soochow, Çin)</td> <td>FS-CJ-2F</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Thermo Scientific (Waltham, ABD) 75005282</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Doku taşlama makinesi</td><td>Scientz Biotechnology Co., Ltd. (Ningbo, Çin)</td> <td>Scientz-48</td><td></td></tr><tr><td>Yüksek sıcaklık / yüksek basınçlı sterilizatör</td><td>Hirayama (Saitama, Japonya)</td> <td>HVE-50</td><td></td></tr><tr><td>İzofluran buharlaştırıcı ve nbsp;</td><td>Matrix (Orchard Park, ABD)</td><td>VIP3000</td><td></td></tr><tr><td>IVIS&nbsp; Lumina III görüntüleme sistemi</td><td>PerkinElmer (Waltham, ABD)</td><td>CLS136334</td><td></td></tr><tr><td>Hassasiyet&nbsp; denge</td><td>Sartorius (G&ouml; ttingen, Almanya)</td><td>28091873</td><td></td></tr><tr><td>Instruments&nbsp; </güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf pipet (100 & mikro; L)</td><td>Eppendorf (Westbury, ABD)</td><td>&nbsp; </td><td></td>4920000059</tr><tr><td>Eppendorf pipeti (10 & mikro; L)</td><td>Eppendorf (Westbury, ABD)</td><td>&nbsp; </td><td></td>4920000113</tr><tr><td>Forseps</td><td>Şangay Tıbbi Aletler (Grup) Ltd., Corp.&nbsp;</td><td>JD4020</td><td>Kavisli uçlu</td></tr><tr><td>Hamilton şırınga</td><td>Hamilton (Nevada, ABD)</td><td>80501</td><td>Cilt 50 &mu; L</td></tr><tr><td>Mikro sivrisinek hemostat</td><td>FST (Foster City, ABD)</td> <td>13011-12</td><td>Kavisli, uç genişliği 1.3mm</td></tr><tr><td>İğne tutucu ve nbsp;</td><td>Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. (Şangay, Çin)</td><td>J32110</td><td></td></tr><tr><td>Cerrahi makas</td><td>FST (Foster City, ABD)</td><td>14002-12</td><td></td></tr><tr><td>1-mL Şırınga</td><td>WeiGao Group Medical Polymer Co., Ltd. (ShangDong, Çin)</td><td></td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Malzemeler ve reaktifler</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-GAPDH antikoru</td><td>CST (Danvers,&nbsp; ABD)</td><td>#2118</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Lusiferaz antikoru</td><td>Abcam (Cambridge, İngiltere)</td><td>ab187340</td><td></td></tr><tr><td>Anti-tavşan IgG</td><td>CST (Danvers,&nbsp; ABD)</td><td>&nbsp;#7074</td><td></td></tr><tr><td>Anti-VDR antikoru</td><td>Abcam (Cambridge, İngiltere)</td><td>&nbsp; ab109234</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfin</td><td>Thermo Scientific (Waltham, ABD)</td><td>PA175056</td><td></td></tr><tr><td>Kloralik hidralar</td><td>LingFeng Chemical (ShangHai, Çin)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Kriyojenik Şişeler</td><td>Thermo Scientific (Waltham, ABD)</td><td>375418</td><td>1.8 mL&nbsp;</td></tr><tr><td>Tüy dökücü krem</td><td>Veet (Şangay, Çin)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun fosfat tamponlu tuzlu suyu&nbsp;</td><td>Gibco (Büyük Ada,&nbsp; ABD</td> <td>14040133</td><td></td></tr><tr><td>Entoiyot</td><td>LiKang (Şangay, Çin</td> <td>310132</td><td></td>),</tr><tr><td>EP tüpü</td><td>Sarstedt (Newton, ABD)</td> <td>PCR001</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Filtre Kırlangıç (Bedford, ABD)</td><td></td> <td>Gözenek boyutu 0.2 ve mikro; m&nbsp;</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Yipin İlaç Şirketi (Hebei, Çin)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Luciferin</td><td>Promega (Madison, ABD)</td> <td>P1041</td><td></td></tr><tr><td>Batı ve nbsp; leke</td><td>Beyotime (Şangay, Çin)</td> için lizis <td>tamponuP0013J</td><td>İnhibitörler olmadan</td></tr><tr><td>Oftalmik krem</td><td>Apex Laboratories (Melbourne, Avustralya))</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco (Grand Island,&nbsp; ABD)</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Proteaz inhibitörü kokteyli</td><td>Thermo Scientific (Waltham, ABD)</td><td>78438</td><td></td></tr><tr><td>5-0 ipek sütür</td><td>Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. (Şangay, Çin)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Çelik bilye</td><td>Scientz Biotechnology Co., Ltd. (Ningbo, Çin)</td><td></td> <td>Genişlik 1.5 mm</td></tr><tr><td>Şırınga iğnesi</td><td>Kindly Medical Devices Co., Ltd. (Zhejiang, Çin)</td><td></td><td>30 gauge & nbsp;</td></tr><tr><td>Sıcak mat</td><td>Warmtact Elektrikli Isıtma Technology Co., Ltd. (Guangdong, Çin)</td> <td>NF-GNCW</td><td></td></tr></tbody></table>

vivo içinde kalp özel gen manipülasyon farelerde intramyocardial enjeksiyonla için basit ve etkili bir yöntem

A Simple and Efficient Method for In Vivo Cardiac-specific Gene Manipulation by Intramyocardial Injection in Mice

Gene manipülasyon özellikle kalbinde önemli ölçüde soruşturma kalp hastalığı pathomechanisms ve tedavi potansiyellerini artırmak. Vivo kalp özel gen teslim sık sistemik veya yerel teslim tarafından elde edilir. Kuyruk ven yoluyla sistemik enjeksiyon kolay ve verimli kardiyak gen ekspresyonu rekombinant adeno ilişkili virüs 9 (AAV9) kullanarak işleme. Ancak, bu yöntem için verimli iletim vektör nispeten yüksek miktarda gerektirir ve nontarget organ gen iletim neden olabilir. Burada, intramyocardial enjeksiyon vivo içinde kalp özel gen manipülasyon farelerde için bir basit, etkili ve zaman kazandıran yöntemi açıklanmaktadır. Anestezi (havalandırma) olmadan altında göğüs birincil ve ikincil kasları açık açık disseke ve fare kalp hızlı bir şekilde dördüncü interkostal alan küçük bir kesi yoluyla el ile dışa tarafından maruz kalmış. Daha sonra luciferase (Luc) ve vitamin D reseptör (VDR) veya VDR, hedefleme kısa saç tokası RNA (shRNA) kodlama adenovirus Hamilton şırınga Miyokardiyum enjekte ettiler. Sonraki vivo içinde görüntüleme bu luciferase özellikle kalbinden başarılı bir şekilde overexpressed gösterdi. Ayrıca, Western blot analizi başarılı overexpression veya fare kalbinde VDR susturmak doğruladı. Kez hakim, bu teknik gen manipülasyon yanı sıra enjeksiyon hücreleri veya fare kalbinde nanogels gibi diğer malzemeler için kullanılabilir.

Deney Protokolü ve bazı önemli adımlar bildirilen yöntemi için şekil 1' de gösterilmiştir. İntramyocardial enjeksiyon adenovirus kodlama luciferase (Adv-luc) sonra 5 gün, adv-luc enjekte farelerde Imaging vivo içinde kalbinde olan özellikle (şekil 2A, B), luciferase sağlam overexpression belirtti. nontarget organ iletim yokluğu düşündüren Western blot analizi ile (şekil 2C),...

Burada fareler bir protokol kalp özel gen manipülasyon için mevcut. Anestezi altında fare kalpler dördüncü interkostal uzayda externalized. Daha sonra kodlama belirli genler bir şırınga vivo içinde görüntüleme ve Batı ile protein ifade ölçü tarafından takip Miyokardiyum içine enjekte edildi adenovirüse bakın analiz leke.

Vivo içinde kalp özel gen manipülasyon farelerde Intramyocardial enjeksiyonla için basit ve etkili bir yöntem

Gene manipulation specifically in the heart significantly potentiate the investigation of cardiac disease pathomechanisms and their therapeutic potential. ...

Bu prosedürün genel amacı, yetişkin farelerde intramiyokardiyal adenovirüs enjeksiyonu ile in vivo kardiyak spesifik gen manipülasyonunu sağlamaktır. Bu yöntem, kardiyovasküler araştırma alanındaki moleküler mekanizmalar ve kardiyak hasarın hizalanması ve gen terapisinin etkinliği ile ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajları, ventilasyondan muaf olması, farelerin ameliyattan hızlı bir şekilde iyileşmesi ve tekrarlanabilir ve gerçekleştirilmesinin kolay olmasıdır.Öyleyse şimdi başlayalım. İşlem gününde, saflaştırılmış adenovirüs vektör çözeltisini eksi 80 santigrat dereceden ısıtın, buz üzerinde saklayın. Adenovirüs çözüldüğünde, bir yüz maskesi, steril bir önlük ve steril eldivenler giyin.Ve adenovirüs tüpüne% 75 etanol püskürtün. Virüsü steril bir laminer akış başlığına aktarın ve 50 mikrolitre virüs solüsyonunu 50 mikrolitrelik, sterilize edilmiş bir Hamilton şırıngayına aspire edin. Şırıngaya 30 gauge bir iğne takın.Şırıngayı dik konuma getirin. İğne ucunu virüsle doldurmak için iğne ucunda bir damla çözelti görünene kadar pistonu hafifçe bastırın. Ardından, şırıngaya 30 mikrolitre daha adenovirüs solüsyonu dikkatlice aspire edin ve

a-simple-efficient-method-for-vivo-cardiac-specific-gene-manipulation

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Çok sayıda genetik manipülasyonlar ve / veya genler, proteinler, hücre ve / veya biyomalzemeler intramiyokardiyal enjeksiyonu, akut iskemi / reperfüzyon hasarı ve farelerde kronik remodeling çalışmaları zaman boyutu üzerine bindirilmiş. Bu video iskemi / reperfüzyon için mikrocerrahi prosedürleri, kalıcı koroner arter ligasyonu ve intramiyokardiyal enjeksiyon çalışmaları göstermektedir.

Enfarktüsü bir murin Model Koroner Arter ligasyon ve intramiyokardiyal Enjeksiyon

, Zaman içinde canlı organizmaların hücre füzyon izlemek için bir yöntem açıklanmıştır. Yaklaşım kullanır...

Hücre Fusion Tespit Cre-ETOX P Rekombinasyon Yaklaşım In Vivo</em

Hipertansiyon ya da miyokart enfarktüsü gibi kalp-damar hastalıkları, kemirgen modellerinde intramiyokardiyal hücre dağıtım yaygın rejeneratif çalışmalarda farklı hücre tiplerinin terapötik potansiyelini test etmek için kullanılır. Bu nedenle, ayrıntılı bir açıklama ve bu cerrahi işlemin açık bir görselleştirme küçük kemirgenler kardiyovasküler hücre tedavi analizlerin sınırlarını ve avantajlarını tanımlamak için yardımcı olacaktır.

Intramiyokardiyal Hücre Teslimat: Mürin Hearts Gözlemler

Biz, (E) 9.5 ve daha sonraki aşamalarında embriyonik gün fare embriyoları olan embriyonik veya pluripotent hücrelerinden elde edilen iç ve aşılanmış hücrelerden hücre kaderine ve fenotipi hem izlenmesi amacıyla, boyalar enjekte DNA vektörleri, virüs, ve hücreler, bir dizi yöntem tarif gelişme.

Embriyonik Fare Kalpler Gelişmekte Hücre Etiketleme ve Enjeksiyon

Ekokardiyografi perkü- intramiyokardiyal enjeksiyon sıçangil kalp gen transfer ajanları veya hücre verilmesi için etkili, güvenilir ve hedeflenebilir yaklaşımı olmaktadır. Bu protokolde belirtilen adımları izleyerek, operatör hızla bu çok yönlü, minimal invaziv teknikle yetkin olabilir.

Farelerde ultrason eşliğinde transtorasik intramiyokardiyal Enjeksiyon

Onlar insanlar kullanmak için kabul edilebilir önce kardiyak rejeneratif tıp roman tedavi stratejileri kapsamlı ve detaylı çalışmalar büyük preklinik hayvan modellerinde gerektirir. Burada, biz perkütan kontrast Ekokardiyografi güdümlü intramyocardial enjeksiyon tekniği Tavşanlarda, roman böyle tedavilerin etkinliğini test hipotez için değerli olan göstermek.

Perkütan kontrast Ekokardiyografi güdümlü Intramyocardial enjeksiyon ve hücre teslim büyük preklinik modeli

Bu yöntemde, embriyonik kalp dokuları cerrahi olarak microdissected, ayrışmış, fluorescently etiketli ve ana bilgisayar embriyonik dokuların implante vardır. Bu kişi veya doku düzeyinde gelişimsel organizasyon ektopik hemodinamik koşullar ve/veya değiştirilmiş parakrin/juxtacrine ortamlar altında eğitimi için bir platform sağlar.

Embriyonik Cardiomyocytes kuş embriyo implantasyonu Vivo için Mikroenjeksiyon tabanlı sistem

Bu protokol, farelerde miyokard enfarktüsü sonrası modRNA kullanarak ilgi genini geçici olarak düzenlemenin basit ve tutarlı bir yolunu sunar.

Miyokard Enfarktüsü Fare Modelinde Modifiye mRNA Teslimi

Bu protokol, ekokardiyografi rehberliğinde virüsün doğrudan intramiyokard enjeksiyonu ile sıçan ve fare kalplerinde transgen ekspresyonu yöntemlerini açıklamaktadır. İzole, Langendorff perfüze edilmiş kalplerin programlanmış elektriksel stimülasyonu ile kalplerin ventriküler aritmilere duyarlılığının değerlendirilmesi için yöntemler de burada açıklanmaktadır.

Kemirgen Kalplerde Viral Transgen Ekspresyonu ve Kardiyak Aritmi Riskinin Değerlendirilmesi

Bu protokol, gelişmekte olan fare kalplerinde kalp hücrelerinin elektroporasyona dayalı transgenezi için ayrıntılı bir metodolojik çerçeve sunar. Burada sağlanan video varlıkları, bu çok yönlü tekniğin öğrenilmesini kolaylaştıracaktır.

Fare Embriyonik Kalbinde Gen İletimi için Etkili Bir Transgenez Yaklaşımı

Bu makale, 29 G x 88 mm'lik bir iğne kullanılarak miyokard enfarktüsünün sıçan modellerinde ekokardiyografi kılavuzluğunda intramiyokard enjeksiyonları için optimize edilmiş bir protokolü detaylandırmaktadır. Bu teknik, terapötik ajanların doğrudan peri-enfarktüs bölgesine sağlam, kesin ve tekrarlanabilir bir şekilde verilmesini sağlar.

Miyokard Enfarktüsünün Sıçan Modelinde Hedefli ve Güvenilir İntramiyokardiyal Kök Hücre Dağıtımı için Ekokardiyografi Kılavuzluğunda Enjeksiyon

Keşfedin yetişkin farelerde intramyokardiyal adenovirüs enjeksiyonu ile kardiyak spesifik gen manipülasyonu yöntemini. Bu teknik, kardiyovasküler araştırmalarda hızlı iyileşme ve tekrarlanabilirlik sağlar.

Vivo içinde kalp özel gen manipülasyon farelerde Intramyocardial enjeksiyonla için basit ve etkili bir yöntem

Daha fazla video keşfet