Hemocytes mikrobiyal enfeksiyon ve çözümleme çekme--dan Drosophila melanogaster larva

Bu teknik, hemositlerin meyve sineklerinde genel bağışıklık tepkisine nasıl katkıda bulunduğu gibi hücresel enfeksiyon ve mikrobiyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, daha önce enfekte olmuş larvalar kullanılarak laboratuvarda gerçekleştirilebilmesidir. Alternatif olarak, enfekte olmamış larvalardan elde edilen hemositler ex vivo enfeksiyon için kullanılabilir.

Bu yöntemin görsel gösterimi kritiktir, çünkü konfokal mikroskobun karmaşıklığı ve 3D model rekonstrüksiyonu seçenekleri nedeniyle görüntüleme adımlarının öğrenilmesi zordur. Protokole başlamak için, stereo mikroskop altında on santimetreye on santimetre parafin filminden iki ila üç parça katmanlayın. Ardından, kılcal polar ısıtıcıyı maksimumun %55'ine ayarlayarak cam kılcal damarı hazırlayın.

Kılcal boruyu yaklaşık on mikrometrelik keskin bir noktaya direğin. Kılcal damarı mineral yağ ile doldurun. Doldurulmuş kılcal boruyu nanoenjektöre monte edin.

Ve kaynamış kılcal boru ucunu forseps ile ucunu kırarak açın. Kılcal boru ucundan mümkün olduğunca fazla yağ çıkarın, ardından tüpü drosophila hemosit izolasyon ortamı veya DHIM ile doldurun. Hemolenfan yağının sınırının kolay görselleştirilmesi için, yağ ile DHIM arasına bir hava kabarcığı ekleyin.

Forseps kullanarak, gıda şişelerinin iç duvarından on üçüncü instar drosophila larvasını nazikçe seçin ve bunları 100 mikrometrelik bir süzgecin içine yerleştirin. Larvaların üzerine beş mililitre steril su dökün ve süzgeci beş saniye sallayın. Fazla suyu çıkarmak için süzgeci bir görev mendilinin üzerine yerleştirin.

Larvaları 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın, beş saniye boyunca CO2 gazı ile uyuşturun. Daha sonra larvaları, sırt tarafı yukarı bakacak şekilde stereo mikroskop altında parafin film üzerine yerleştirin. Cam kılcal damarı yerinde tutmak için larva arka gövdesine hafifçe yerleştirin ve ince uçlu forseps kullanarak arka kütikülü açın.

Hemolenfin parafin filminin üzerine akmasına izin verin. Parafin filmi üzerinde bir seferde 20 ila 50 larva arasında hemositler de dahil olmak üzere bir hemolenf havuzu yapın. Biriken hemolenfleri almak için nanoenjektör üzerindeki cam kılcal damarı kullanın.

Hemolenfleri 500 mikrolitre DHIM içeren 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne boşaltın. Maya ezmesini bir üzüm suyu agar tabağına koyun. Kurumayı önlemek için larvaların göç edebileceği agarda ince bir kesim yapın.

Parafin film kullanarak tutma forsepsli 0.001 milimetre sivri uçlu bir Tungsten iğnesi monte edin. 50 mikrolitre yüksek titre, mCherry eksprese eden C.Burnetii'yi stereo mikroskop altında parafin filme pipetleyin ve larvaları bakteri havuzuna yerleştirin. Larvaları bir Tungsten iğnesi ile delin.

Larvaları bir agar plakasına aktarın. Kalan patojen ortamını agar plakasına aktarın ve plakayı parafin film ile kapatın. Larvaları, enfeksiyon sonrası istenen zamana kadar nemli havada plaka üzerinde tutun.

C.Burnetii ile enfekte olmuş larvaları 24 saat boyunca plakada bırakın. 24 oyuklu bir plakanın kuyusuna 12 milimetre yuvarlak bir kapak camı yerleştirin. Kuyuya 500 mikrolitre DHIM pipetleyin.

Daha önce enfekte olmuş larvalardan hemolenf çıkarın ve alın, ardından hemolenfleri kuyuya atın. Plakayı 1000 G'de beş dakika santrifüjleyin. DAPI, EGFP ve mCherry'nin üç renkli görüntülemesi için konfokal mikroskobu yapılandırın.

Numuneyi mikroskoba yerleştirin ve 63x 1.4 sayısal açıklık objektifi kullanarak numuneye odaklanın. Görüntüleme için görüş alanında istenen hemositleri bulun. Ardından, numunenin uygun pozlamasını elde etmek için lazer gücünü ve dedektör kazançlarını ayarlayın.

Maruz kalma seviyesinin tüm numune kalınlığı için uygun olduğundan emin olmak için birden fazla Z düzlemini kontrol edin. Ardından, bütün bir hemositin Z eksenindeki üst ve alt konumu bulun. Bu konumları Z kesiti için başlangıç ve bitiş konumları olarak ayarlayın.

Hemosit içeren alanı görüntülemek için tarama yakınlaştırmasını kullanın. Görüntü serilerini, X Y düzleminde 1024 x 1024 piksel ve Z boyutunda 0,3 mikrometre aralık gibi uygun çözünürlükte toplayın. Z kesitli görüntü serisi dosyasını, 3B model rekonstrüksiyonu için konfokal mikroskopla ilişkili yazılıma aktarın.

EGFP eksprese eden bir hemositte DAPI ve mCherry eksprese eden C.Burnetii ile boyanmış çekirdeklerin ko-lokalizasyonunu gösteren bir hücre seçin. Görüntü serisini yalnızca tek hücreyi içerecek şekilde kırpın. Yazılımın önceden paketlenmiş algoritmasını kullanarak 3B modeli yeniden oluşturan 3B görüntüleyici seçeneğini seçin.

Karışım, yüzey ve karma seçenekler arasından 3D gösterim için istediğiniz görüntüleme türünü seçin. Bu yöntemde hemositler, çekirdekler ve C.Burnetii yüzey modelleri kullanılarak gösterilmiştir. Fare düğmesini basılı tutarak ve imleci ekranın etrafında sürükleyerek 3B yeniden yapılandırılmış hücreyi çeşitli görüntüleme konumlarından gözlemleyin.

Görüntüyü optimize etmek için modellenen ışık kaynağının hücre yönünü ve konumunu ayarlayın. Son olarak, hemositin iç içeriğini görselleştirmek için kırpma ve kesit alma komutlarını kullanarak model boyunca kesitler alın. Hemolektin sürücüsünün kontrolü altında EGFP'yi eksprese eden ekstrakte edilmiş canlı hemositlerin çoklu görüntülerden görselleştirilmesi, DAPI pozitif hücrelerin çoğunun aynı zamanda EGFP pozitif olduğunu göstermektedir.

Coxiella Burnetii ile enfekte olmuş hemositlerin kesitleri, hücrenin iç kısmında mCherry eksprese eden bakterilerin varlığını doğrular. Görüntüler 3D modellere yeniden yapılandırıldı ve in vivo enfekte hemositlerin daha büyük sitoplazmik uzantılar sergilediğini ve doğada daha düz olduğunu gözlemledik. Ex vivo enfekte hemositler ise daha küreseldi.

Her iki modelin de kesitleri, hücrenin iç kısmında mCherry eksprese eden Coxiella'nın varlığını doğrular. Ekstrakte edilen hemositler IIV6 ile enfekte edildi ve sahte ve IIV6 ile enfekte hücreler arasında önemli ölçüde daha yüksek IIV6-193R transkript seviyeleri gösteren qRT PCR analizine uygulandı. Bu prosedürü denerken, hücrelerin çok uzun süre uygun besinlerden mahrum kalmaması için tüm ortamların önceden hazırlanmasını ve oda sıcaklığına dengelenmesini unutmamak önemlidir.

Bu prosedürü takiben, tek hücreli RNA araması gibi diğer yöntemler, enfeksiyona genel konak yanıtı gibi ek soruları yanıtlamak için gerçekleştirilebilir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, immünoloji ve mikrobiyoloji alanındaki araştırmacıların, meyve sineklerinde veya açık dolaşım sistemine sahip diğer hayvanlarda patojen istilasını ve konakçı tepkilerini keşfetmelerine yardımcı olur.