Kan tabanlı Test ROS1 tespiti için ve füzyon transkriptleri ribonükleik asit veya dijital Polimeraz zincir reaksiyonu kullanarak dolaşan gelen RET

Bu prosedürün genel amacı, tam kan örneklerinden tümör kaynaklı dolaşımdaki ribonükleik asidin damlacık dijital PCR ile izolasyonu ve karakterizasyonudur. Bu yöntem, onkoloji teşhis alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Dolaşımdaki RNA ve kan örneklerinden tümör kaynaklı gen füzyon transciptlerinin nasıl tespit edileceği gibi.

Bu tekniğin ana avantajı, düşük frekanslı ve kan örneklerinde bulunan RNA varyantlarının stabilizasyonu, ekstraksiyonu ve tespiti için yüksek düzeyde optimize edilmiş yöntemler kullanmasıdır. Kan bazlı testler, hızlı sonuçlar sağlayabilen minimal invaziv bir tekniğin kullanılmasının yararı ile geleneksel doku biyopsilerinin bir tamamlayıcısıdır. Bu yöntem klinik olarak anlamlı mutasyonlar ve NSCLC hakkında bilgi sağlayabilse de, tam kanda dolaşan RNA moleküllerinin erişilebilir ve hızlı bir şekilde tanımlanmasının gerekli olduğu diğer sistemlere de uygulanabilir.

Ters transkripsiyon reaksiyonu için dolaşımdaki RNA, metin protokolünde açıklandığı gibi donörlerden alınan kan örneklerinden izole edilir. Konsantre dolaşımdaki RNA örneğini, rastgele primerler de dahil olmak üzere ticari olarak temin edilebilen bir ters transkripsiyon reaksiyon kiti kullanarak cDNA'ya dönüştürün. Ters transciptaz içermeyen bir kontrol numunesi ve RNA içermeyen bir kontrol numunesi ekleyin.

Ters transkripsiyon reaksiyonu tamamlandığında, ticari olarak temin edilebilen bir DNA yoğunlaştırıcı spin sütunu kullanarak cDNA'yı reaksiyon karışımından izole edin. Bu adım, enzimlerin, primerlerin ve serbest deoksinükleotid trifosfatların uzaklaştırılmasını kolaylaştırır. cDNA PCR reaksiyonlarında hemen kullanılmayacaksa, eksi 80 santigrat derecede saklayın.

Bu prosedürü gerçekleştirirken bir bertaraf laboratuvar önlüğü ve nitril eldivenler ve özel bir reaktif hazırlama alanı giyin. Probları ışıktan korumak için örtün, çünkü ardışık ışık proba bağlı floresan boyayı foto ağartabilir. İlk olarak, PCR karışımlarını bu tabloda belirtildiği gibi 20 mikrolitrelik bir nihai reaksiyon hacmi için hazırlayın, ancak henüz cDNA eklemeden.

Daha sonra, ışıktan korunan ve örtülmüş karışımları ayrı bir ön amplifikasyon alanında bulunan bir PCR temiz başlığına taşıyın. Karışımları bir PCR plakasına dağıtın. Test edilecek cDNA'yı PCR karışımına ekleyin.

Plakayı çıkarılabilir bir plaka kapatıcı ile örtün. Kuyucukların dibindeki numuneleri toplamak için plakaları kısa bir süre santrifüjleyin. Bir tabak çalkalayıcıda 10 saniye düşük ayarda karıştırın.

Kuyu dibindeki numuneleri toplamak için plakaları tekrar kısa bir süre santrifüjleyin. Manuel damlacık oluşturma işlemini gerçekleştirmeden önce plaka kapatıcıyı çıkarın. Numuneleri yüklerken pipet ucundaki kabarcıkları en aza indirmek ve daha sonra damlacık hasarını önlemek için damlacıkları kartuştan plakaya yavaşça aktarmak önemlidir.

20 mikrolitre PCR karışımını damlacık oluşturma kartuşundaki numune kuyucuklarına dikkatlice aktarın. 70 mikrolitre damla nesil yağ ekleyin. Lastik bir conta ile örtün ve damlacık oluşumunu başlatmak için kartuşu manuel bir damlacık üretecine aktarın.

Damlacık oluşumunu takiben, damlacıkları yeni bir PCR plakasına aktarmak için üretici tarafından önerilen ipuçlarını kullanın. Damlacıkları, ucun ucunu damlacık kartuşuna veya plakasına değdirmeden, her biri 5 ila 6 saniyeden fazla olacak şekilde yavaşça aspire edin ve dağıtın. Plakayı bir folyo plaka kapatıcı ile kapatın.

Aşağıdaki ayarları kullanarak termal döngüleyicide PCR gerçekleştirin. Termal döngüleyici çalışması tamamlandıktan sonra, bir damlacık okuyucu kullanarak plakayı okuyun. Okuyucu yazılımı için kontrollerin ve numunelerin konumunu tanımlayan bir plaka düzeni oluşturun ve okumayı başlatmak için yazılıma yükleyin.

Plaka okuma sonuçları, piyasada bulunan yazılım kullanılarak analiz edilir. 2 boyutlu veya 2B Genlik grafiklerini görüntülemek için analiz menüsüne giderek başlayın. Damlacık verilerini inceleyerek verilerin genel kalitesini değerlendirin.

Etkinlikler menüsünü kullanarak, kabul edilen toplam etkinlik sayıları için verileri değerlendirin. Kuyu başına 10.000'den fazla olay olmalıdır. Aksi takdirde, veriler ek sorunlar için dikkatli bir şekilde değerlendirilmelidir.

Ardından, floresan genlikleri için verileri kontrol edin. Tekrarlanan numuneler arasındaki önemli genlik farkları ve konsantrasyon farkları, numunelerin kötü işlendiğini veya karıştırıldığını gösterir. Düşük kaliteli damlacıkların veya sorunlu numunelerin göstergesi olan 45 derecelik bir eksende püskürtme desenlerine sahip damlacık kümelerini not edin.

Önce pozitif kontrol, ters transkriptaz kontrolü ve RNA kontrolü için verileri inceleyin. Tüm kontrol örneklerini seçin ve uygun eşikleme için 2B çizime göre küme kalitesini inceleyin, damlacık kümesi arasında net bir ayrım belirgin olmalıdır. Her tahlil varyantı için, kontrol kuyularına göre eşiği ayarlayın.

Çift negatif damlacık popülasyonunu x eksenindeki kontrol geni popülasyonundan ve varsa y eksenindeki varyant gen popülasyonundan ayırmak için artı işareti araçlarını kullanarak 2B çizimlerde eşikleri ayarlayın. Tek bir örnek için her kopya kutusundan bazı kopyalar. Son olarak, test sonuçlarını algılanan varyant kopyalarının sayısı olarak ifade edin.

SDC4-ROS1 füzyonunu ve CCDC6-RET füzyonunu eksprese eden hücre hatlarını kullanarak, toplam insan vahşi tip RNA'nın arka planında seyreltilmiş, her füzyon varyantı ile yüzde 0.2 varyant frekansında belirlenen tespit sınırı. Hedef hücre hattından türetilen RNA'nın yüzde 5'lik bir preparasyonu tespit edilmedi, bu da test özgüllüğünü gösterdi. Analitik multipleks RNA standartları, aynı gün içinde üç çalışma boyunca yüksek, orta ve düşük konsantrasyonlarda ölçüldü.

Üç, art arda üç günde ve iki bağımsız operatörle çalışır. Sonuçlar, hem ilgilenilen füzyon transkriptinin hem de dahili bir kontrol geni GUSB'nin doğru bir şekilde tespit edildiğini göstermektedir. Klinik örneklerin her biri ayrıca bir pozitif kontrol, bir ters transkriptaz kontrolü ve bir RNA şablonu kontrolü ile çalıştırıldı.

Füzyon varyantları y ekseni boyunca temsil edilirken, GUSB x ekseni üzerindedir. Parti kontrolleri 21 gün boyunca değerlendirildiğinde, tüm çalışmalarda ROS1 ve RET için füzyon pozitif damlacıklar ve GUSB kontrol gen damlacıkları gözlendi. Ters transkriptaz kontrolü olmadan kontaminasyon, RNA kontrolü olmadan kontaminasyon, damlacıkların paylaşılması ve birleştirilmesi ve kötü optimize edilmiş PCR koşulları veya PCR inhibisyonu olduğunda temsili optimal olmayan sonuçlar gösterilir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, tüm bu protokol yaklaşık 12 saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, RNA ve insan kan örneklerini işlemek için en iyi uygulamaları kullanmak önemlidir. RNA'nın izolasyonunu takiben, yeni füzyon varyantlarının tanımlanması gibi ek soruları yanıtlamak için yeni nesil dizileme gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir.

Bu videoyu izledikten sonra, dolaşımdaki RNA'yı tam kan ve plazmadan nasıl izole edeceğinizi ve ardından RET ve ROS1 gibi dolaşımdaki nadir varyantları tanımlamak için geri kazanılan RNA'yı nasıl işleyeceğinizi iyi anlamış olmalısınız. Geliştirildikten sonra, bu teknik tam kandan klinik olarak eyleme geçirilebilir mutasyonların tespit edilmesinin yolunu açtı. Ve bu yöntemleri, dolaşımdaki ifade edilmiş transkriptleri incelemek için genişlettik.