Histon değişiklikler Saccharomyces cerevisiae üzerinden Kromatin Immunoprecipitation (ChIP)

Bu kromatin immünoprecipasyon protokolünün genel amacı, tomurcuklanan maya genomu boyunca tanımlanmış bölgelerde histon modifikasyonlarının bolluğunu ve lokalizasyonunu belirlemektir. Bu yöntem, histon modifikasyonlarının gen ekspresyon kontrolüne nasıl bağlandığı ve bu modifikasyonların farklı çevresel koşullara yanıt olarak nasıl değiştiği gibi kromatin regülasyonundaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Aynı anda birçok farklı histon modifikasyonunu ve birden fazla E suşunu araştırmak için kullanılabilen son derece çok yönlü bir protokol.

Bu yöntem histon modifikasyonları hakkında bilgi sağlayabilse de, epitop etiketlerinin veya mevcut antikorların kullanılması yoluyla diğer kromatin bağ proteinlerinin araştırılmasına da uygulanabilir. Maya hücrelerini büyüterek bu işleme başlayın, her uygun suşun tek bir kolonisi ile 10 mililitre YPD ortamını aşılayın ve gece boyunca 220 rpm'de çalkalama inkübatöründe 30 santigrat derece büyütün. Ertesi gün, kültürün 600 nanometresinde veya OD600'ünde optik yoğunluğu ölçtükten sonra, kültürü yeni bir şişede 100 mL YPD'de 0.2'lik bir OD600'e seyreltin.

Hücreleri, orta log fazına ulaşana kadar 220 rpm'de çalkalanan bir inkübatörde 30 santigrat derecede büyütün. Kültürler orta log fazına ulaştığında, %1'lik bir nihai formaldehit konsantrasyonu için her bir şişedeki ortama doğrudan 2,7 mililitre %37 formaldehit ekleyin. Şişeleri oda sıcaklığında bir çalkalayıcıya aktarın ve 50 rpm'de 15 dakika çalkalayın.

Ortama beş mililitre 2.5 molar glisin ekleyin ve formaldehiti söndürmek için oda sıcaklığında 50 rpm'de beş dakika çalkalamaya devam edin. Daha sonra, hücreleri aşağı doğru döndürün ve metin protokolünde açıklandığı gibi yıkayın. Son döndürmeden sonra süpernatanı çıkarın ve maya lizatları yapmaya devam edin.

Hücreleri bir mililitre soğuk kromatin amino çökeltme veya 1 milimolar PMSF ve 1:1000 seyreltme ile bir maya proteaz inhibitör kokteyli ile ChIP Lizis tamponunda yeniden süspanse edin. Süspansiyonu 200 mikrolitre cam boncuk içeren 2.0 mililitrelik vidalı kapaklı bir tüpe aktarın. Dört santigrat derecede yüksek hızlı bir çalkalama için hücreleri boncuk çırpma aparatına aktarın.

30 saniye boncuk çırpın ve bir dakika buz çırpın. Toplam altı kez boncuk çırpın, hücreleri her 30 saniyelik vuruş arasında en az bir dakika buz üzerinde tutun. Bir jel yükleme ucu kullanarak, lizatı 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın.

Lizatı 20 dakika boyunca dört santigrat derecede 15.500 g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve peleti 250 mikrolitre mikrokokal nükleaz sindirim tamponunda hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek yeniden süspanse edin. Her reaksiyona 2.5 mikrolitre mikrokokal nükleaz ekleyin.

Dört ila altı kez ters çevirerek nazikçe karıştırın ve hemen 37 santigrat derece su banyosunda 20 dakika inkübe edin. 20 dakika sonra, tüpleri buzun üzerine yerleştirerek, 10 milimolar EDTA'nın son konsantrasyonu için beş mililitre 0.5 molar EDTA ekleyerek ve ters çevirerek hafifçe karıştırarak reaksiyonu durdurun. 15, 500 g'da dört santigrat derecede 15 dakika santrifüjleyin.

Ardından, her süpernatanı yeni bir 1.5 mililitrelik tüpe aktarın. En tutarlı sonuçlar için, her amino çökeltmede aynı konsantrasyonda protein kullanıldığından emin olmak çok önemlidir. Amino çökeltme veya IP reaksiyonlarının sayısına bağlı olarak, her bir mikrokokal nükleaz salınan kromatin fraksiyonu ve ChIP lizis tamponunun bir ana karışımını yapın ve 50 mikrogram toplam protein içeren bir mililitreyi tek tek tüplere tahsis edin.

Giriş numunesi olarak işlemek için her IP karışımından 100 mikrolitre çıkarın. Giriş örneklerini daha sonra kullanmak üzere 20 santigrat derecede dondurun. Her immünopresipitasyon için antikora bağlı aynı miktarda boncuk kullanıldığından emin olmak da önemlidir.

Geniş bir tahta pipet ucu kullanarak, her IP örneğine antikorla önceden bağlanmış 20 mikrolitre manyetik protein AG boncukları ekleyin. Numuneleri üç saat boyunca dört santigrat derecede sekiz rpm'de döndürün. IP bittiğinde, tüpleri manyetik bir standa yerleştirin ve boncukların tüpün yan tarafında toplanmasına izin verin.

Süpernatanı çıkarmak için bir pipet kullanın. Boncuklara bir mililitre ChIP lizis tamponu ekleyin ve beş dakika boyunca dört santigrat derecede sekiz rpm'de döndürün. Ardından, tüpleri manyetik standın üzerine yerleştirin ve süpernatanı çıkarın.

Bu şekilde, boncukları belirtilen sayıda aşağıdaki tamponlarla art arda yıkayın. ChIP Lizis Tamponu, Yüksek Tuz Yıkama Tamponu, LiCl / Deterjan Yıkama Tamponu ve TE. Son TE yıkamasında, boncukların çoğunu yeni bir tüpe aktarmak için 0,5 mililitre TE kullanın ve ardından tüpü yıkamak ve kalan boncukları aktarmak için 0,5 mililitre TE daha kullanın. Her tüpe 250 mikrolitre taze yapılmış ChIP elüsyon tamponu ekleyin ve çözeltiyi kısaca girdaplayın.

Numuneleri oda sıcaklığında sekiz rpm'de 15 dakika döndürün. Tüpleri manyetik standa yerleştirin. Süpernatanı dikkatlice yeni bir tüpe aktarın ve boncuklardan kaçının.

Boncuklara 250 mikrolitre daha ChIP elüsyon tamponu ekleyin. Numuneleri oda sıcaklığında sekiz rpm'de 15 dakika döndürün. Dikkatlice ve boncukları rahatsız etmeden, süpernatanı ilk elüsyonu içeren tüpe aktarın.

Daha önce toplanan giriş örneklerini çözün ve her giriş örneğine 400 mikrolitre ChIP elüsyon tamponu ekleyin. Protein DNA çapraz bağlarını tersine çevirmek için, hem giriş hem de IP örneklerine, 20 mikrolitre beş molar sodyum klorür, beş mikrolitre glikojen ve 12.5 mikrolitre Proteinaz K ekleyin. Numuneleri gece boyunca 65 santigrat derece su banyosunda inkübe edin.

Bu prosedüre başlamak için, uygun hacimlerde QPCR karışımı, ileri astar ve ters astarı birleştirerek her bir astar seti için bir QPCR ana karışımı yapın. Bir reaksiyonun 0.5 mikrolitre DNA ve 4.0 mikrolitre nükleaz içermeyen su içerdiği her DNA örneği için DNA ana karışımları yapın 384 kuyulu bir QPCR plakasında her bir oyuğa 5.5 mikrolitre uygun primer ana karışımı ekleyin. Plakayı oda sıcaklığında 200 g'da bir dakika döndürün.

Ardından, her bir oyuğa 4.5 mikrolitre uygun DNA ana karışımı ekleyin. Plakayı kapatın ve oda sıcaklığında 200 g'da bir dakika döndürün. Aşağıdaki koşullara sahip gerçek zamanlı bir QPCR sistemi kullanarak QPCR gerçekleştirin, üç dakika boyunca 95 santigrat derece, 10 saniye boyunca 40 döngü 95 santigrat derece ve 30 saniye boyunca 55 santigrat derece ve 65 santigrat derece ila 95 santigrat derece arasında bir erime eğrisi beş saniye boyunca 0.5 santigrat derece artışlarla.

Bu protokolün önemli bir bileşeni, kromatini çözünür parçalara sindirmek için kullanılan mikrokokal nükleaz konsantrasyonunu optimize etmektir. Bu örnek, kromatin peletinin değişen miktarlarda mikrokokal nükleaz ile sindirilmesini takiben izole edilen DNA'nın agaroz jel elektroforezinden elde edilen sonuç, mikrolitre başına 20 birimde 2.5 mikrolitre enzimin ağırlıklı olarak mononükleozom ürettiğini göstermektedir. Bu temsili ChIP deneyi, vahşi tip ve set1 nakavt hücrelerinde bir histon metil markörü H3K4me2 ve histon H3'e karşı antikorlar kullandı.

Set1 nakavt hücreleri, işareti katalize eden metil transferazdan yoksundur Çubuklar, belirtilen düşük sci'de H3K4me2'nin nispi zenginleşmesini gösterir. Yabani tip suş, set1, PMA1 ve ERG11'in doğrudan hedefleri olduğu bilinen iki genin beş asal ucunda H3K4me2 için net bir zenginleştirme gösterirken, set1 nakavt hücrelerinde hiçbir sinyal gözlenmedi. Beklendiği gibi, TEL07L'de H3K4me2 işaretinde herhangi bir zenginleştirme olmamıştır, SPR3 ekspresyonunun da set1 tarafından düzenlendiği bildirilmiştir, ancak bu sonuçlar, düzenlemenin PMA1 veya ERG11'dekinden farklı bir mekanizma ile gerçekleşme olasılığının yüksek olduğunu göstermektedir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa dört gün içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, özgüllük için kullanılan antikoru uygun kontrollerle dikkatlice test etmeyi unutmamak önemlidir. Varsa, QPCR'de hem pozitif hem de negatif kontrol bölgeleri araştırılmalıdır.

Bu prosedürü takiben, histon modifikasyonlarının dağılımı ile genomu belirlemek için GP dizileme gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, iyi kontrol edilen deneylerle benzersiz genomik bölgelerde farklı histon modifikasyonlarının seviyelerini tutarlı bir şekilde nasıl tespit edeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.