Çözünür ve çözünmez Huntingtin türler çözümlenmesi için ayırma

Bu prosedürün genel amacı, Huntington hastalığı model sistemlerinde protein homeostazının analizi için huntingtin protein akışının görselleştirilmesi, karakterizasyonu ve miktarının belirlenmesi için yararlı bir aracı tanımlamaktır. Bu yöntem, belirli terapötik müdahalelerin hastalık patogenezi üzerindeki etkisini anlamak gibi protein homeostazı ve nörodejeneratif hastalık alanlarındaki soruları anlamamıza yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, araştırmacıların kantitatif analiz için çözünmeyen protein türlerini izole etmesine ve çözmesine izin vermesidir.

Bu yöntem, Huntington hastalığı patogenezi sırasında biyokimyasal değişiklikler hakkında bilgi sağlayabilse de, Parkinson ve Alzheimer hastalığı gibi diğer protein yanlış katlanan hastalıklara da uygulanabilir. Bu prosedüre başlamak için, her numune için iki tüp setini çözünür ve çözünmez olarak etiketleyin. Uygun miktarda inhibitör ekleyerek çözünür tüpte numune lizisinden hemen önce bir lizis tamponu hazırlayın.

Daha sonra, dokuya proteaz inhibitörleri ile desteklenmiş buz gibi soğuk çalışan çözünür lizis tamponu ekleyin. Fare beyin dokusu için, bir mililitrelik bir cam bardakta 30 kez yavaşça iki katına çıkarın. Kabarcıklar oluşacağından ve eksik homojenizasyona neden olabileceğinden sıvının yüzeyini kırmamaya dikkat edin.

Daha sonra buz üzerinde çözünmez etiketli tüpe pipetleyin. Hücre hatları için, hücreler her altı oyuklu plakada beş kez 10 ila beşinci hücrelerde kaplandı ve birleşmeye yakın bir şekilde büyütüldü. Daha sonra, hücreleri soğuk 1X PBS ile bir kez durulayın ve çıkarın.

Daha sonra hücrelere minimum hacimde lizis tamponu uygulayın ve bunları bir hücre kazıyıcı ile kaldırın. Daha sonra, homojenat veya hücre lizatını etiketli çözünmez tüpe aktarın ve bir saat boyunca buz üzerinde parçalayın. Hücre lizatları için, inkübasyona başlamadan önce hücre kümelerini parçalamak ve kabarcık oluşturmaktan kaçınmak için birkaç kez ezin.

Her bir numuneyi lizlemenin yarısında bir saniye boyunca kısaca girdaplayın. Bundan sonra, numuneleri 20 dakika boyunca 15.000 x g'da dört santigrat derecede santrifüjleyin. Ardından süpernatanı çıkarın.

Fraksiyonu kirleteceği için pelet veya bulanık tabakayı rahatsız etmemeye dikkat edin. Süpernatanı çözünür fraksiyon olarak çözünür etiketli tüpe pipetleyin ve buz üzerinde tutun. Çözünür ve çözünmez lizis tamponlarını takip etmek çok önemlidir.

Tamponların değiştirilmesi veya çözünmeyen tamponun veya numunelerin buz üzerine yerleştirilmesi protokolün sonucuna zarar verecektir. Peleti 500 mikrolitre lizis tamponu ile yıkayın ve beş dakika boyunca 15.000 x g'de dört santigrat derecede santrifüjleyin. Yıkamayı bir kez daha tekrarlayın.

Daha sonra, kalan tüm yıkama tamponunu çıkarın, geriye sadece doku peleti kalır. Daha sonra, peleti% 4 SDS ile desteklenmiş lizis tamponu ile yeniden süspanse edin. Her numuneyi bir prob sonikatörü ile oda sıcaklığında 30 saniye boyunca sonikleştirin.

Küçük hacimleri uzun süre sonikleştirmek teknik olarak zordur. Bu adımı tamamlarken emülsifiye etme veya püskürtme yoluyla herhangi bir numuneyi kaybetmemeye dikkat edin. Daha sonra numuneleri 30 dakika kaynatın.

Daha sonra 6.000 x g'da kısa bir süre santrifüjleyin. Daha sonra, protein konsantrasyonunu ölçmek için deterjan uyumlu protein testi veya Lowry protein testi yapın. Bunu takiben, donma/çözülme sorunlarını önlemek için numuneleri 50 mikrolitrelik partiler halinde ayırın.

Bu adımda, 30 mikrogram numuneyi yükleme tamponunda bire bir oranında seyrelterek western blotları gerçekleştirin. Numuneleri beş dakika kaynatın ve 6.000 x g'da kısa bir süre santrifüjleyin. Ardından, kesirleri SDS sayfasına ve batı lekesine göre analiz edin.

Protein yükleme verimliliğini görselleştirmek için zarı tüm protein boyası ile boyayın. İşte sırasıyla% 4-12 Bis-Tris ve% 3-8 Tris-Asetat sayfa jelleri üzerinde çözülen HEK 293T hücre lizatlarından çözünür ve çözünmeyen fraksiyonlar. GAPDH yükleme kontrolüne normalize edilmiş çözünür fraksiyon, proteaz inhibitörü MG132'ye maruz kalmaya bağlı olarak mutant huntingtin ekzon 1 çözünür monomerinin dalgalanmasını gösterir.

Çözünmeyen fraksiyon, yüksek moleküler ağırlıklı birikmiş mutant huntingtin türlerinin de MG132 muamelesi ile modüle edildiğini göstermektedir. Ve burada, western blot ve filtre geciktirme analizi kullanılarak HeLA hücre lizatlarından çözünür ve çözünmez fraksiyonların örnekleri verilmiştir. Veriler, aşırı eksprese edilmiş bir SUMO izoformunun varlığının, çözünmeyen fraksiyonda hem yüksek moleküler ağırlıklı mutant hem de fibriler çözünmeyen mutant huntingtin'i artırdığını göstermektedir.

Bu şekil, 97Q huntingtin ekzon 1'i eksprese eden HeLa hücrelerinden çözünmeyen fraksiyonlamada potansiyel bir terapötik modüle edildikten sonra yüksek moleküler ağırlıklı mutant huntingtin birikiminin düzenlenmesini göstermektedir. Terapötik hedef PIAS1 ya PIAS1'e karşı bir siRNA ile susturuldu ya da aşırı eksprese edildi. PIAS1'e karşı mikroRNA ile muamele edilen ve %3-8 Tris-Asetat sayfa jelleri üzerinde çözülen fare striatasından çözünmeyen fraksiyonlar, yüksek moleküler ağırlıklı çözünmeyen av kalayı modülasyonunu gösterir.

NEM ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu protokolü gerçekleştirirken her zaman yüz maskesi takmak gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın. Bir kez ustalaştıktan sonra, lizattan fraksiyonlamanın sonuna kadar olan bu teknik, numune sayısına bağlı olarak yaklaşık üç ila dört saat içinde yapılabilir. Protein miktar tayini ve alikotasyon için ek bir saat izin verilmelidir.

Bu prosedürü takiben, çözünür oligomerleri veya çözünmeyen fibrilleri tespit etmek için sırasıyla agaroz jel elektroforezi veya filtre geciktirme gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, kantitatif analiz için çözünmeyen yanlış katlanmış proteinlerin nasıl izole edileceğini ve çözüleceğini iyi anlamış olmalısınız.