Bir Ex Vivo modeli yaşlı insan Bruch'ın membran bir retina Pigment epitel hücrelerinin kültürü

Bu deneysel prosedürün genel amacı, Bruch zarının retinal pigmental epitel hücrelerinin üst üste binmesi üzerindeki etkisini gözlemleyen Bruch zarı kültür sistemi olarak bilinen bir ex vivo-hücre dışı matris oluşturmaktır. Bu yöntem, AMD etiyoloji alanındaki RPE alt biyolojisinde, yaşlanmış Bruch zarlarındaki değişikliklerin üst üste binen RPE hücrelerinin arızalarına katkıda bulunup bulunmadığı gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, araştırmacıların doğal Bruch zarını farklı yaşlardaki bir insan-donör gözünden izole etmelerine ve bunları RPE hücre kültürlerinde proteomik çalışma için kullanmalarına izin vermesidir.

Bruch zarını izole etmek ve doğal Bruch zarına minimum zarar verecek şekilde gerçek bir vivo kültür sistemi yapmak zordur, ancak bu videoda size nasıl yapılacağını göstereceğim. Başlamak için, CO2'den bağımsız DMEM'e batırılmış 1,5 inçlik bir gazlı bezi 100 milimetrelik bir tabağa yerleştirin. Ardından göz küresini gazlı bezin üzerine yükleyin.

Daha sonra, limbusun üç milimetre arkasındaki sklera boyunca bir kesi yapmak için cerrahi bir bıçak kullanın. Ardından, tam kalınlıkta bir kesi yapmak için ince bıçaklı makas kullanın ve kesiği göz çevresinde her iki yönde de çevresel olarak uzatın. Ardından, kornea, lens ve iris dahil olmak üzere ön segmenti çıkarın ve atın.

Ayrıca, vitreus ve retinayı atın. Ardından, Teflon kaplı bir spatula kullanarak RPE Bruch membran koroid kompleksini skleradan periferden optik sinire kadar dikkatlice soyun. Bu, membran kompleksini yırtmamak için çok dikkatli yapılmalıdır.

Şimdi, sklerada dört radyal kesi yapmak ve sklerayı soymak için ince cerrahi makas kullanın. Daha sonra, Bruch membran koroid eksplantını optik sinirden kesin ve bu eksplantı DPBS'de 0.02 Molar amonyum hidroksit içeren 60 milimetrelik bir kaba aktarın. Doğal RPE hücrelerini çıkarmak için, bu eksplantı oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin.

İnkübasyondan sonra, doku etrafında solüsyon akarken Bruch zarı üzerindeki optik sinir bölgesini Teflon kaplı forseps ile sabitleyerek eksplantı DPBS kullanarak üç kez yıkayın. Daha sonra, eksplantı, laminin tarafı yukarı bakacak şekilde karbondioksit içermeyen ortamda yüzdürün. Bruch zarı üzerinde dört kesi yapın ve ardından 0,2 mikron gözenekli lamine edilmemiş hidrofobik, 65 mikron kalınlığında bir PTFE membranı eksplant üzerine aktarın.

Bunu bazal lamina ile PTFE membrana karşı ayarlayın. Tabaktaki fazla sıvıyı çıkarın, ardından düzeneği, fritlenmiş bir cam destek üzerine oturması gereken bir cam mikroanaliz vakumlu filtre tutucu sistemine aktarın. Daha sonra, bazal lamina ile temastan dikkatlice kaçınırken, Teflon kaplı forseps kullanarak koroidal tarafın kıvrılmış kenarlarını düzleştirin.

Şimdi, DPBS'de 15 mililitre% 4 agarozu sıvılaştırın ve 37 santigrat dereceye kadar soğutun. Ardından, agarozu düz tutmak için hafif emme uygulayarak eksplantın koroidal tarafının üzerine yavaşça dökün. Jel katılaşmaya başladığında, zarla birlikte buz üzerinde 60 milimetrelik bir tabağa aktarın.

Jelin iki ila üç dakika katılaşmasına izin verin ve ardından PTFE membranını soyun. Daha sonra, eksplantı DPBS'ye batırın ve ihtiyaç duyulana kadar dört santigrat derecede saklayın. Eksplantı% 4 sıvı agaroz ile kaplı 60 milimetrelik bir tabakta kültürlendirirken, Bruch zarını yukarı bakacak şekilde yapın.

Polistiren kaplı 96 oyuklu bir plaka kullanarak kültür yaparken, jel kaplı Bruch membran eksplantını, laminin tarafı yukarı bakacak şekilde düz bir Teflon levha üzerine yerleştirin. Daha sonra, bir trephine kullanarak, eksplanttan altı ila sekiz altı milimetre düğme kesin ve doku düğmelerini sıvı agaroz ile yüklü kuyucuklara aktarın. Başlamak için, göz küresini daha önce olduğu gibi DPBS ile ıslatılmış bir gazlı bez üzerine yerleştirin.

Daha sonra, iris-sklera temas noktasının, pars plana'nın beş milimetre altında, subretinal boşluğa çevresel bir kesi yapın. İç segmenti, vitreus mizahını ve retinayı atın. Ardından, bir transfer pipeti kullanarak, göz kabını iki ila üç mililitre soğuk DPBS ile yıkayın.

Toplamda, göz kapağını üç kez yıkayın. Ardından, RPE hücrelerini ayırmak için, göz kabına 10 dakikaya kadar tripsin uygulayın. Daha sonra, tripsinizli RPE hücrelerini 50 mililitrelik bir tüpe aktarın ve reaksiyonu söndürmek için 37 santigrat derecede FBS ile 25 mililitre ortam ekleyin.

Şimdi, dokuyu ve çözeltiyi 200 g'da 24 santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. Ardından, peleti% 15 FBS ile beş mililitre DMEM tam ortamında yeniden süspanse edin. Şimdi, hücreleri sayın ve 15.000 canlı RPE hücresini, 96 oyuklu plakadaki Bruch zarının her bir düğmesine antibiyotik içeren 200 mikrolitre serumsuz minimum esansiyel ortama yerleştirin.

Hücreleri bağlanma için en az 24 saat kültürleyin. Daha sonra, tam DMEM'i ısıtmak için ortamı nazikçe değiştirin ve hücreleri kültürlemeye devam edin. Bu protokolü kullanarak, yaşlı ve hastalıklı insan Bruch zarları, üzerlerinde RPE hücreleri büyütülerek incelenebilir.

Tipik olarak, yaşlanmış eksplantlar RPE hücresinin yeniden bağlanmasını azaltır. Yaşlı insan Bruch zarı üzerinde kültürlenen RPE hücreleri, kritik bir RPE işlevi olan çubuk dış segmentlerini daha az fagositize edebilir. Mikrodiziler kullanılarak, hücreler yaşlı bireylerden Bruch zarı üzerinde kültürlendiğinde, genç bireylerden alınan zar üzerinde kültürlenen hücrelere kıyasla, RPE hücre gen ekspresyonunun farklı olduğu bulundu.

Bu videoyu izledikten sonra, Bruch zarını insan donör gözlerinden nasıl izole edeceğinizi ve RPE hücrelerinin kültürlenebileceği eksplantlar yapmayı iyi anlamalısınız. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde uygulanırsa yaklaşık üç saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, yüzeye zarar vermemek için Bruch membran eksplantının laminin tarafına diseksiyon aletleriyle dokunmamayı unutmamak önemlidir.

Bu prosedürü takiben, RPE fagositozu ve RPE hücre gen ekspresyonu çalışmaları gibi diğer yöntemler, farklı yaştaki bir donörden veya yaşa bağlı makula dejenerasyonu olan donörlerden alınan bir Bruch zarının üst üste binen RPE hücre fonksiyonlarını etkileyip etkilemeyeceği gibi ek soruları yanıtlamak için gerçekleştirilebilir. Geliştirildikten sonra, bu teknik, yaşa bağlı makula dejenerasyonu alanındaki araştırmacıların, bir Bruch zarı ex vivo model sisteminde AMD'nin etiyolojisindeki mekanizmayı keşfetmelerinin yolunu açtı.