Name: Bir Ex Vivo modeli yaşlı insan Bruchın membran bir retina Pigment epitel hücrelerinin kültürü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Öğrenin yaşlı insan Bruch membranı üzerinde retinal pigment epitel hücrelerinin ekz vivo kültürünü. Bu yöntem, yaşla ilişkili maküler dejenerasyon araştırmalarında hücre davranışlarını incelemek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu araştırma retina dejeneratif hastalığı Vakfı mücadele görme engelliler için körlüğü önlemek, New York, www.rpbusa.org ve büyük New York Merkezi araştırma tarafından desteklenmektedir www.blindness.org. Yazarlar Luanna Bartholomew, doktora, bu el yazması onun eleştiri için teşekkür etmek istiyorum.

Aşağıdaki protokol uyum içinde Helsinki Bildirgesi ve Yale Üniversitesi insan araştırma Etik Komitesi kuralları ilkelerinin için gerçekleştirilir.
1. kaynak insan donör gözler
<ol><li>İnsan donör küre Ulusal hastalık araştırma değişim (NDRI, Philadelphia, PA) edinin. Projeye bağlı olarak donör gözleri en az üç çift deneysel her grup için hazırlamak.</li>
	<li>Donör gözleri 10 h içinde ve gemi 48 h post mortemiçinde enucleate. Sonra steril Dulbecco'nın değiştirilmiş kartal orta (DMEM) kültür orta buz üzerinde laboratuvarda gözlere taşıma. Daha önce bildirilen çalışmalar donör gözleri ve hasat Bruch'ın membran25,26,29faaliyetlerinin ve biyolojik özellikleri bu moda koru taşınan göstermiştir.</li>
</ol>2. hasat insan Bruch'ın membran Explants
<ol><li>100 mm kültür çanak ve bir kesi ile sklera 3 mm arka limbus için yapmak için kullanmak iyi bıçak makas karbon dioksit bağımsız DMEM medya ve çepeçevre her iki yönde uzanan bir 1.5 x 1.5 inç gazlı bez her göz batırılmış bir yer.</li>
	<li>Yapmak bir tam-kalınlık sirkumferansiyel kesi (camsı için delici) 1 mm arka ora serrataiçin. Kaldırmak ve anterior segment (kornea, lens ve Iris), Vitre ve retina atın.</li>
	<li>İyi Cerrahi makas sklera ve koroid arasında dört Radyal kesi yapmak ve o zaman soyma sklera optik sinir, çevre uzak koroid/Bruch'ın membran karmaşık yırtılma önlemek için karşılamaya çalışırken.</li>
	<li>Ardından, çevresel bir kesi ora serrata boyunca suprachoroidal uzayda yapmak ve RPE Bruch'ın membran-koroid karmaşık özafagusu sklera üzerinden soyma.</li>
	<li>Yerel RPE hücrelerinin explant ile 0,02 M amonyum hidroksit Dulbecco'nın fosfat tamponlu tuz (DPBS) 60 x 15 mm polistren Petri kabına DPBS (şekil 1) üç - kez yıkayarak takip oda sıcaklığında 20 dakika içinde banyo tarafından kaldırın.</li>
	<li>Bruch'ın membran karmaşık explant karbondioksit içermeyen medyada membran bakan her explant Bazal lamina tabakası ile 0.2 µm gözenekli bir unlaminated, hidrofobik 65 µm kalınlığında politetrafloroetilen membran üzerinde süzülüyor.</li>
	<li>Bruch'ın membran explant ile politetrafloroetilen membran fritted cam desteğinde bir cam microanalysis vakum filtre tutucu sistemi yerleştirin.</li>
	<li>Bruch'ın membran Bazal laminin yan dokunmamaya dikkat çekici Teflon ile kaplı ince Forseps ile choroidal tarafındaki kıvrılmış kenarlar düzleştirin.</li>
	<li>Özel (DPBS %4) 15 mL ısı ve sonra 37 ° C'ye serin Sonra explant düz kalmasını güvence altına almak için nazik emiş uygulanırken Bruch'ın membran-koroid karmaşık choroidal taraftan üzerine liquidized jeli 15 mL dökün. 2-3 dk özel kuvvetlendirmek ve uzak politetrafloroetilen membran soyma için 4 ° C'de doku tutun.</li>
	<li>Bruch'ın membran explant (çapı, katılaşmış özel jel içinde 1,5 inç) Bruch'ın membran düzeltmek için çanak altındaki sıcak sıvı özel ile kaplı bir 60 x 15 mm polistren hücre kültür yemek (ile Bruch'ın membran yukarı dönük olacak şekilde) yerleştirin Kuyunun dibinde yukarı dönük olacak şekilde explant Bazal laminin tabaka ile explant.</li>
	<li>Özel Bruch'ın membran explants kültür tabak içinde stabilize etmek için oda sıcaklığında 2-3 dakika içinde kuvvetlendirmek. Bruch'ın membran kültüründe explants kapak DPBS ile yemek ve yemek ileride kullanmak üzere 4 ° C'de depolayın. Şekil 2A izole Bruch'ın membran bir 60 x 15 mm kültür tabak içinde explants gösterir.</li>
	<li>İstenen kültür sistemi içinde 96-şey plaka ise, Bruch'ın membran explant (çapı, katılaşmış özel jel ile 1,5 inç) laminin tarafı ile düz bir Teflon sayfada yukarı yerleştirin.</li>
	<li>Beş ya da altı, kesilmiş bir trephine kullanarak 6 mm-daire düğme Bruch'ın membran karmaşık gelen explant ve her % 4 özel üzerinde sigara tedavi polistiren de bir 96-şey plaka, 37 ° C'de yerleştirin. Özel Bruch'ın membran explants (düğme) her kuyunun düzeltmek için oda sıcaklığında 2-3 dakika içinde kuvvetlendirmek. Not: Şekil 2B trephined Bruch'ın membran düğmeleri bir 96-şey plaka gösterir. Genellikle, 9-11 düğmeleri veya explants her gözünden hasat edilebilir.</li>
</ol>3. insan Bruch'ın membran üzerinde retina Pigment epitel (RPE) hücre kültürü çalışmalarının Explants
<ol><li>Donör gözleri aldıktan sonra DPBS ile Gözdışı doku temiz. Çevresel bir kesi Iris sklera aşağıda 5 mm nokta (pars plana) subretinal boşluğa dokunmatik olun. Anterior segment, Vitre mizah ve retina atmak.</li>
	<li>Bruch'ın membran ve soğuk DPBS ile RPE levha içerir kadeh yıkayın. 5 mL % 0.25 tripsin artık her göz örnek için 10 dk daha için de RPE hücrelerle ayırmak. 50 mL tüp içinde 37 ° C'de ısındı % 15 fetal sığır serum (FBS) ile DMEM tam orta tripsin tepki 25 mL ile gidermek.</li>
	<li>200 × g 24 ° C'de 10 dakika için hücreleri santrifüj kapasitesi ve Pelet 5 mL DMEM tam orta resuspend (% 15 ile FBS).</li>
	<li>Hücreleri saymak ve antibiyotik içeren her çeşitli yaşlı Bruch'ın membran explants (düğme) 200 µL serum-Alerjik minimum temel medya (MEM) bir 96-şey plaka Bazal lamina üzerine 15.000 RPE hücrelerin tohum (100 IU/mL penisilin G, 100 mg / mL streptomisin, 5 mg/mL gentamisin ve 2,5 mg/mL Amfoterisin B). Bu yoğunluk kaplama 20 µm hücre çapını varsayarak RPE hücrelerinin kaplama alanı yaklaşık % 15'i karşılamak izin verir.</li>
	<li>Hücreleri sayede hücre yoğunluğu sonra stepwise kadar % 100 izdiham bağlı olarak her parametre etkisi hücre davranış için arttırılabilir düğmesi üzerine plaka.</li>
	<li>Hücreleri 37 ° C'de % 95'i air/5% CO2 oksijen bir ortamda 24 h için explant takmak izin Yavaşça orta sıcak tam DMEM ile değiştirin.</li>
</ol>

<ol><li>Murdaugh, L. S., Wang, Z., Del Priore, L. V., Dillon, J., Gaillard, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+accumulation+of+3-nitrotyrosine+and+nitro-A2E+in+human+Bruch%27s+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Age-related accumulation of 3-nitrotyrosine and nitro-A2E in human Bruch's membrane.</a> Exp. Eye Res. 90 (5), 564-571 (2010).</li>
<li>Wiradjaja, F., DiTommaso, T., Smyth, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basement+membranes+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Res+C+Embryo+Today%22%5BJournal%5D)">Basement membranes in development and disease.</a> Birth Defects Res C Embryo Today. 90 (1), 8-31 (2010).</li>
<li>Nystrom, A., Bornert, O., Kuhl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+therapy+for+basement+membrane-linked+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell therapy for basement membrane-linked diseases.</a> Matrix Biol. , (2016).</li>
<li>Pauleikhoff, D., Harper, C. A., Marshall, J., Bird, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+changes+in+Bruch%27s+membrane.+A+histochemical+and+morphologic+study%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Aging changes in Bruch's membrane. A histochemical and morphologic study.</a> Ophthalmology. 97 (2), 171-178 (1990).</li>
<li>Marshall, G. E., Konstas, A. G., Reid, G. G., Edwards, J. G., Lee, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+IV+collagen+and+laminin+in+Bruch%27s+membrane+and+basal+linear+deposit+in+the+human+macula%5BTitle%5D)+AND+%22Brit.+J.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Type IV collagen and laminin in Bruch's membrane and basal linear deposit in the human macula.</a> Brit. J. Ophthalmol. 76 (10), 607-614 (1992).</li>
<li>Sarks, S. H., Arnold, J. J., Killingsworth, M. C., Sarks, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+drusen+formation+in+the+normal+and+aging+eye+and+their+relation+to+age+related+maculopathy%3A+a+clinicopathological+study%5BTitle%5D)+AND+%22Brit.+J.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Early drusen formation in the normal and aging eye and their relation to age related maculopathy: a clinicopathological study.</a> Brit. J. Ophthalmol. 83 (3), 358-368 (1999).</li>
<li>Spraul, C. W., Lang, G. E., Grossniklaus, H. E., Lang, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histologic+and+morphometric+analysis+of+the+choroid%2C+Bruch%27s+membrane%2C+and+retinal+pigment+epithelium+in+postmortem+eyes+with+age-related+macular+degeneration+and+histologic+examination+of+surgically+excised+choroidal+neovascular+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Surv.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Histologic and morphometric analysis of the choroid, Bruch's membrane, and retinal pigment epithelium in postmortem eyes with age-related macular degeneration and histologic examination of surgically excised choroidal neovascular membranes.</a> Surv. Ophthalmol. 44 (Suppl 1), S10-S32 (1999).</li>
<li>Abdelsalam, A., Del Priore, L., Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drusen+in+age-related+macular+degeneration%3A+pathogenesis%2C+natural+course%2C+and+laser+photocoagulation-induced+regression%5BTitle%5D)+AND+%22Surv.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Drusen in age-related macular degeneration: pathogenesis, natural course, and laser photocoagulation-induced regression.</a> Surv. Ophthalmol. 44 (1), 1-29 (1999).</li>
<li>Mullins, R. F., Aptsiauri, N., Hageman, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+composition+of+drusen+associated+with+glomerulonephritis%3A+implications+for+the+role+of+complement+activation+in+drusen+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Eye%22%5BJournal%5D)">Structure and composition of drusen associated with glomerulonephritis: implications for the role of complement activation in drusen biogenesis.</a> Eye. 15 (Pt 3), 390-395 (2001).</li>
<li>Caldwell, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+alterations+precede+vascularization+of+the+retinal+pigment+epithelium+in+dystrophic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix alterations precede vascularization of the retinal pigment epithelium in dystrophic rats.</a> Curr. Eye Res. 8 (9), 907-921 (1989).</li>
<li>Pauleikhoff, D., Harper, C. A., Marshall, J., Bird, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+changes+in+Bruch%27s+membrane.+A+histochemical+and+morphologic+study%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Aging changes in Bruch's membrane. A histochemical and morphologic study.</a> Ophthalmology. 97 (2), 171-178 (1990).</li>
<li>Abdelsalam, A., Del Priore, L., Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drusen+in+age-related+macular+degeneration%3A+pathogenesis%2C+natural+course%2C+and+laser+photocoagulation-induced+regression%5BTitle%5D)+AND+%22Surv.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Drusen in age-related macular degeneration: pathogenesis, natural course, and laser photocoagulation-induced regression.</a> Surv. Ophthalmol. 44 (1), 1-29 (1999).</li>
<li>Spraul, C. W., Lang, G. E., Grossniklaus, H. E., Lang, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histologic+and+morphometric+analysis+of+the+choroid%2C+Bruch%27s+membrane%2C+and+retinal+pigment+epithelium+in+postmortem+eyes+with+age-related+macular+degeneration+and+histologic+examination+of+surgically+excised+choroidal+neovascular+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Surv+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Histologic and morphometric analysis of the choroid, Bruch's membrane, and retinal pigment epithelium in postmortem eyes with age-related macular degeneration and histologic examination of surgically excised choroidal neovascular membranes.</a> Surv Ophthalmol. 44, Suppl 1. S10-S32 (1999).</li>
<li>Del Priore, L. V., Tezel, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reattachment+rate+of+human+retinal+pigment+epithelium+to+layers+of+human+Bruch%27s+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Reattachment rate of human retinal pigment epithelium to layers of human Bruch's membrane.</a> Arch. Ophthalmol. 116 (3), 335-341 (1998).</li>
<li>Ho, T. C., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reattachment+of+cultured+human+retinal+pigment+epithelium+to+extracellular+matrix+and+human+Bruch%27s+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophth.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Reattachment of cultured human retinal pigment epithelium to extracellular matrix and human Bruch's membrane.</a> Invest. Ophth. Vis. Sci. 38 (6), 1110-1118 (1997).</li>
<li>Tezel, T. H., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reattachment+to+a+substrate+prevents+apoptosis+of+human+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Graefes+Arch.+Clin.+Exp.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Reattachment to a substrate prevents apoptosis of human retinal pigment epithelium.</a> Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 235 (1), 41-47 (1997).</li>
<li>Tezel, T. H., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF+beta+secretion+modulates+the+density-dependent+growth+of+pig+retinal+pigment+epithelium+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Res%22%5BJournal%5D)">TGF beta secretion modulates the density-dependent growth of pig retinal pigment epithelium in vitro.</a> Ophthalmic Res. 31 (3), 192-202 (1999).</li>
<li>Gullapalli, V. K., Sugino, I. K., Van Patten, Y., Shah, S., Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+RPE+survival+on+aged+submacular+human+Bruch%27s+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Impaired RPE survival on aged submacular human Bruch's membrane.</a> Exp. Eye Res. 80 (2), 235-248 (2005).</li>
<li>Wang, H., Yagi, F., Cheewatrakoolpong, N., Sugino, I. K., Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-term+study+of+retinal+pigment+epithelium+sheet+transplants+onto+Bruch%27s+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Short-term study of retinal pigment epithelium sheet transplants onto Bruch's membrane.</a> Exp. Eye Res. 78 (1), 53-65 (2004).</li>
<li>Tezel, T. H., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repopulation+of+different+layers+of+host+human+Bruch%27s+membrane+by+retinal+pigment+epithelial+cell+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophth.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Repopulation of different layers of host human Bruch's membrane by retinal pigment epithelial cell grafts.</a> Invest. Ophth. Vis. Sci. 40 (3), 767-774 (1999).</li>
<li>Tezel, T. H., Del Priore, L. V., Kaplan, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reengineering+of+aged+Bruch%27s+membrane+to+enhance+retinal+pigment+epithelium+repopulation%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophth.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Reengineering of aged Bruch's membrane to enhance retinal pigment epithelium repopulation.</a> Invest. Ophth. Vis. Sci. 45 (9), 3337-3348 (2004).</li>
<li>Castellarin, A. A., Sugino, I. K., Vargas, J. A., Parolini, B., Lui, G. M., Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+transplantation+of+fetal+human+retinal+pigment+epithelial+cells+onto+human+cadaver+Bruch%27s+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">In vitro transplantation of fetal human retinal pigment epithelial cells onto human cadaver Bruch's membrane.</a> Exp. Eye Res. 66 (1), 49-67 (1998).</li>
<li>Nguyen, H. V., Li, Y., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-specific+iPSC-derived+RPE+for+modeling+of+retinal+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Med%22%5BJournal%5D)">Patient-specific iPSC-derived RPE for modeling of retinal diseases.</a> J. Clin. Med. 4 (4), 567-578 (2015).</li>
<li>Fletcher, E. L., Jobling, A. I., Greferath, U., Mills, S. A., Waugh, M., Ho, T., De Longh, R. U., Phipps, J. A., Vessey, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+age-related+macular+degeneration+using+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Optometry+Vision+Sci%22%5BJournal%5D)">Studying age-related macular degeneration using animal models.</a> Optometry Vision Sci. 91 (8), 878-886 (2014).</li>
<li>Del Priore, L. V., Tezel, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reattachment+rate+of+human+retinal+pigment+epithelium+to+layers+of+human+Bruch%27s+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Reattachment rate of human retinal pigment epithelium to layers of human Bruch's membrane.</a> Arch. Ophthalmol. 116 (3), 335-341 (1998).</li>
<li>Tezel, T. H., Kaplan, H. J., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+of+human+retinal+pigment+epithelial+cells+seeded+onto+layers+of+human+Bruch%27s+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophth.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Fate of human retinal pigment epithelial cells seeded onto layers of human Bruch's membrane.</a> Invest. Ophth. Vis. Sci. 40 (2), 467-476 (1999).</li>
<li>Cai, H., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bruch+membrane+aging+alters+the+gene+expression+profile+of+human+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Bruch membrane aging alters the gene expression profile of human retinal pigment epithelium.</a> Curr. Eye Res. 31 (2), 181-189 (2006).</li>
<li>Moreira, E. F., Cai, H., Tezel, T. H., Fields, M. A., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reengineering+human+Bruch%27s+membrane+increases+rod+outer+segment+phagocytosis+by+human+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Transl.+Vis.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Reengineering human Bruch's membrane increases rod outer segment phagocytosis by human retinal pigment epithelium.</a> Transl. Vis. Sci. Technol. 4 (5), 10(2015).</li>
<li>Sun, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bruch%27s+membrane+aging+decreases+phagocytosis+of+outer+segments+by+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Vis%22%5BJournal%5D)">Bruch's membrane aging decreases phagocytosis of outer segments by retinal pigment epithelium.</a> Mol. Vis. 13, 2310-2319 (2007).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbiri bildirmek için herhangi bir ticari açıklamalar var.

Yaşlı insan Bruch'ın membran (hücre dışı matriks) AMD hastalık ilerleme katkıda bulunur ve böylece bu değiştirilmiş matris RPE hücre disfonksiyonu için nasıl katkıda bulunduğunu anlamak için gerek yoktur. Yaşa bağlı değişimler AMD eğitim için yeterli hayvan modellerin eksikliği göz önüne alındığında, hastalığın etkileri taklit ex vivo model sistemleri patofizyolojisi anlamak için değerli bir araç olarak hizmet verebilir. Bu el yazması açıklanan metodoloji tutarlı bir şekilde Bruch'ın membran explants ve kültür RPE hücrelerinin, birincil, ölümsüzleştirdi veya kök hücre kaynaklı RPE hücre hatları dahil olmak üzere insan yalıtmak için kullanılabilir.
Daha önce de belirtildiği gibi insan Bruch'ın membran explants NDRI kaynaklı. Bir iletişim kuralı kabul edilebilir donör gözler için ayarlanan ölçütleri belirten NDRI ile kuruldu. Örneğin, bağış yok bilinen retina göz hastalıkları olması gerekir, gözleri/küre içinde 10 h ölümünden sonra alınır ve küre 48 saat içinde laboratuvarda ölümünden sonra (yolu ile paket teslimâtı buzda) geliyor. Uygun yaş aralığı ve gözleri bir çalışma, örneğinistatistiksel analiz için gerekli sayısını belirtin., Küre bağış bağış yaşları 50-89 arasında beş dünya çift 20-49 yaşları arasındaki beş çift.
Genellikle on çifti küre kullanılabilir her ay ortalama göz küre kullanılabilirliği değişir. Göz paket temel, de-tanımlanan donör bilgi ile geldi: yaş, ırk, ölüm, ölüm nedeni, zamanı ve tıp tarihi (hastalık listesini ya da comorbidities) kısa.
En önemlisi, insan Bruch'ın membran explants hasat göz ve camsı RPE Bruch'ın membran-koroid kompleks izolasyon için sağlar, anterior segment kaldırılmasını gerektirir. Bruch'ın membran izole olduğunda, RPE hücrelerinin farklı konsantrasyonlarda acellular explants üzerine tohumlari ve aşağı akım deneyler için kültürlü. Hazırlık ve yordamsal işleme burada açıklandığı gibi kritik, laminal yüzeyi bakan-up sırasında değil müessir yüzeyin mekanik zarar görmesini önlemek için emin olmak için izole Bruch'ın membran yönünü dikkat hücre dışı matriks yüzey yapısı.
Bu da Bruch'ın membran explant sistemleri kullanırken, orada bireysel donör genomik arka plan gibi aşağı akım deneylerin sonuçlarını, yaş Bruch'ın membran veya Bruch'ın öldükten sonra zaman etkileyebilecek bazı değişkenler belirtilmelidir membran ve konumunu Bruch'ın membran, i.e., merkezi veya periferik Bruch'ın membran explants bir parçası. Herhangi bir diğer insan dokusu çalışma ile gibi gerekli istatistiksel gücü var ve donör göz yaşı uygunsa eşleştirmek için uygun donör göz örnek numarası işe gerekir. Göz bankaları gözlerinden kabul etmek için sıkı kriterleri kurulması önemli bir parametredir. Sadece gözleri bu az 10 h öldükten sonra enucleated ve hangi Bruch'ın membran hazırlık içinde 24-48 h ölümünden sonra hasat edilebilir kabul. Optik sinir site yönlendirmesi için bir işaretleyici olarak kullanılabilir ve aynı yerlerde kullanmak deneysel ve çalışma grupları denetlemek. Bu önlemler alarak, bir deneysel değişkenlik en aza indirebilirsiniz.
Özetle, RPE Bruch'ın membran-koroid karmaşık ve nasıl yaş ve hastalık etkilenen anlayışı patofizyolojisi katkısı AMD anlamak için önemlidir. Ex vivo teknikler istihdam modeli sistemleri insan dokusu kullanarak bu efektleri araştırmak için değerli bir araç vardır. Burada, biz insan donör explants yaşında Bruch'ın membran ilgili ex vivo modeli olarak istihdam bir metodoloji tanımlamak. Bu teknik bir nasıl matris içinde yapısal değişiklikleri araştırmak için bir araştırma aracı RPE overlaying etkileyebilir gibi yaşlı ve/veya hastalıklı insan Bruch'ın membran kullanmak izin verir ifade25 eki, yayılması ve gene de dahil olmak üzere hücre davranış , 27. başarılı benzer ex vivo modeli sistemlerinin geliştirilmesi AMD anlayışımız daha fazla ve yeni tedavi olanakları gelişimi kolaylaştırmak.

Yaşa bağlı nitrosative ve oksidatif stres de dahil olmak üzere birçok faktör tarafından neden olduğu insan Bruch'ın membran yapısal değişikliklere giderek artan retina pigment epitel (RPE) hücreleri ve katkıda işlevi birden çok zararlı etkileri Patoloji yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD)1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Hücre replasman tedavisi için gelişmiş atrofik AMD ya da coğrafi Atrofi dikkate alınarak, tedavi büyük olasılıkla RPE hücre Atrofi bir yatak üzerine hücrelerinin nakli gerektirir. Yaşa bağlı değişiklikler insan Bruch'ın membran içinde hasar için hücre dışı matriks6,9,10,11 verilen transplante RPE hücre Greftler başarısını olumsuz yönde etkilenebilir , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22. Bruch'ın membran Biyoloji ve nasıl matris içinde yapısal değişiklikler katkıda bulunmak için AMD ilerleme araştırılması insan hastalık patoloji anlamak için çok önemli. Böylece, ex vivo yaşlı ve/veya hastalıklı insan Bruch'ın membran hasat tarif protokolleri geliştirmek için yaşa bağlı göz alanındaki araştırmacılar için kritik bir ihtiyaç vardır.
Tarihsel olarak, bu modeli yaşa bağlı bozukluklar coğrafi atrofi ve hayvanlar23yaşında bir insan Bruch'ın membran gibi zor oldu. Bu zorluk birden fazla etkene kemirgenler ve modelleme hastalığı yanı sıra çoğu omurgalılar24yılında makula eksikliği için sık kullanılan diğer türler ile karşılaştırıldığında insanlar uzun ömürlü kaynaklanmaktadır. Burada açıklanan yöntemin avantajı hücreleri doğrudan yaşlı ve/veya hastalıklı bireylerin post mortem gözlerinden çıkarılan Bruch'ın membran üzerinde test edilebilir olduğunu. Bu makalede genel amacı yaşlı ve/veya hastalıklı insan Bruch'ın membran bir ex vivo modeli için detaylı bir metodoloji sağlamak için dahil olmak üzere insan Bruch'ın yalıtım membran insan bağış explants ve RPE tohum için hücreleri aşağı akım deneyler. Bu model hücre dışı matriks hasar RPE hücre işlevi ve patoloji20,25,26,27,28katkısını araştırmak için uygun bir model olarak hizmet verebilir.

<table><tbody><tr><td>İnsan donör küreleri</td><td>Ulusal Hastalık Araştırma Değişimi, NDRI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun modifiye kartal ortamı (DMEM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>Karbondioksitten bağımsız ortam</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18045-088</td><td></td></tr><tr><td>60 mm polistiren petri kabı</td><td>Corning Inc.</td><td></td><td></td>351007</tr><tr><td>Dulbecco'nun fosfat tamponlu tuzlu suyu, PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Hidrofobik 65 ve mikro; 0.2 & mikro ile m kalınlığında politetrafloroetilen membran; m gözenekler</td><td>Merck Millipore JGWP04700</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand cam mikroanaliz vakum filtre tutucu sistemi&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>09-753-102</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2576-5G</td><td></td></tr><tr><td>35 & times; 10mm kültür kabı</td><td>VWR International</td><td>25373-041</td><td></td></tr><tr><td>Trephine</td><td>Accutome</td><td>AM0570 60</td><td></td></tr><tr><td>96 kuyu plakası</td><td>Corning Inc.</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>Minimum temel ortam (MEM)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>11095-080&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin G</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3032-1MU</td><td></td></tr><tr><td>Streptomisin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6501</td><td></td></tr><tr><td>Gentamisin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1914</td><td></td></tr><tr><td>Amfoterisin B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1397-89-3</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum hidroksit çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1336-21-6 &nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

bir ex vivo modeli yaşlı insan bruch'ın membran bir retina pigment epitel hücrelerinin kültürü

Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane

Vitaminler ve antioksidanlar Age-Related göz hastalığı çalışma tarafından önerilen bir yana, olguların % 90'ı temsil eden "kuru" veya atrofik yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD) için hiçbir etkili tedavi vardır. Tedaviler yavaş veya coğrafi Atrofi (GA) gelişimi geri zekalı için gereklidir ve Bruch'ın membran patoloji anlama bu sürecin parçasıdır. İnsan Bruch'ın zarda değişiklik AMD ilerlemesini retina pigment epitel (RPE) damage hücre katkıda bulunarak koyun. AMD eğitim için yeterli hayvan modellerin eksikliği göz önüne alındığında, yaşlı insan Bruch'ın membran ex vivo modelleri gibi davranış RPE hücrelerinin çalışma için yararlı bir araç ölümsüzleştirdi ve birincil hücre hatları gibi RPE satırları İndüklenmiş pluripotent kök elde edilen hizmet hücreler (iPSCs). Burada, bir hasat insan Bruch'ın membran explants eki, Apoptozis ve yaygın, photoreceptor dış işbirliği yeteneği de dahil olmak üzere insan bağışçılardan numaralı seribaşı RPE hücre davranış etkilerini belirlemek izin verir ayrıntılı bir yöntem mevcut kesimi, polarizasyon ve gen ekspresyonu kurulması. Bu tahlil ex vivo modeli ne zaman yaşlı/tehlikeye hücre dışı matriks seribaşı RPE hücrelerinin fonksiyonel özelliklerini değerlendirmek için yaşlı Bruch'ın membran sağlar.

Bu iletişim kuralı düzgün gerçekleştirildiğinde, kimse RPE hücre işlevi yaşlı ve/veya hastalıklı insan Bruch'ın membran etkilerini polarite ve dış kan retina bariyerini kurulması, büyüme faktörleri ve sitokinler polarize salgılanmasını tarafından belirleyebilirsiniz, ve fagositoz photoreceptor çubuk dış segmentleri.
Biz-si olmak oluşturmak bir hastalık fenotip yaşlı insan Bruch'ın membran üzerinde göstermek veri. Örneğin, üzerinde RPE hücrelerinin kültür insan Bruch'ın membran explants azalır RPE hücre yatıştırıldı (şekil 3) yaşlı. Yaşlı insan Bruch'ın membran üzerinde kültürlü RPE hücrelerinin çubuk dış segmentleri (ROS), işbirliği için kapasitesini bu hücreler bir kritik RPE işlev (şekil 4) azaltır. Ayrıca, apoptotik hücre tespit ve terminal deoksinükleotidil transferaz dUTP nick son etiketleme (tünel) leke önceki iş26açıklandığı gibi kullanarak bu düğme explants karşılaştırıldığında. RPE hücre gen ifade profil bir yaşında ve/veya hastalıklı insan Bruch'ın membran etkilerini Mikroarray teknolojisi kullanılarak belirlenebilir. RPE hücre gen ekspresyonu insan Bruch'ın membran explants için genç bireyler (şekil 5)27karşılaştırıldığında büyük kişilerden kültürlü zaman değiştirilmez göstermiştir. İstatistiksel analiz için explants en az 3-5 insan bağışçılardan grubu başına kullanılır.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57084/57084fig1v2.jpg"> Şekil 1. Donör gözlerinden insan Bruch'ın membran izolasyon şematik gösterim. İnsan Bruch'ın membranlar sklera, anterior segment, retina, Vitre kaldırarak hasat ve yerel retina pigment epitel (RPE) hücreleri. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57084/57084fig1v2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57084/57084fig2.jpg"> Şekil 2. İnsan Bruch'ın membran (BM) bir kültür tabak içinde izole. (A) insan Bruch'ın membran explants (çapı, katılaşmış özel jel ile her 1,5 inç) şematik bir 60 × çanak altındaki sıcak sıvı özel dolu 15 mm polistren hücre kültür çanak (BM yukarı doğru) yerleştirilir. (B) bu birkaç 6 mm dairesel düğme (explants), trephined bir insan Bruch'ın membran explant her ow sonra yerleştirdiği bir sigara tedavi polistiren de bir 96-şey plaka, 37 ° C'de % 4 özel tarih. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57084/57084fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57084/57084fig3.jpg"> Şekil 3. Retina pigment epitel (RPE) hücre genç ve yaşlı insan Bruch'ın membran (BM) oranına yatıştırıldı. Bruch'ın membran explants--dan genç insan üzerine numaralı seribaşı birincil RPE hücrelerinin (&lt; 50 yaşında, n = 3) veya büyük (&gt; 70 yaşındaki, n = 5) donör gözler üç hafta için. Hücre eki hızı MTT hücre canlılığı tahlil tarafından ölçüldü. Büyük insan Bruch'ın membranlar $ RPE hücre eki oranı azaldı (8,54 + / genç BM 100 S.E. büyük BM 76.65 1,44 +/-vs S.E.). p &lt; 0,05, S.E. standart hata =.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57084/57084fig4.jpg"> Şekil 4. Retina pigment epitel (RPE) hücre fagositoz insan Bruch'ın membran (BM) yaşa göre etkilenir. Bruch'ın membran explants büyük insan kültürlü birincil RPE hücrelerinin çubuk dış segmentleri (ROS) işbirliği için azaltılmış bir yetenek vardı (9,3 +/-genç BM 873 S.E., n = 5 eski BM 608 25,4 +/-vs S.E., n = 5). p &lt; 0,01, S.E. standart hata =.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57084/57084fig5.jpg"> Şekil 5. Sayısı retina pigment epitel (RPE) hücre genler üzerinde genç kültürlü her örnek olarak ifade veya büyük insan Bruch'ın membran explants. Birincil RPE hücrelerinin üzerine numaralı seribaşı olarak ifade genlerin sayısının daha fazla dağılım oldu genç insan Bruch'ın membran karşı büyük (6201 ± 388 6439 ± 80, vs sırasıyla); Beş explants her yaş grubu için test edildi. Cai, tüm yazarların tam izni ile sunulan H ve ark. 27. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57084/57084fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Bu iletişim kuralı, yaşlı ve/veya hastalıklı insan Bruch'ın membran retina pigment epitel (RPE) hücre kültürü çalışmalarının göstermek için hedeftir. Bu yöntem RPE hücre davranış güvenliği aşılan bir hücre dışı matriks üzerinde çalışmaya uygundur.

Bir Ex Vivo modeli yaşlı insan Bruch'ın membran bir retina Pigment epitel hücrelerinin kültürü

Aside from vitamins and antioxidants recommended by the Age-Related Eye Disease Study, there is no effective therapy for &#34;dry,&#34;&#160;or atrophic ...

Bu deneysel prosedürün genel amacı, Bruch zarının retinal pigmental epitel hücrelerinin üst üste binmesi üzerindeki etkisini gözlemleyen Bruch zarı kültür sistemi olarak bilinen bir ex vivo-hücre dışı matris oluşturmaktır. Bu yöntem, AMD etiyoloji alanındaki RPE alt biyolojisinde, yaşlanmış Bruch zarlarındaki değişikliklerin üst üste binen RPE hücrelerinin arızalarına katkıda bulunup bulunmadığı gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, araştırmacıların doğal Bruch zarını farklı yaşlardaki bir insan-donör gözünden izole etmelerine ve bunları RPE hücre kültürlerinde proteomik çalışma için kullanmalarına izin vermesidir.Bruch zarını izole etmek ve doğal Bruch zarına minimum zarar verecek şekilde gerçek bir vivo kültür sistemi yapmak zordur, ancak bu videoda size nasıl yapılacağını göstereceğim. Başlamak için, CO2'den bağımsız DMEM'e batırılmış 1,5 inçlik bir gazlı bezi 100 milimetrelik bir tabağa yerleştirin. Ardından göz küresini gazlı bezin üzerine yükleyin.Daha sonra, limbusun üç milimetre arkasındaki sklera boyunca bir kesi yapmak için cerrahi bir bıçak kullanın. Ardından, tam kalınlıkta bir kesi yapmak için ince bıçaklı makas kullanın ve kesiği göz çevresinde her iki yönde de çevresel olarak uzatın. Ardından, kornea, lens ve iris dahil olmak üzere ön segmenti çıkarın ve atın.Ayrıca, vitreus ve retinayı atın. Ardından, Teflon kaplı bir spatula kullanarak RPE Bruch membran koroid kompleksini skleradan periferden optik sinire kadar dikkatlice soyun. Bu, membran kompleksini yırtmamak için çok dikkatli yapılmalıdır.Şimdi, sklerada dört radyal kesi yapmak ve sklerayı soymak için ince cerrahi makas kullanın. Daha sonra, Bruch membran koroid eksplantını optik sinirden kesin ve bu eksplantı DPBS'de 0.02 Molar amonyum hidroksit içeren 60 milimetrelik bir kaba aktarın. Doğal RPE hücrelerini çıkarmak için, bu eksplantı oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin.İnkübasyondan sonra, doku etrafında solüsyon akarken Bruch zarı üzerindeki optik sinir bölgesini Teflon kaplı forseps ile sabitleyerek eksplantı DPBS kullanarak üç kez yıkayın. Daha sonra, eksplantı, laminin tarafı yukarı bakacak şekilde karbondioksit içermeyen ortamda yüzdürün. Bruch zarı üzerinde dört kesi yapın ve ardından 0,2 mikron gözenekli lamine edilmemiş hidrofobik, 65 mikron kalınlığında bir PTFE membranı eksplant üzerine aktarın.Bunu bazal lamina ile PTFE membrana karşı ayarlayın. Tabaktaki fazla sıvıyı çıkarın, ardından düzeneği, fritlenmiş bir cam destek üzerine oturması gereken bir cam mikroanaliz vakumlu filtre tutucu sistemine aktarın. Daha sonra, bazal lamina ile temastan dikkatlice kaçınırken, Teflon kaplı forseps kullanarak koroidal tarafın kıvrılmış kenarlarını düzleştirin.Şimdi, DPBS'de 15 mililitre% 4 agarozu sıvılaştırın ve 37 santigrat dereceye kadar soğutun. Ardından, agarozu düz tutmak için hafif emme uygulayarak eksplantın koroidal tarafının üzerine yavaşça dökün. Jel katılaşmaya başladığında, zarla birlikte buz üzerinde 60 milimetrelik bir tabağa aktarın.Jelin iki ila üç dakika katılaşmasına izin verin ve ardından PTFE membranını soyun. Daha sonra, eksplantı DPBS'ye batırın ve ihtiyaç duyulana kadar dört santigrat derecede saklayın. Eksplantı% 4 sıvı agaroz ile kaplı 60 milimetrelik bir tabakta kültürlendirirken, Bruch zarını yukarı bakacak şekilde yapın.Polistiren kaplı 96 oyuklu bir plaka kullanarak kültür yaparken, jel kaplı Bruch membran eksplantını, laminin tarafı yukarı bakacak şekilde düz bir Teflon levha üzerine yerleştirin. Daha sonra, bir trephine kullanarak, eksplanttan altı ila sekiz altı milimetre düğme kesin ve doku düğmelerini sıvı agaroz ile yüklü kuyucuklara aktarın. Başlamak için, göz küresini daha önce olduğu gibi DPBS ile ıslatılmış bir gazlı bez üzerine yerleştirin.Daha sonra, iris-sklera temas noktasının, pars plana'nın beş milimetre altında, subretinal boşluğa çevresel bir kesi yapın. İç segmenti, vitreus mizahını ve retinayı atın. Ardından, bir transfer pipeti kullanarak, göz kabını iki ila üç mililitre soğuk DPBS ile yıkayın.Toplamda, göz kapağını üç kez yıkayın. Ardından, RPE hücrelerini ayırmak için, göz kabına 10 dakikaya kadar tripsin uygulayın. Daha sonra, tripsinizli RPE hücrelerini 50 mililitrelik bir tüpe aktarın ve reaksiyonu söndürmek için 37 santigrat derecede FBS ile 25 mililitre ortam ekleyin.Şimdi, dokuyu ve çözeltiyi 200 g'da 24 santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. Ardından, peleti% 15 FBS ile beş mililitre DMEM tam ortamında yeniden süspanse edin. Şimdi, hücreleri sayın ve 15.000 canlı RPE hücresini, 96 oyuklu plakadaki Bruch zarının her bir düğmesine antibiyotik içeren 200 mikrolitre serumsuz minimum esansiyel ortama yerleştirin.Hücreleri bağlanma için en az 24 saat kültürleyin. Daha sonra, tam DMEM'i ısıtmak için ortamı nazikçe değiştirin ve hücreleri kültürlemeye devam edin. Bu protokolü kullanarak, yaşlı ve hastalıklı insan Bruch zarları, üzerlerinde RPE hücreleri büyütülerek incelenebilir.Tipik olarak, yaşlanmış eksplantlar RPE hücresinin yeniden bağlanmasını azaltır. Yaşlı insan Bruch zarı üzerinde kültürlenen RPE hücreleri, kritik bir RPE işlevi olan çubuk dış segmentlerini daha az fagositize edebilir. Mikrodiziler kullanılarak, hücreler yaşlı bireylerden Bruch zarı üzerinde kültürlendiğinde, genç bireylerden alınan zar üzerinde kültürlenen hücrelere kıyasla, RPE hücre gen ekspresyonunun farklı olduğu bulundu.Bu videoyu izledikten sonra, Bruch zarını insan donör gözlerinden nasıl izole edeceğinizi ve RPE hücrelerinin kültürlenebileceği eksplantlar yapmayı iyi anlamalısınız. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde uygulanırsa yaklaşık üç saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, yüzeye zarar vermemek için Bruch membran eksplantının laminin tarafına diseksiyon aletleriyle dokunmamayı unutmamak önemlidir.Bu prosedürü takiben, RPE fagositozu ve RPE hücre gen ekspresyonu çalışmaları gibi diğer yöntemler, farklı yaştaki bir donörden veya yaşa bağlı makula dejenerasyonu olan donörlerden alınan bir Bruch zarının üst üste binen RPE hücre fonksiyonlarını etkileyip etkilemeyeceği gibi ek soruları yanıtlamak için gerçekleştirilebilir. Geliştirildikten sonra, bu teknik, yaşa bağlı makula dejenerasyonu alanındaki araştırmacıların, bir Bruch zarı ex vivo model sisteminde AMD'nin etiyolojisindeki mekanizmayı keşfetmelerinin yolunu açtı.

culturing-retinal-pigment-epithelial-cells-on-an-ex-vivo-model-aged

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Biz insan fetal retina pigment epitel hücreleri (hfRPE) hücrelerin kültür konfluent mono tabakaları, morfoloji, fizyoloji, polarite, ve yetişkin doğal doku protein ve gen ekspresyonu sergilediği için tekrarlanabilir bir yöntem sağlar. Bu çalışma, çeşitli göz hastalıkları bir hayvan modeli uzatıldı.

Retina Pigment Epitel Fizyoloji ve Patofizyoloji Çalışma Deneysel Modeller

İnsan gözünde özellikle Bruch zarı ile ilişkili proteinleri tanımlamak, yaşa bağlı makula dejenerasyonu gibi göz hastalıklarının arkasındaki biyokimyasal mekanizmaları anlamada önemli bir adımdır. Bu protokol, aşağı akış biyokimyasal analiz için bu hücre dışı matris tabakasının nasıl zenginleştirileceğini açıklar.

İnsan Donör Gözler gelen Bruch Membran zenginleştirilmesi

Retina pigment epitel hücreleri hücre-replasman tedavisi için Kuru yaşa bağlı makula dejenerasyonu gelişmiş form olarak hizmet verebilir. Bu iletişim kuralı coğrafi Atrofi büyük gözlü modeli ve hastalık bu modeline insan embriyonik kök hücre kaynaklı retina pigment epitel hücrelerinin nakli subretinal nesil açıklar.

Büyük gözlü manken coğrafi Atrofi, içine insan embriyonik kök hücre elde edilen retina Pigment epitel hücrelerinin subretinal nakli

Protokol, fare nöroretinasınınorganotipik eksplantlarını açıklar Retina pigment epiteliyle (RPE) birlikte yetiştirilen, R16 tanımlı ortamda, serum ve antibiyotik içermez. Bu yöntemin in vivo deneylere kıyasla gerçekleştirilmesi nispeten basit, daha az pahalı ve zaman alıcıdır ve çok sayıda deneysel uygulamaya uyarlanabilir.

Sağlam Retina Pigment Epitel ile Organotipik Fare Retina Eksplantlarının Uzun Süreli, Serumsuz Ekimi

Bu çalışma, eksplant kullanımı sırasında retina bütünlüğünü tehlikeye atmayı önleyen yeni bir insan organotipik retina kültürü (HORC) modeli geliştirmeyi amaçlamaktadır. Bu, retinanın aşırı vitreus ve alttaki retina pigment epitel-koroid (RPE-choroid) ve sklera ile kültleşmesi ile elde edilir.

Yeni bir İnsan Organotipik Retina Kültürü Tekniğinin Karakterizasyonu

Burada, birincil iris ve retina pigment epitel hücrelerini çeşitli memelilerden (fareler, sıçan, tavşan, domuz ve sığır) izole etmek ve transfekte etmek için bir protokol sunulmaktadır. Yöntem, insanlara aktarılabilir ex vivo analizleri ve in vivo çalışmalar için çeşitli kurulumlarda oküler gen tedavisi yaklaşımlarını incelemek için idealdir.

Viral Olmayan Gen Tedavisi için Memeli Primer Pigment Epitel Hücrelerinin İzolasyonu, Kültürü ve Genetik Mühendisliği

İlk olarak 20161'deFernandez-Godino ve arkadaşları tarafından bildirilen bu protokol, Transwell plakalarında bir hafta içinde işlevsel ve polarize bir RPE monolayer oluşturan fare RPE hücrelerini verimli bir şekilde izole etmek ve kültüre etmek için bir yöntem tanımlamaktadır. İşlem yaklaşık 3 saat sürer.

Birincil Fare Retina Pigment Epitel Hücrelerinin Verimli Diseksiyonu ve Kültürü

Bu yazıda retinal pigmente epitel (RPE) hücrelerinin fare gözlerinden kademeli olarak izole edilmesi için basitleştirilmiş bir protokol anlatılmaktadır. Protokol, fare gözlerinin enükleasyonunu ve diseksiyonunu, ardından RPE hücrelerinin izolasyonunu, tohumlanmasını ve kültürlenmesini içerir.

Primer Fare Retinal Pigmentli Epitel Hücrelerinin İzolasyonu

Burada, primer domuz retinal pigment epitel hücrelerinin in vitro olarak kültürlenmesi için takip edilmesi kolay bir yöntem sunulmaktadır.

Domuz Retinal Pigment Epitel Hücrelerinin Primer Kültürü

Retina pigment epiteli (RPE), koroid ve retina arasında çok önemli bir bariyer görevi görür ve fotoreseptörler gibi retina hücre tiplerinin sağlığını ve işlevini destekler. Burada, yetişkin murin RPE'yi izole etmek ve kültürlemek için basit ve etkili bir protokol açıklıyoruz.

Yetişkin Farelerden Retinal Pigment Epitel Hücrelerinin İzolasyonu ve Kültürü için Basitleştirilmiş Bir Yöntem

Öğrenin yaşlı insan Bruch membranı üzerinde retinal pigment epitel hücrelerinin ekz vivo kültürünü. Bu yöntem, yaşla ilişkili maküler dejenerasyon araştırmalarında hücre davranışlarını incelemek için kullanılır.

Bir Ex Vivo modeli yaşlı insan Bruch'ın membran bir retina Pigment epitel hücrelerinin kültürü

Daha fazla video keşfet