Name: Ara filamentler ve mikrotübüller 2 boyutlu doğrudan Stokastik optik imar mikroskobu ile görüntüleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-06T13:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 23 s
Description: Öğrenin, U373 hücrelerinde ara filamentler ve mikrotübüller için 2 boyutlu çift renkli dSTORM görüntüleme yöntemini. Bu teknik, sitoskelet ağların yüksek çözünürlüklü analizini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Mickael Lelek, Orestis Faklaris ve verimli tartışma için Nicolas Bourg, Andrey Aristov ve Elena Rensen süper çözünürlük tekniği ile ilgili yardım ve Shailaja Seetharaman şekilde alt alta yazılmalıdır dikkatli okumak için teşekkür ederiz. Minnetle anıyoruz Institut Pasteur UtechS fotonik BioImaging (Imagopole) Citech (Paris, Fransa) yanı sıra Fransız Ulusal araştırma Ajansı (ANR-10-INSB-04; tarafından desteklenen Fransa-BioImaging altyapı ağı Yatırımlar gelecek için) ve Région Ile-de-France (Domaine d programı ' Intérêt Majeur-Malinf) Elyra mikroskop kullanımı için. Bu eser tarafından desteklenmiştir Ligue Contre le kanser ve Fransız Ulusal araştırma Ajansı (ANR-16-CE13-0019).

1. Coverslips hazırlık (gün 1, 30 dk)
<ol><li>18-mm nº1.5H (+/-5µm 170 µm) cam coverslips plastik bir rafa yerleştirin.</li>
	<li>Aseton ve 5 min için emmek dolu bir 100 mL ölçek rafa koymak.</li>
	<li>Raf mutlak etanol ve 5 min için emmek dolu bir 100 mL kabı aktarın.</li>
	<li>Ultrasonik temizleyici cihazda kabı yerleştirin ve raf mutlak etanol ile dolu yeni bir 100 mL kabı transfer (malzemelerin tabloya bakın) oda sıcaklığında. "Tarih" basın ve 10 min için bekleyin.</li>
	<li>Laminar akış başlık altında rafa koymak ve kuru veya filtre uygulanmış hava akımı ile coverslips kuru coverslips yapalım.</li>
	<li>Coverslips ile raf bir plazma temizleyici cihazı yerleştirdim. Vakum pompası üzerinde geçiş, kapıyı kapat, vakum yapmak ve kısa bir süre sonra temizlendikten sonra plazma 1 dk. kullanım coverslips geçiş için 3 dakika bekleyin. Onları saklamak değil.</li>
</ol>2. hücre kaplama (gün 1, 20 dk)
<ol><li>Gliyal hücre kültürünü U373 içinde en az gerekli orta (MEM) % 10 Fetal sığır Serum, %1 penisilin-streptomisin ve % 1 gerekli olmayan amino asit ile 10 cm Çap plastik kabında büyümek.</li>
	<li>12-şey plakaları laminar akış başlık altında temiz cam coverslips yerleştirin ve Önceden ısıtılmış cep orta iyi başına 1 mL ekleyin.</li>
	<li>Hücre İnkübatör (37 ° C, % 5 CO2) hücreleri içeren bir tabak al.</li>
	<li>Orta kaldırın ve 10 mL PBS ekleyin.</li>
	<li>PBS kaldırın ve 1 mL % 0.05 ekleyin tripsin-EDTA.</li>
	<li>Kuluçka makinesi 2-3 dakika içinde geri çanak yerleştirin.</li>
	<li>Yemek olarak 37 ° C'de ısıtılmış sıcak orta 10 mL ekleyin ve hücreleri resuspend.</li>
	<li>Coverslips içeren 12-şey tabak (hücre ~ 150 µL) kuyuya başına tohum yaklaşık 100 000 hücre.</li>
	<li>En az 6 h (ya da bir gecede) hücre yayılmasını sağlamak bekleyin.</li>
</ol>3. hücre fiksasyon (2 gün, 2 saat)
<ol><li>80 mM borular, 7 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 150 mM NaCl, sitoiskeleti önbellekle hazırlamak ve pH 6,9 için ayarlayın.</li>
	<li>Hücreleri bir kez PBS ile yıkayın.</li>
	<li>PBS kaldır ve yavaşça çıkarma/fiksasyon çözüm kuyu başına 1 mL ekleyin (%0.25 oxazolidin, % 0.3 Triton X-100 sitoiskeleti arabelleği) 37 ° C'de ısıtılmış</li>
	<li>60 için kuluçkaya s, oda sıcaklığında.</li>
	<li>Çözümü kaldır ve yavaşça sitoiskeleti arabellekte seyreltilmiş Önceden ısıtılmış ve taze hazırlanmış %4 PFA (paraformaldehyde) çözüm kuyu başına 1 mL ekleyin. Uyarı: Kimyasal başlık altında iş ve eldiven kullanabilirsiniz.</li>
	<li>12-şey plaka da kuluçka 37 ° C'de 10 dakika geri koyun.</li>
	<li>PFA kaldırın ve PBS 3 mL iyi başına ekleyin. Not: Eldiven ile kimyasal başlık altında iş ve geri dönüşümlü PFA belirli bir depo gözünde koymak.</li>
	<li>İki kez PBS ile yıkayın.</li>
	<li>PBS kaldırın ve oxazolidin gelen autofluorescence gidermek için PBS içinde seyreltilmiş taze hazırlanmış 10 mM NaBH4 çözüm ekleyin.</li>
	<li>Oda sıcaklığında 7 min için kuluçkaya.</li>
	<li>Geri dönüşümlü NaBH4 belirli bir depo gözünde koymak.</li>
	<li>Üç kez 5 dk PBS ile yıkayın.</li>
	<li>PBS kaldırın ve engelleme çözüm (PBS içinde %5 BSA çözelti) ekleyin.</li>
	<li>Oda sıcaklığında (veya gecede 4 ° C'de) 1 h için kuluçkaya. Not: Sitoiskeleti arabellek oda sıcaklığında birkaç ay depolanabilir. İngiltere'de yılın, NaBH4 ve oxazolidin özel bakım (başlık, eldiven ve belirli geri dönüşüm kutuları) ile ele alınmalıdır. Çözümler eklenir ve yavaşça hücrelerin bütünlüğünü korumak için kaldırıldı. Kuru hücreleri izin önemlidir.</li>
</ol>4. Immunostaining (gün 2, 5h)
<ol><li>Birincil antikorlar anti-vimentin ve anti-tübülin 1:500 seyreltme engelleme çözümde bulunan kullanılarak çözüm hazırlamak.</li>
	<li>Seyreltilmiş birincil antikorlar 100 µL damla parafin film tabakası üzerinde koymak ve onları üstüne coverslips hücrelerle aşağı bakacak şekilde yerleştirin.</li>
	<li>2 h. PBS ile coverslips geri bir 12-şey tabak içinde dolu koymak için birincil antikorlar içeren hücreleri kuluçkaya. Durulama 5 min her zaman PBS üzerinde bir orbital Çalkalayıcı oda sıcaklığında için üç kez.</li>
	<li>Bu arada, ikincil antikorlar çözüm engelleme çözümde bir 1:1, 000 seyreltme adlı Anti-fare Alexa647 ve anti-sıçan Alexa555 kullanarak hazırlayın. Oda sıcaklığında 1 h için ikincil antikorlar içeren hücreleri kuluçkaya. 4.2 gibi devam edin. hücrelerin ışıktan korunması.</li>
	<li>Coverslip geri PBS ile dolu bir 12-şey plaka koymak. Durulama 5 min her zaman PBS üzerinde bir orbital Çalkalayıcı oda sıcaklığında için üç kez. PBS kaldırmak ve 0.5 mL 0,1 µm tetraspeck boncuk 1 µL ile karışık PBS ekleyin.</li>
	<li>Wells bir orbital Çalkalayıcı 30 dk. durulama PBS ile koymak. PBS kaldırmak ve hücreleri bir % 4 İngiltere'de yılın çözümde PBS ile 5 min için kuluçkaya. Üç kez PBS durulayın. Not: Birkaç hafta içinde PBS 4 ° C'de sabit hücreleri saklanabilir Immunostaining son anda yapılmalıdır.</li>
</ol>5. numune hazırlama (gün 3, 5 dk)
<ol><li>Aliquots MEA (cysteamine, 1 M, pH 8.3), glikoz oksidaz (100 x, 50 mg/mL), katalaz (500 x, 20 mg/mL) bir buz sepete koy.</li>
	<li>Tris-NaCl arabelleği 50 mL hazırlamak (50 mM Tris, 10 mM NaCl, pH = 8) glikoz (100 mg/mL) % 10'u ile desteklenmiştir.</li>
	<li>Arabellek hemen önce 10 mM MEA, 0,5 mg/mL (75 U/mL) glikoz oksidaz, 40 µg/mL katalaz (80-200 U/mL) ile görüntülemede görüntüleme 1.2 mL % 10 glikoz Tris-NaCl önbellekle hazırlayın.</li>
	<li>Manyetik örnek kutusunda (örneğin chamlide odası) etiketli hücreleri içeren coverslip dağ ve tamamen odası doldurmak için görüntüleme tampon ekleyin. Kapak koyun ve hiçbir hava kabarcığı görüntüleme arabellek ve kapak arasında olduğundan emin olun.</li>
	<li>Mutlak etanol ile örnek alt temiz ve sızıntı olmadığını doğrulayın. Düzgün gerekirse örnek sahibi imzalamaya yağ kullanın. Not: MEA çözüm (HCl kullanarak ayarlanır pH 8.3), glikoz oksidaz 50 mg/mL, hisse senedi ve katalaz, 20 mg/mL su stokunun 1 M stok hazırlamak, aliquots yapmak ve bana ve glikoz oksidaz ve katalaz için bir yıl için bir ay için-20 ° C'de depolayabilirsiniz. Aliquots refreeze değil. Tris-NaCl arabellek önceden hazırlamak ve birkaç ay için oda sıcaklığında saklayın. Glikoz deney (Adım 5.3) günü ekleyin.</li>
</ol>6. resim alma (3. gün, ~ 1h hücre başına)
<ol><li>Mikroskobunun geçin. Satın alma yazılımı geçin ve sistem Starttuşuna basın.</li>
	<li>Satın alma sekmesini genişletme Imaging kurulum aracı Kur Yöneticisi aracını grubunda seçin. Satın alma lazer WF (geniş alan) modunu seçin. 100 X NA 1.46 hedefi seçin. Aydınlatılmış görüş alanı azaltmak için bir kolimatör kullandığı TIRF u-HP modunu seçin ve lazer enerji daha küçük bir alanına konsantre. 100nm piksel boyutunu verir optovar 1.6 x objektif kullanın.</li>
	<li>Saat serisi aracını seçin ve zaman atlamalı 50 000 çerçeveler ve çerçeveler arasında 0.0 ms ayarlayın. Kanalları aracını edinme parametre araç grubunda genişletin ve "Tümünü göster" seçin.</li>
	<li>Alexa647 parça ayarla: 642 ve 405 lazer uyarma hatlarında ve bunları açmak için kabul kontrol edin. "655 LP" emisyon filtre Görüntüleme kurulumuseçin. "647" yeniden adlandırın.</li>
	<li>Tıklayın '+' kanalları aracı başka bir ışık geçişi eklemek ve modu seçin "makas her: çerçeve" Imaging kurulum aracında. 561, 488 ve 405 lazer satırları kontrol edin ve bunları açmak için kabul edin. Seçin "BP 570-650 + LP750" emisyon filtre ve kullanma optovar lens 1.6 x. TIRF-uHP modu işaretli olup olmadığını denetleyin. Parça "555" yeniden adlandırın.</li>
	<li>Toplama modu aracını seçin ve çerçeve boyutu 200 x 200 piksel olarak ayarlayın. Odak aygıtlar ve strateji aracını seçin ve (Eğer bir odak kilidi sistemi) 1.000 kişi karelere kesin odağı ayarlayın.</li>
	<li>Petrol hedefte ve örnek koydu. Yerleştirme sekmesini seçin ve floresan lamba çekim açın. Odağı bulmak ve hücrenin mercek kullanarak görüntüye bakın. Joystick kullanarak görüş alanı ortasına koymak.</li>
	<li>Geri alma moduna gitmek için satın alma sekmesini seçin. "647" dersi seçin, 642-lazer güç %0,2 olarak ayarlarsanız, 405-lazer güç 0 olarak ayarlayın, pozlama süresi 50 ms ve 50 kazanç için ayarla. Hücrenin üstünde belgili tanımlık perde gözlemlemek için sürekli Alım modunu seçin. Odağı ayarlayın. Görüş alanı içinde en az bir tetraspeck boncuk olduğundan emin olun, gerekirse görmek için kontrastı arttırmak. Bir Otomatik ölçek modu için kullanın. Snap tıklatarak vimentin ağ geniş alanlı epifluorescence görüntüsünü almak ve kaydedin. TIRF aydınlatma kontrol etmek için TIRF üzerinde tıklatın, aydınlatma ve/veya Kolimatör açısını aydınlatma homojen bir alanınız ve kaydetmek ayarlayın. Not: TIRF ve epifluorescent görüntüleri raw veri toplama başlamadan önce kaliteli olmalarını önemlidir. İş öğelerinin sürekli olmayan, non-birörnek etiketli filamentler neden kalitesiz dSTORM resimlere olmaktadır.</li>
	<li>"647" parça işaretini kaldırın ve seçin ve "555" parça. Mikrotubul ağ epifluorescence görüntüsünü alın ve kaydedin. TIRF görüntü çekmek ve çok kaydedin.</li>
	<li>"555" parça işaretini kaldırın, seçin ve "647" parça kontrol ardından süreklibasın. Kazanç 0 olarak koymak ve pozlama süresi 10 Bayan için 642-nm lazer güç Alexa647 boyalar en karanlık durum (~ 2 kW/cm2) pompa için % 100'e ayarlayın. Yanıp sönen fluorophores başladıktan sonra 15 ms maruz koymak ve 300 için kazanç. Aydınlatma TIRF modunu seçin. Olmadan otomatik ölçek aralığı gösterge modu tek molekül sinyalleri (kırmızı renkle gösterilir) kamera emdirmek değil doğrulamak için kullanın. Bu durumda, doygunluk kaybolana kadar kazanç azaltın. Tetraspeck boncuk satın başında doymuş kalacaktır. Hücre sürekli gözlem durdurmak için Dur tuşuna basın.</li>
	<li>Online işleme Aracı'nı genişletin ve fırtına görüntü alma sırasında görselleştirmek için PALM işleme Online kontrol edin. Aşağıdaki parametreleri kullanın: 9 için en yüksek maskesi boyutu (9 piksel çapı) ve en yüksek yoğunluk gürültü için 6. Tezler parametreleri (örtüşen yeterince parlak ve değil) işleme dikkate alınıp molekülleri tanımlayabilirsiniz. PAL-istatistik Aracı'nda, çizim türünü seçin: çubuk grafikve çubuk grafik kaynak: hassas. Satın alma Başlattuşuna basın.</li>
	<li>Satın alma sırasında gerekirse (hiçbir odak kilidi aygıt varsa) yönlendirmesi. (Pozlama, lazer gücü) parametrelerini ayarlamak ve sonunda (%0,001 fluorophores bir Orta yoğunluk 1 µm tek molekül arasında en az bir mesafe ile tutmaya başlayan) 405 nm lazer çizgi geçiş (> 9 piksel 100 nm, tepe maskesi boy) ( Şekil 1A-B). Molekül yoğunluğu biraz çok yüksek ise, TIRF yerine aydınlatma HILO (son derece eğimli ve lamine optik levha) modunu kullanın. Bu lazer güç % 20 oranında artacak. Yeniden oluşturulan resmi aşağıda histogramı yerelleştirme hassas zirvesine çevresinde veya altında 10 ortalanır emin olun nm. Not: Genellikle zamanla molekülleri sayısını azaltır ve 405 nm lazer gücü yavaş yavaş buna göre artar. Yerelleştirme duyarlık (süper çözümleme görüntüsünün altında görüntülenen çubuk grafik) altında 10 bir tepe ile mümkün olduğu kadar azaltmak için hedeftir nm (şekil 1 c). Gerekirse, çok fazla parlak boncuk alanında varsa PALM resmin zıtlığını artırın.</li>
	<li>10'dan fazla6 yerelleştirmeler (genellikle 40 000 kare sonra) ulaştığında film durdurmak için Dur tuşuna basın. Lazerler %0,2 geri koymak (642 nm) ve 0 (405 nm). Fırtına Alım ham veri .czi biçimiyle kaydedin. Parça "647" kanalları aracında, işaretini kaldırın ve seçin ve parça "555".</li>
	<li>Pozlama süresi için 25 ms ayarlayın ve 0'a kazanç. Sürekli düğmesine basın ve pompa Alexa555 boyalar karanlık durumuna (~ 2 kW/cm2 her) için % 100 488 ve 561 lazerler ayarla. Yanıp sönen, kazanç 250 için koymak fluorophores başladıktan sonra HILO aydınlatma modu kullanın ve tek molekülleri kameranın ölçüm göstergesi modu ile emdirmek değil olduğunu kontrol edin. Bu durumda, kazanç azaltın. Durtuşuna basın. 488-lazer gücü % 50 azaltmak.</li>
	<li>Satın alma Başlattuşuna basın. Satın alma sırasında giderek her zaman doygunluk limitte olmak kazanç artırın. Adım adım tek molekül bir Orta yoğunluk görüş alanı içinde (bkz: adım 6,18) tutmak için 405 nm lazer gücünü arttırın. 405 lazer 15 daha yüksek olduğunda % 20-30 488 lazer gücü azaltın. Sonra yavaş yavaş 488 molekülleri mümkün olduğunca hızlı yanıp sönen tutmak için 405 lazer çizgi artırırken azaltın. 405 lazer çizgi sadece üzerinde oranını artırır, ancak maksimum yoğunluk, 561 uyarma lazer ile birleştiğinde 488 lazer çizgi hem açık hem de kapalı fluorophores oranda artırır.</li>
	<li>Yok daha fazla molekül yanıp fazla 500 000 yerelleştirmeler (yaklaşık 20 000 kare sonra) ulaştığında satın alma ya da daha fazla durdurur. Fırtına Alım ham veri .czi biçimiyle kaydedin. Not: Her zaman diğer renkler (veya etkinleştirme) ağartma önlemek için daha yüksek dalga boyu ile başlar. Chamlide odası kapalı değil beri görüntüleme arabelleğin düzenli olarak, örneğin değiştirmek mümkündür farklı tampon koşullarda test etmek için. Alexa 555 boyalar tüketmek için 488 lazer çizgi kullanarak yalnızca 561 lazer güç (100 mW lazer ile) sınırlı olduğunda gereklidir.</li>
</ol>7. resim yeniden yapılanma (5 dk)
<ol><li>PAL-Drift Aracı'nda, 8 en fazla olacak boyutunu ile otomatik parçalarla modeli tabanlı düzeltme türünü kullanın. Drift düzeltilene kadar Uygula birkaç kez üst üste basın. Bu modeli tabanlı düzeltme drift düzeltir çapraz korelasyon analizi üzerinde alan bir algoritma uygular.</li>
	<li>PAL-filtresi araçlarını kullanarak, fırtına görüntünün görünümünü hangi en iyi lokalize molekülleri seçerek geliştirin. Örneğin, 30 Yerelleştirme kesinlik sınırı nm ve 120-180 nm için PSF.</li>
	<li>Piksel çözünürlüğe sahip 5 veya 10 nm PAL-render aracın yanı sıra bir Gauss görüntüleme modu, bir genişleme faktörü 1 seçin PSF Render auto dinamik alan HR %95 değeri ve Render auto dinamik alan SWF %90 değeri ile kullanın. Render en iyi Kalite'yi seçtiğinizde.</li>
	<li>PALM dönüştürmek, işleme sekmesi (son işlem modu) PALM menüsünden seçin. Seçin ve ardından Uygulatuşuna basın. Oluşturulan görüntü ile bir biçimde kaydedin. LSM (ve değil .czi, çok önemli). Not: Görüntü yeniden hemen satın alma veya sonraki satın alma yazılımı görüntü işleme modunu kullanarak sonra gerçekleştirilebilir. İşlem modu sonrası kapalı hattında yığınlar parametreleri (en yüksek maskesi boyutu, gürültü en yüksek yoğunluk) farklı değerlerle yeniden Çözümle mümkündür. Her zaman "örtüşen molekülleri atmak" ve "yerelleştirme önce ortalama değil" seçin.</li>
</ol>8. bir fırtına görüntü (10 dakika) yerelleştirme duyarlığını tahmini
<ol><li>Fırtına ham veri açın ve görüntü işleme sekmesini PALM yöntem ve sonra PALM tekrar kullanın. Seçtuşuna basın.</li>
	<li>9 ve 6 (veya görüntü için seçtiğiniz parametreleri) gürültü için en yüksek yoğunluk en yüksek maskesi boyutunu kullanarak yeniden başlatmak için Uygula tuşuna basın.</li>
	<li>Dikdörtgen grafik aracını seçin ve raw görüntü tek bir molekül cam yüzeyinde mevcut çevresinde bir dikdörtgen çizin. Genellikle bir kaç tek molekülleri orada vardır.</li>
	<li>Basın Uygula tekrar ve yalnızca dikdörtgen bölgesini içine mevcut molekülleri incelenecek.</li>
	<li>PAL-istatistik Aracı'nda, çizim türünü seçin: çubuk grafik ve çubuk grafik kaynak: X pozisyon ya da pozisyon histogramlar görselleştirmek için Y konumu.</li>
	<li>Görüntüleri aşağıda solda yerelleştirmeler listesi ile tabloyu kaydedin.</li>
	<li>Veri analizi, bir yazılım kullanarak oluşturmak histogramlar x ve Y konumları (şekil 1 d).</li>
	<li>Dağıtımları bir Gauss tarafından uygun ve σX ve σY değerlerini kaydedin. Yerelleştirme hassas σSMLM (σX *σ tarafındanY) tahmini ^ 0,5.</li>
	<li>Mümkün olduğunca çok sayıda molekülleri üzerinde 8.3-8.8 adımı yineleyin ve σSMLM ortalama
</li>
</ol>9. kanal kayıt (5 dk)
<ol><li>Fiji (görüntü J) yazılımını kullanarak her renkte fırtına görüntüyü açın.</li>
	<li>Her tetraspeck boncuk konumlarını ölçmek için Değnek aracını seçin.</li>
	<li>Her boncuk X ve Y tıklatınÇağrı hesaplamak ve onları ortalama.</li>
	<li>İkinci görüntü ile hesaplanan çevirmek için "Tercüme" komutunu kullanın X ve Y vardiya.</li>
	<li>Kanalları Birleştir komutunu kullanarak iki resim birleştirme.</li>
</ol>

<ol><li>Herrmann, H., Aebi, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intermediate+Filaments%3A+Structure+and+Assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Intermediate Filaments: Structure and Assembly.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 8 (11), (2016).</li>
<li>Huber, F., Boire, A., Lopez, M. P., Koenderink, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeletal+crosstalk%3A+when+three+different+personalities+team+up%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytoskeletal crosstalk: when three different personalities team up.</a> Curr Opin Cell Biol. 32, 39-47 (2015).</li>
<li>Leduc, C., Etienne-Manneville, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intermediate+filaments+in+cell+migration+and+invasion%3A+the+unusual+suspects%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Intermediate filaments in cell migration and invasion: the unusual suspects.</a> Curr Opin Cell Biol. 32, 102-112 (2015).</li>
<li>Heilemann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subdiffraction-resolution+fluorescence+imaging+with+conventional+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 47 (33), 6172-6176 (2008).</li>
<li>Gevaux, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nobel+Prize+in+Chemistry%3A+seeing+the+nanoscale%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Nobel Prize in Chemistry: seeing the nanoscale.</a> Nat Nanotechnol. 9 (11), 878(2014).</li>
<li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat Methods. 3 (10), 793-795 (2006).</li>
<li>Metcalf, D. J., Edwards, R., Kumarswami, N., Knight, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Test+samples+for+optimizing+STORM+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Test samples for optimizing STORM super-resolution microscopy.</a> J Vis Exp. (79), (2013).</li>
<li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nat Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).</li>
<li>Dempsey, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+user%27s+guide+to+localization-based+super-resolution+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A user's guide to localization-based super-resolution fluorescence imaging.</a> Methods Cell Biol. 114, 561-592 (2013).</li>
<li>van de Linde, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+with+standard+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes.</a> Nat Protoc. 6 (7), 991-1009 (2011).</li>
<li>Chazeau, A., Katrukha, E. A., Hoogenraad, C. C., Kapitein, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+neuronal+microtubule+organization+and+microtubule-associated+proteins+using+single+molecule+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Studying neuronal microtubule organization and microtubule-associated proteins using single molecule localization microscopy.</a> Methods Cell Biol. 131, 127-149 (2016).</li>
<li>Olivier, N., Keller, D., Rajan, V. S., Gonczy, P., Manley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+buffers+for+3D+STORM+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Simple buffers for 3D STORM microscopy.</a> Biomed Opt Express. 4 (6), 885-899 (2013).</li>
<li>Eliasson, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intermediate+filament+protein+partnership+in+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Intermediate filament protein partnership in astrocytes.</a> J Biol Chem. 274 (34), 23996-24006 (1999).</li>
<li>Leduc, C., Etienne-Manneville, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+microtubule-associated+motors+drives+intermediate+filament+network+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of microtubule-associated motors drives intermediate filament network polarization.</a> J Cell Biol. 216 (6), 1689-1703 (2017).</li>
<li>Gan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vimentin+Intermediate+Filaments+Template+Microtubule+Networks+to+Enhance+Persistence+in+Cell+Polarity+and+Directed+Migration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Syst%22%5BJournal%5D)">Vimentin Intermediate Filaments Template Microtubule Networks to Enhance Persistence in Cell Polarity and Directed Migration.</a> Cell Syst. 3 (5), 500-501 (2016).</li>
<li>Nieuwenhuizen, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-Orientation%3A+Quantifying+Simultaneous+Co-Localization+and+Orientational+Alignment+of+Filaments+in+Light+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Co-Orientation: Quantifying Simultaneous Co-Localization and Orientational Alignment of Filaments in Light Microscopy.</a> PLoS One. 10 (7), e0131756(2015).</li>
<li>Yang, Z., Wang, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+fibrillary+acidic+protein%3A+from+intermediate+filament+assembly+and+gliosis+to+neurobiomarker%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glial fibrillary acidic protein: from intermediate filament assembly and gliosis to neurobiomarker.</a> Trends Neurosci. 38 (6), 364-374 (2015).</li>
<li>Maslehaty, H., Cordovi, S., Hefti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symptomatic+spinal+metastases+of+intracranial+glioblastoma%3A+clinical+characteristics+and+pathomechanism+relating+to+GFAP+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurooncol%22%5BJournal%5D)">Symptomatic spinal metastases of intracranial glioblastoma: clinical characteristics and pathomechanism relating to GFAP expression.</a> J Neurooncol. 101 (2), 329-333 (2011).</li>
<li>Hol, E. M., Pekny, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+fibrillary+acidic+protein+%28GFAP%29+and+the+astrocyte+intermediate+filament+system+in+diseases+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Glial fibrillary acidic protein (GFAP) and the astrocyte intermediate filament system in diseases of the central nervous system.</a> Curr Opin Cell Biol. 32, 121-130 (2015).</li>
<li>Skalli, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytoma+grade+IV+%28glioblastoma+multiforme%29+displays+3+subtypes+with+unique+expression+profiles+of+intermediate+filament+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Pathol%22%5BJournal%5D)">Astrocytoma grade IV (glioblastoma multiforme) displays 3 subtypes with unique expression profiles of intermediate filament proteins.</a> Hum Pathol. 44 (10), 2081-2088 (2013).</li>
<li>Endesfelder, U., Malkusch, S., Fricke, F., Heilemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+to+estimate+the+average+localization+precision+of+a+single-molecule+localization+microscopy+experiment%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A simple method to estimate the average localization precision of a single-molecule localization microscopy experiment.</a> Histochem Cell Biol. 141 (6), 629-638 (2014).</li>
<li>Whelan, D. R., Bell, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+artifacts+in+single+molecule+localization+microscopy%3A+why+optimization+of+sample+preparation+protocols+matters%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Image artifacts in single molecule localization microscopy: why optimization of sample preparation protocols matters.</a> Sci Rep. 5, 7924(2015).</li>
<li>Ovesny, M., Krizek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ThunderSTORM%3A+a+comprehensive+ImageJ+plug-in+for+PALM+and+STORM+data+analysis+and+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging.</a> Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).</li>
<li>Olivier, N., Keller, D., Gonczy, P., Manley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+doubling+in+3D-STORM+imaging+through+improved+buffers%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Resolution doubling in 3D-STORM imaging through improved buffers.</a> PLoS One. 8 (7), e69004(2013).</li>
<li>Nahidiazar, L., Agronskaia, A. V., Broertjes, J., van den Broek, B., Jalink, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+Imaging+Conditions+for+Demanding+Multi-Color+Super+Resolution+Localization+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Optimizing Imaging Conditions for Demanding Multi-Color Super Resolution Localization Microscopy.</a> PLoS One. 11 (7), e0158884(2016).</li>
<li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+super-resolution+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy.</a> Science. 319 (5864), 810-813 (2008).</li>
<li>Mikhaylova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+bundled+microtubules+using+anti-tubulin+nanobodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Resolving bundled microtubules using anti-tubulin nanobodies.</a> Nat Commun. 6, 7933(2015).</li>
<li>Nieuwenhuizen, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+image+resolution+in+optical+nanoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Measuring image resolution in optical nanoscopy.</a> Nat Methods. 10 (6), 557-562 (2013).</li>
<li>Schnitzbauer, J., Strauss, M. T., Schlichthaerle, T., Schueder, F., Jungmann, R. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/nprot.2017.024">Super-resolution microscopy with DNA-PAINT.</a> Nat Protoc. 12 (6), 1198-1228 (2017).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının bildirin.

İletişim kuralı kritik adımlar
Burada hangi mikrotübüller dSTORM görüntülerini eserleri ve IFS gliyal hücreler içinde en aza indirgemek bir iletişim kuralı mevcut. Eserler numune hazırlama ve görüntüleme her adımda oluşturulan: engelleme, fiksasyon, immunolabeling, drift satın alma sırasında uygun olmayan yanıp sönen koşulları23. Biz en kritik adımları listelenmektedir.
Coverslips temizlik fluorophores yüzeyi non-spesifik bağ...

Sitoplazmik ara filamentler (IFS) 10 nm-çapı homo - ya da eğer proteinlerin hücre türü belirli alt heteropolymers vardır. IFS çok sayıda hücre hareketliliği, yayılmasını önleme ve stres yanıt gibi hücresel işlevler katılmak. Onların önemli rol ile 90'dan fazla insan hastalıkları doğrudan Eğer proteinlerde mutasyonlar neden aslında vurgulanır; Örneğin, eğer bileşiminde değişiklikler tümör büyüme ve1,2,3yayılan eşlik eder. İşbirliği-e doğru kontrol hücresel fonksiyonları hücre polarizasyon, bölünme ve geçiş2,3gibi üç sitoiskeleti sistemi çalışmalarında kanıt orada büyüyor. Kayma mimarisi ve işlevler arasında sıkı bir bağlantı olduğundan, bu anlayışı ile diğer filamentler Eğer yapısal organizasyonu içine alın ve hücre iskeleti çapraz-hadis daha iyi anlamak çok önemlidir. Bu makalede süper çözünürlük tekniği çift renkli dSTORM (doğrudan Stokastik optik imar mikroskobu)4 ve arasındaki etkileşimi araştırmak için nasıl kullanıldığına ve mikrotübüller gerçekleştirmek için bir protokol sağlar sabit, kültürlü hücreler 2 boyutlu (2D).
Geçtiğimiz birkaç süper çözümleme teknikleri geliştirilmiştir on yıl ve orada keşifler Nobel Kimya Ödülü kökeni 20145idi. Tüm bu tekniklerin arasında tek molekül yerelleştirme tabanlı yöntemleri kullanan photoswitchable floresan proteinler, PALM gibi6 (Photo-Activated yerelleştirme mikroskobu) fırtına7 fluorophores veya dSTORM4 çift ile yatıyor geleneksel fluorophores ile. Tüm bu yöntemler (i) anahtarı floresan gazetecilere çoğunun "kapalı" bir duruma oluşan aynı ilkeye dayanır"(non-floresan), (II) bir alt kümesini bir floresan içine Stokastik aktivasyonu devlet yerelleştirmek için onların uzamsal konumu nanometre doğruluk ve (III) fluorophores mümkün olduğunca çok sayıda alt kümeleri etkinleştirmek için bu işlem tekrarı. Son görüntü etkin moleküllerin ~ 20-40 yanal çözünürlük sağlayan tüm yerelleştirmeler kullanarak yeniden düzenlenir nm. Birkaç ticari optik sistemleri PALM/fırtına izin şimdi biyologlar rutin deneyler için kullanılabilir. Burada, böyle bir sistem mikrotübüller ve IFS yapısal Derneği Eğitim için kullanıldı. Çok ince lamel bölgeleri gözlemlemek için de uygundur çünkü tüm tek molekül yerelleştirme tabanlı yöntemleri arasında çift renkli dSTORM tekniği, seçildi (< 1 µm) yapisan hücre ve görüntü çözünürlüğü ile önemli gelişme sağlayabilir en az zaman ve para yatırım. Gerçekten de, dSTORM hücresel boyama ve ayirt için rutin olarak kullanılan standart organik Boyar maddeler ile uyumlu bir çok uygun ve çok yönlü bir tekniktir.
Bir renk dSTORM görüntüleri fluorophore Alexa6478kullanarak elde etmek nispeten basit olmakla birlikte, özellikle ne zaman var sınırlı iki boya düzgün seçilmiş arabellekte yanıp böylece deneysel koşullar optimize etmek için çift renk dSTORM gerektirir lazer güç. Mükemmel kağıtları zaten yöntemlerde çok renkli görüntüleme dSTORM9,10,11,12,13ile ayarlamak için kullanılabilir ve bu belgeleri açıklamak içinde ayrıntı olası kaynakları eser ve bozulmuş görüntü çözünürlüğü yanı sıra nasıl bunların üstesinden. Bu makalede, en iyi deneysel koşullar açısından hücreleri fiksasyon, immunostaining, numune hazırlama, görüntüleme edinme ve görüntü yeniden yapılanma yoğun sitoplazmik Eğer ağlar ve mikrotübüller içinde görüntüleri elde etmek için açıklanmıştır Çift renkli dSTORM gliyal hücrelerle. Kısaca, Chazeau ve ark12 ' açıklanan çıkarma/fiksasyon yöntemi gliyal hücreler için adapte oldu ve sonrası fiksasyon adım ile en iyi duruma getirilmiş antikorlar konsantrasyon kullanılan, 10 mM ile bir fırtına tampon MEA Dempsey9 oldu vd. tarif örnek türü ve deneysel kurmak için en uygun bulunmuştur.
Gliyal hücreler esas olarak hızlı Eğer proteinlerin üç türü: vimentin, testin ve GFAP'nin (gliyal asidik fibrillary protein). Bu üç proteinler astrocytes14' te ortak polimerize gösterilmiştir. Biz daha önce yapılandırılmış süper çözünürlük aydınlatma mikroskobu (SR SIM) bu üç Eğer proteinler aynı tek Eğer filaman içinde bulunabilir ve bunlar gliyal hücreler 15dakika içinde benzer dağıtım ve dinamik görüntüler gösterdi. Üç Eğer proteinler arasındaki benzerlikleri nedeniyle vimentin boyama tüm Eğer ağ için muhabir olarak kullanıldı. DSTORM kullanarak, biz nasıl eğer form demetleri kırınım ile mümkün değildi mikrotübüller boyunca mikroskobu teknikleri15sınırlı gidermek başardı. Bu gözlemler vimentin IFS şablon mikrotübüller nasıl anlayabilirim ve hücre göç16sırasında bir polarizasyon ekseni bakım teşvik onların büyüme yörünge düzenleyen yardımcı olabilir. Süper çözünürlük fotoğraf anahtar bilgileri iki hücre iskeleti alt sistemlerin karşılıklı etkileşimi üzerinde sağlanan ve kayma Derneği ve hücre tipi belirli17olabilir yerel işlev arasındaki bağlantıyı bir anlayış getirdi. Genel olarak, iyi immunostaining koşulları yoğunluğu ve özgüllük açısından ulaşmış olması koşuluyla çift renkli dSTORM hücre iskeleti elemanları veya organelleri, diğer türleri arasında çapraz karışma eğitim için kullanılabilir. Bu teknik daha iyi astrogliosis sırasında ve glioblastoma sitoiskeleti değişiklikleri tanımlamak yararlı olacak, burada eğer proteinlerin deyimidir merkez sinir sisteminin en yaygın ve en kötü huylu tümör 18 değişmiş ,19,20,21.

<table><tbody><tr><td>Minimum Esansiyel Medya (MEM)</td><td>Gibco</td><td>41090-028</td><td>hücre kültürü</td></tr><tr><td>esansiyel olmayan amino asit</td><td>Gibco</td><td>1140-050</td><td>hücre kültürü 1/100e</td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>hücre kültürü 1/100e</td></tr><tr><td>F&oelig; tal Sığır Serumu</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td>hücre kültürü 1/10e</td></tr><tr><td>0,05 % Tripsin-EDTA (1X)</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>hücre kültürü</td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>fischer bilimsel</td><td>11540486</td><td>hücre kültürü</td></tr><tr><td>lamel 18 mm n&deg; 1,5H</td><td>Marienfield/Dominic dutsher</td><td>900556</td><td>lamel</td></tr><tr><td>paraformaldehit (PFA) çözeltisi</td><td>Sigma</td><td>F8775</td><td>hücre fiksasyonu</td></tr><tr><td>glutaraldehit</td><td>Sigma</td><td>G5882</td><td>hücre fiksasyonu</td></tr><tr><td>triton X100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td>iyonik olmayan yüzey aktif madde. Hücre fiksasyonu için kullanılır</td></tr><tr><td>sodyum borhidrür (NaBH4)</td> <td>Sigma</td><td>452904-25ML</td><td>hücre fiksasyonu</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td>numune pasivasyonu PBS'de %3</td></tr><tr>Fare <td>Sigma</td><td>V6630</td><td>primer antikorlarında</td><td>üretilen Monoklonal Anti-Vimentin (V9) antikoru</td></tr><tr><td>Sıçan anti alfa tübülin</td><td>Biorad</td><td>MCA77G</td><td>primer antikorları</td></tr><tr><td>Keçi anti-sıçan IgG (H + L) İkincil Antikor, Alexa Fluor 555</td><td>Fisher bilimsel</td><td>10635923</td><td>ikincil antikorlar</td></tr><tr><td>Eşek anti-Fare IgG (H + L) İkincil Antikor, Alexa Fluor 647</td><td>Fisher bilimsel</td><td>10226162</td><td>ikincil antikorlar</td></tr><tr><td>TetraSpeck Mikroküreler, 0.1 ve mikro; m, floresan mavi/yeşil/turuncu/koyu kırmızı</td><td>Fisher scientific</td><td>T7279</td><td>floresan boncuklar</td></tr><tr><td>Şamlı manyetik oda</td><td>Canlı Hücre Aleti</td><td>CM-B18-1</td><td>manyetik numune tutucu, maksimum hacim 1,2 mL</td></tr><tr><td>Yanıp sönen tampon için</td><td>Sisteamin (MEA)</td> <td>Sigma</td><td>30070</td></tr><tr><td>Aspergillus nijer'den glikoz oksidaz</td><td>Sigma</td><td>G0543</td> yanıp <td>sönen tampon için</td></tr><tr><td>Sığır</td> karaciğerinden <td>yanıp sönen tampon</td>katalaz için glikoz <td>sigma</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Yanıp sönen tampon için</td><td>Sigma</td><td>C9322</td></tr><tr><td>Tris (trizma)</td>Yanıp <td>sönen tampon için</td> <td>Sigma</td><td>T1503</td></tr><tr><td>Wash-N-Dry lamel rafı</td><td>Sigma</td><td>Z688568</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma</td><td>P7793-1EA</td><td>parafin film</td></tr><tr><td>ultrasonik temizleyici</td><td>Fisher scientific</td><td>15-335-6</td><td></td></tr><tr><td>plazma temizleyici</td><td>Harrick plazma</td><td>PDC-32G-2</td><td></td></tr></tbody></table>

ara filamentler ve mikrotübüller 2 boyutlu doğrudan stokastik optik imar mikroskobu ile görüntüleme

Imaging Intermediate Filaments and Microtubules with 2-dimensional Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy

Aktin microfilaments, mikrotübüller ve ara filamentler (Eğer), oluşan sitoiskeleti hücre şekil, polarizasyon ve motilite kontrol önemli bir rol oynar. Aktin ve Mikrotubul ağları organizasyonu kapsamlı eğitim gördü ama bu IFS değil henüz tam olarak karakterize edilir. IFS hücre sitoplazma uzanan bir ağda bir ortalama çapı 10 nm ve formu vardır. Onlar fiziksel olarak aktin ve mikrotübüller moleküler motorlar ve hücre iskeleti halkalı ile ilişkilidir. Bu sıkı ilişki çoğu hücre fonksiyonları için gerekli üç hücre iskeleti ağ koordine Yönetmeliği sağlamak düzenleyici mekanizmaları kalbinde olduğunu. Bu nedenle IFS yalnız ve aynı zamanda ağların her biri diğer hücre iskeleti ile birlikte görselleştirmek önemlidir. Ancak, eğer ağlar, birçok hücre türü, özellikle gliyal hücreler, içinde son derece yoğun çözünürlüğü standart floresan mikroskobu ile ulaşmak çok zor kılan (lateral Görüntü çözünürlüğünün ~ 250 nm). Doğrudan Stokastik optik imar mikroskobu (dSTORM) bir kazanç bir büyüklük yanal çözünürlük sağlayan bir tekniktir. İşte, lateral dSTORM çözünürlüğü yoğun organizasyon Eğer ağlar ve özellikle, eğer demetleri mikrotübüller çevreleyen gidermek için yeterli olduğunu göstermektedir. Böyle sıkı dernek bu iki ağ ve Mayıs koordine yönetmelikte katılmak, açıklamak olasıdır nasıl vimentin IFS şablon Mikrotubul organizasyon stabilize ve Mikrotubul bağımlı veziküler kaçakçılığı etkileyebilir. Daha genel olarak, biz nasıl iki hücre iskeleti bileşeni çift renkli dSTORM tekniği ile gözlenmesi karşılıklı etkileşimlerini içine yeni bir bakış açısı getiriyor gösterir.

Mikroskop 512 x 512 kamera, bir alfa planı Apo 100 X 50 mW 405 nm ve 100 mW 488, 561 ve 642 nm katı hal lazerleri, bir EMCCD ile donatılmış / 1,46 objektif ve grubu 570-650 Pass / uzun 655 emisyon filtreler geçiş temsilcisi sonuçları aşağıda sunulan için kullanıldı.
Şekil 1A raw resim alma sırasında kullanılması gereken gürültü oranı sinyal ve molekül yoğunluğu bir örnek verir. İyi kalitedeki görünt...

Bu metodoloji genel amacı en iyi deneysel koşullar numune hazırlama resim alma ve yeniden yapılanma için 2D çift renk dSTORM görüntülerini mikrotübüller ve ara filamentler sabit hücrelerde gerçekleştirmek için vermektir

Ara filamentler ve mikrotübüller 2 boyutlu doğrudan Stokastik optik imar mikroskobu ile görüntüleme

The cytoskeleton, composed of actin microfilaments, microtubules, and intermediate filaments (IF), plays a key role in the control of cell shape, ...

Bu metodolojinin genel amacı, sabit hücrelerde mikrotübüllerin ve ara filamentlerin 2D çift renkli D-STORM görüntülemesini gerçekleştirmek için numune hazırlamadan görüntü elde etmeye ve yeniden yapılandırmaya kadar en uygun deneysel koşulları yaratmaktır. Bu yöntem, ara filamentler ve mikrotübüller gibi yoğun ve karmaşık hücre iskeleti ağları arasındaki fiziksel etkileşimlerin karakterize edilmesine yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, geleneksel floresan mikroskobu ile çözülemeyen hücresel yapıların gözlemlenmesine izin vermesidir.Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir, çünkü numune hazırlamanın kontrolü ve bornoz bağlama verilerinin elde edilmesi, artefakt oluşumunu sınırlamak için çok önemlidir. U373 hücrelerini metin protokolüne göre büyüttükten sonra, hücreleri önce bir kez yıkamak için PBS kullanarak düzeltin. Daha sonra, PBS'yi çıkarın ve önceden ısıtılmış ekstraksiyon fiksasyon çözeltisinin oyuğu başına bir mililitre ekleyin.Hücreleri oda sıcaklığında 60 saniye inkübe edin. Daha sonra çözeltiyi çıkarın ve hücre iskeleti tamponunda seyreltilmiş taze hazırlanmış ve önceden ısıtılmış% 4 PFA oyuğu başına bir mililitre ekleyin. 12 oyuklu plakayı 10 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübatöre geri yerleştirin.Ardından PFA'yı çıkarın ve kuyucuk başına üç mililitre PBS ekleyin. Hücreleri iki kez yıkamak için PBS kullanın. Daha sonra PBS'yi çıkarın ve glutaraldehitten otofloresanı söndürmek için PBS'de seyreltilmiş taze hazırlanmış 10 milimolar sodyum borohidrür ekleyin.Hücreleri oda sıcaklığında yedi dakika inkübe edin ve geri dönüştürülmüş sodyum borhidrürü belirli bir kutuya aktarın. Kuyuları her biri beş dakika boyunca üç kez yıkamak için PBS'yi kullanın. Ardından PSB'yi çıkarın ve bir engelleme çözümü olarak PBS'ye %5 BSA ekleyin.Numuneleri immün boyadıktan ve metin protokolüne göre tamponlarda çözeltiler hazırladıktan sonra, etiketli hücreleri içeren lamel manyetik bir numune tutucuya monte edin. Ve hazneyi tamamen doldurmak için görüntüleme tamponunu ekleyin. Kapağı uygulayın ve görüntüleme arabelleği ile kapak arasında hava kabarcığı olmadığından emin olun.Mutlak etanol kullanarak numunenin altını temizleyin ve sızıntı olmadığını doğrulayın. Daha sonra gerekirse, numune tutucuyu düzgün bir şekilde kapatmak için gres kullanın. Görüntülemeyi gerçekleştirmek için mikroskobu ve edinme yazılımını açın.100 kat NA 1.46 objektif, 1.6 kat Optivar lens ve TIRF UHP modunu kullanarak çekim parametrelerini metin protokolüne göre ayarlayın. Alexa Fluor 647 ile etiketlenmiş vimentin filamentlerini görüntülemek için bir 647 izi oluşturun. 405 ve 642 nanometre lazer çizgilerini ve LP 655 emisyon filtresini seçin.Ardından, Alexa Fluor 555 ile etiketlenmiş mikrotübülleri görüntülemek için bir 555 izi oluşturun. Floroforları ve BP 570 ila 650 emisyon filtresini görüntülemek için 561, 488 ve 405 nanometre lazer çizgilerini seçin. Ardından, objektife yağ ekleyin ve numuneyi lensin üzerine yerleştirin.Ardından, bul sekmesini seçin ve floresan lambanın deklanşörünü açın. Odağı bulun ve görüntülenecek hücreleri aramak için göz merceğini kullanın. Ardından, hücreleri alanın ortasına yerleştirmek için oyun çubuğunu kullanın.Edinme moduna dönmek için edinme sekmesine tıklayın. Ardından 647 izini seçin ve 642 lazer gücünü %0,2'ye ve 405 lazer gücünü minimum değerine ayarlayın. Pozlama süresini 50 milisaniyeye ve kazancı 50 milisaniyeye ayarlayın.Ardından, hücreyi ekranda gözlemlemek için sürekli alım modunu seçin. Görüş alanında en az bir floresan boncuk olduğundan emin olun. Ekran için bir otomatik ölçeklendirme modu kullanın ve odağı ayarlayın.Ardından, snap'e tıklayarak vimentin ağının geniş alan epifloresan görüntüsünü alın ve görüntüyü kaydedin. TIRF aydınlatmasını kontrol etmek için TIRF'e tıklayın, devamlı'ya basın, homojen bir aydınlatma alanına sahip olmak için alım parametrelerini ayarlayın. Ardından tutturma düğmesine basın ve görüntüyü kaydedin.555 parçasını kontrol edin. 647 parçasının işaretini kaldırın ve 555 parçasını seçin. Mikrotübül ağının epifloresan görüntüsünü alın ve kaydedin.Ardından bir TIRF görüntüsü çekin ve kaydedin. Şimdi, 647 izini kontrol edin. 555 parçasının işaretini kaldırın ve 647 parçasını seçin.Kazancı sıfıra ve pozlama süresini 10 milisaniyeye ayarlayın. Ardından sürekli tuşuna basın. Alexa 642 boyalarının çoğunu karanlık duruma pompalamak için 100 nanometre lazer gücünü %647'e ayarlayın.Floroforlar yanıp sönmeye başladığında, maruziyeti 15 milisaniyeye ve kazancı 300'e çıkarın. Tek molekül sinyallerinin kırmızı renkle gösterildiği gibi kamerayı doyurmadığını doğrulamak için aralık göstergesi modunu kullanın. Bu durumda, doygunluk kaybolana kadar kazancı azaltın.Boncuklar, satın almanın başlangıcında doymuş kalacaktır. Hücrenin gözlemini durdurmak için durdur'a basın. Çevrimiçi işleme aracını genişletin ve edinme sırasında STORM görüntüsünü görselleştirmek için çevrimiçi işleme PALM'a tıklayın.En yüksek maske boyutu için dokuz, gürültüye en yüksek yoğunluk için altı kullanın. Şimdi, edinimi başlat'a basın. Edinme sırasında, gerekirse hücreye yeniden odaklanın.Pozlama süresini ayarlayın ve sonunda, tek moleküller arasında minimum bir mikrometre mesafe ile orta yoğunlukta bir florofor yoğunluğunu korumak için% 0.001'den başlayarak 405 nanometre lazer çizgisini açın. Yeniden oluşturulan görüntünün altındaki histogramdaki yerelleştirme hassasiyetinin zirvesinin 10 nanometre civarında veya altında ortalandığından emin olun. Bir milyondan fazla yerelleştirmeye ulaşıldığında filmi sonlandırmak için durdur düğmesine basın.STORM alımından elde edilen ham verileri CZI formatıyla kaydedin. Ardından kanallar aracında 555. parçayı kontrol edin, 647. parçanın işaretini kaldırın ve 555. parçayı seçin. Ardından, sürekli düğmesine basın.Pozlama süresini 30 milisaniyeye ve kazancı sıfıra ayarlayın. Ardından Alexa 555 boyalarını karanlık duruma pompalamak için hem 488 hem de 561 lazeri %100'e ayarlayın. HILO aydınlatma modunu kullanın.Floroforlar tükendiğinde, durdur düğmesine basın. Kazancı 250'ye ayarlayın ve 488 lazeri %50'ye düşürün Tek moleküllerin kamerayı doyurmadığını kontrol etmek için aralık göstergesini kullanın. Bu durumda, kazancı azaltın.Şimdi, edinimi başlat'a basın. Satın alma sırasında, doygunluk sınırına ulaşmak için kazancı kademeli olarak artırın. Molekülleri aktive etmek ve görüş alanında orta yoğunluğa ulaşmak için 405 nanometre lazer gücünü adım adım artırın.405 lazer yaklaşık% 15 olduğunda 488 nanometre lazer gücünü% 30'a düşürün, Daha sonra moleküllerin göz kırpmasını mümkün olduğunca hızlı ve orta yoğunlukta tutmak için 488 lazer gücünü arttırırken 405'i kademeli olarak azaltın. Maksimum yoğunlukta 561 uyarma lazeri ile birleştirilmiş 488 lazer çizgisi, floroforların hem açılma hem de kapanma oranlarını artırırken, 405 lazer çizgisi yalnızca açılma oranını artırır. 500.000 veya daha fazla lokalizasyona ulaşıldığında veya daha fazla molekül yanıp sönmediğinde alımı durdurun.Ardından, STORM alımından elde edilen ham verileri CZI biçiminde kaydedin. PAL-Drift aracını kullanarak görüntü yeniden yapılandırması yapmak için, maksimum sekiz boyutlu otomatik segmentlere sahip model tabanlı düzeltme türünü seçin. Sapma düzeltilene kadar arka arkaya birden çok kez uygula'ya basın.Bu model tabanlı düzeltme, sapmayı düzelten çapraz korelasyon analizine dayalı bir algoritma uygular. PAL filtre araçlarını kullanarak, yalnızca en iyi lokalize olan molekülleri seçerek STORM görüntüsünün görünümünü iyileştirin. Örneğin, yerelleştirme hassasiyetini 30 nanometre ve PSF'yi 120 ila 180 nanometre ile sınırlayın.PAL-Render aracıyla, beş veya 10 nanometrelik bir piksel çözünürlüğü ve metin protokolüne göre parametreler kullanın. Otomatik dinamik aralık HR'yi %95 değerle oluştur'u ve otomatik dinamik aralık SWF'yi %90 değerle oluştur'u seçin. Ardından en iyi kaliteyi oluştur'u seçin.İşleme sekmesinin PALM menüsünde PALM dönüştürme'yi seçin. Seç'e ve ardından uygula'ya basın. Son olarak, oluşturulan görüntüyü CZI değil LSM biçiminde kaydedin.Bu şekil, Alexa 647 ile immüno-etiketlenmiş vimentin filamentlerinin D-STORM görüntüsünün tipik bir örneğini göstermektedir. Çözünürlükteki artış, standart, geniş alan mikroskobu ile elde edilen görüntü ile karşılaştırıldığında açıkça gözlemlenebilir. Bu grafikte sunulan floresan yoğunluk profilleri, süper çözünürlüklü mikroskopi görüntülemenin vimentin demetlerinin çözünürlüğüne izin verdiğini göstermektedir.D-STORM çözünürlüğü, demetlerde bulunan filamentlerin sayısını saymak için yeterlidir. Burada, sırasıyla Alexa 647 ve Alexa 555 ile immüno-etiketlenmiş vimentin ve mikrotübül ağlarının çift renkli D-STORM görüntülemesinin tipik bir örneği gösterilmektedir. İyi vimentin görüntüleri, mikrotübüller için mikrometre kare başına en az 5.000 lokalizasyona ve mikrometre kare başına 2.500 lokalizasyona sahip olmalıdır.Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa üç gün içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, fiksasyon ve parametrizasyon yöntemlerini görüntülenecek proteine uyarlamak önemlidir. Örneğin, sadece glutaraldehit ile fiksasyon, ara filamentler için kötü sonuçlar verir, ancak mikrotübül fiksasyonu için en iyisidir.Taze hazırlanmış numuneleri ve çözeltileri, özellikle de pH'ı dikkatli bir şekilde ayarlanması gereken MEA'yı kullanmayı unutmamak önemlidir. Geliştirildikten sonra bu teknik, hücre biyolojisi alanındaki araştırmacıların nanoskopik hücresel yapıların morfolojisini keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, ara filamentlerin ve mikrotübüllerin 2D çift renkli D-STORM görüntülerinin numune hazırlama, görüntü elde etme ve yeniden oluşturma işlemlerinin nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız.Bazı solüsyonlarla, özellikle PFA, NABH4 ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken eldiven giymek, kimyasal başlık altında çalışmak ve belirli kutular kullanmak gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.

imaging-intermediate-filaments-microtubules-with-2-dimensional-direct

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz yüksek hızlı 3D canlı hücre floresan ışık mikroskobu ve yüksek çözünürlüklü kriyo-elektron tomografi birleştiren bir karşılıklı mikroskopi yöntemi açıklanmaktadır. Biz burada görüntüleme, dinamik ana HeLa hücreleri ile etkileşime küçük bir HIV-1 parçacıkların bağıntılı yöntemin özelliği göstermektedir.

Dinamik Etkileşimler 3D Yapısal Analiz için karşılıklı Mikroskopi

Canlı hücrelerin içindeki dinamik proteinler hakkındaki uzay-zamansal bilgi, biyolojiyi anlamak için çok önemlidir. Hızlı 3D yapılı aydınlatma mikroskobu (f3D-SIM) adı verilen bir tür süper çözünürlüklü mikroskopi, bakterilerdeki sitokinetik Z halkası hakkında benzersiz bilgiler ortaya çıkarır: hem boncuk benzeri görünümü hem de halka içindeki FtsZ'nin hızlı dinamikleri.

Hızlı 3D-Yapılandırılmış Aydınlatma mikroskopi ile Canlı Bakteri Cytokinetic Z Yüzük Süper çözünürlük Görüntüleme (F3D-SIM)

T hücresi immünolojik sinapsında filamentli aktinin akış hızlarını ve yönlülüğünü araştırmak için, canlı hücre süper çözünürlüklü görüntüleme, toplam iç yansıma floresansı ile birleştirilir ve uzaysal-zamansal görüntü korelasyon spektroskopisi ile ölçülür.

Yapılandırılmış Aydınlatma Mikroskopi Verilerinin uzay-zamansal Görüntü Korelasyon Spektroskopisi nicel T Hücreleri kortikal Aktin Akışı

Biz yapışık memeli hücrelerinde aktin hücre iskeletinin görüntüleme, interferometrik photoactivated Yerelleştirme Mikroskopi (iPALM), 3-boyutlu tek-molekül yerelleştirme süper çözünürlük mikroskopi yöntemi uygulaması için bir protokol mevcut. Bu yaklaşım, aksi takdirde geleneksel kırınım sınırlı optik mikroskopi ile çözülmemiş kalacağını nano yapısal özellikleri ışık tabanlı görselleştirme sağlar.

Üç boyutlu Süper İnterferometrik photoactivated Yerelleştirme Mikroskopi F-aktin Filament Çözünürlük Mikroskobu (iPALM)

Bu protokol, etiket içermeyen, yüksek kontrastı, yüksek hızlı görüntüleme için standart bir floresan mikroskop üzerinde girişim yansıma mikroskopisi uygulamak için bir kılavuzdur mikrotubules in vitro yüzeyler kullanarak.

Microtubules etiketi içermeyen, yüksek hızlı görüntüleme için girişim Reflection Microkopi uygulanması

Çip tabanlı süper çözünürlüklü optik mikroskopi floresan mikroskobu için yeni bir yaklaşım dır ve maliyet etkinliği ve iş akışı avantajları sunuyor. Burada TIRF mikroskobu ve lokalizasyon tabanlı süper çözünürlüklü mikroskopi için çip hazırlama ve görüntüleme protokolleri gösterilmiştir.

Fotonik Çip Kullanarak Yüksek İşLeç Toplam İç Yansıma Floresansı ve Direkt Stokastik Optik Rekonstrüksiyon Mikroskobu

Doğrudan stokastik optik rekonstrüksiyon mikroskopisi (dSTORM), ışık mikroskopisinin tipik kırınım sınırını atlamak ve ekzomları nanometre ölçeğinde görüntülemek için kullanılır. Eksozomları karakterize etmek için hem iki hem de üç boyutta kullanılabilir.

Hücre Dışı Veziküllerin Üç Boyutlu Doğrudan Stokastik Optik Rekonstrüksiyon Mikroskopisi

Burada, iki mikrotübül popülasyonunun dinamiklerini aynı anda ölçmek ve karşılaştırmak için TIRF mikroskopi tabanlı in vitro resusyon testi sunulmaktadır. Çapraz bağlı mikrotübül demetleri ve tek mikrotübüller üzerindeki çoklu mikrotübül ile ilişkili proteinlerin kolektif aktivitesini eşzamanlı olarak görüntülemek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Çapraz Bağlı ve Tek Mikrotübüllerin Dinamiğinin In Vitro TIRF Mikroskobu ile Eşzamanlı Görselleştirilmesi

Dinamik mikrotübüllerin ve floresan olarak etiketlenmiş mikrotübülle ilişkili proteinlerin eşzamanlı görüntülenmesi için girişim-yansıma mikroskobu ve toplam-iç-yansıma-floresan mikroskobu uygulamak için bir protokol sunuyoruz.

Dinamik Mikrotübülleri ve İlişkili Proteinleri Görüntülemek için Eşzamanlı Girişim Yansıması ve Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu

Diferansiyel dinamik mikroskopi (DDM), dinamik ışık saçılması ve mikroskopi özelliklerini birleştirir. Burada, vimentin ağlarındaki parçacıkların subdifüzyon ve kafesli dinamiklerini ve aktif miyozin güdümlü aktin-mikrotübül kompozitlerinin balistik hareketini ölçerek yeniden yapılandırılmış sitoiskelet ağlarını karakterize etmek için DDM'yi kullanma süreci sunulmaktadır.

Diferansiyel Dinamik Mikroskopi Kullanarak Sitoiskelet Dinamiğinin Ölçülmesi

Bu protokol, tek objektifli, hafif tabakalı bir floresan mikroskobunun nasıl oluşturulacağını ve hücre iskeleti ağlarını görselleştirmek için kullanımını ayrıntılı olarak açıklar.

Hücre iskeleti ağlarının görselleştirilmesi için özelleştirilebilir, tek objektifli, ışık tabakalı floresan mikroskobunun tasarımı ve inşası

Öğrenin, U373 hücrelerinde ara filamentler ve mikrotübüller için 2 boyutlu çift renkli dSTORM görüntüleme yöntemini. Bu teknik, sitoskelet ağların yüksek çözünürlüklü analizini sağlar.

Ara filamentler ve mikrotübüller 2 boyutlu doğrudan Stokastik optik imar mikroskobu ile görüntüleme

Daha fazla video keşfet