Ara filamentler ve mikrotübüller 2 boyutlu doğrudan Stokastik optik imar mikroskobu ile görüntüleme

Bu metodolojinin genel amacı, sabit hücrelerde mikrotübüllerin ve ara filamentlerin 2D çift renkli D-STORM görüntülemesini gerçekleştirmek için numune hazırlamadan görüntü elde etmeye ve yeniden yapılandırmaya kadar en uygun deneysel koşulları yaratmaktır. Bu yöntem, ara filamentler ve mikrotübüller gibi yoğun ve karmaşık hücre iskeleti ağları arasındaki fiziksel etkileşimlerin karakterize edilmesine yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, geleneksel floresan mikroskobu ile çözülemeyen hücresel yapıların gözlemlenmesine izin vermesidir.

Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir, çünkü numune hazırlamanın kontrolü ve bornoz bağlama verilerinin elde edilmesi, artefakt oluşumunu sınırlamak için çok önemlidir. U373 hücrelerini metin protokolüne göre büyüttükten sonra, hücreleri önce bir kez yıkamak için PBS kullanarak düzeltin. Daha sonra, PBS'yi çıkarın ve önceden ısıtılmış ekstraksiyon fiksasyon çözeltisinin oyuğu başına bir mililitre ekleyin.

Hücreleri oda sıcaklığında 60 saniye inkübe edin. Daha sonra çözeltiyi çıkarın ve hücre iskeleti tamponunda seyreltilmiş taze hazırlanmış ve önceden ısıtılmış% 4 PFA oyuğu başına bir mililitre ekleyin. 12 oyuklu plakayı 10 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübatöre geri yerleştirin.

Ardından PFA'yı çıkarın ve kuyucuk başına üç mililitre PBS ekleyin. Hücreleri iki kez yıkamak için PBS kullanın. Daha sonra PBS'yi çıkarın ve glutaraldehitten otofloresanı söndürmek için PBS'de seyreltilmiş taze hazırlanmış 10 milimolar sodyum borohidrür ekleyin.

Hücreleri oda sıcaklığında yedi dakika inkübe edin ve geri dönüştürülmüş sodyum borhidrürü belirli bir kutuya aktarın. Kuyuları her biri beş dakika boyunca üç kez yıkamak için PBS'yi kullanın. Ardından PSB'yi çıkarın ve bir engelleme çözümü olarak PBS'ye %5 BSA ekleyin.

Numuneleri immün boyadıktan ve metin protokolüne göre tamponlarda çözeltiler hazırladıktan sonra, etiketli hücreleri içeren lamel manyetik bir numune tutucuya monte edin. Ve hazneyi tamamen doldurmak için görüntüleme tamponunu ekleyin. Kapağı uygulayın ve görüntüleme arabelleği ile kapak arasında hava kabarcığı olmadığından emin olun.

Mutlak etanol kullanarak numunenin altını temizleyin ve sızıntı olmadığını doğrulayın. Daha sonra gerekirse, numune tutucuyu düzgün bir şekilde kapatmak için gres kullanın. Görüntülemeyi gerçekleştirmek için mikroskobu ve edinme yazılımını açın.

100 kat NA 1.46 objektif, 1.6 kat Optivar lens ve TIRF UHP modunu kullanarak çekim parametrelerini metin protokolüne göre ayarlayın. Alexa Fluor 647 ile etiketlenmiş vimentin filamentlerini görüntülemek için bir 647 izi oluşturun. 405 ve 642 nanometre lazer çizgilerini ve LP 655 emisyon filtresini seçin.

Ardından, Alexa Fluor 555 ile etiketlenmiş mikrotübülleri görüntülemek için bir 555 izi oluşturun. Floroforları ve BP 570 ila 650 emisyon filtresini görüntülemek için 561, 488 ve 405 nanometre lazer çizgilerini seçin. Ardından, objektife yağ ekleyin ve numuneyi lensin üzerine yerleştirin.

Ardından, bul sekmesini seçin ve floresan lambanın deklanşörünü açın. Odağı bulun ve görüntülenecek hücreleri aramak için göz merceğini kullanın. Ardından, hücreleri alanın ortasına yerleştirmek için oyun çubuğunu kullanın.

Edinme moduna dönmek için edinme sekmesine tıklayın. Ardından 647 izini seçin ve 642 lazer gücünü %0,2'ye ve 405 lazer gücünü minimum değerine ayarlayın. Pozlama süresini 50 milisaniyeye ve kazancı 50 milisaniyeye ayarlayın.

Ardından, hücreyi ekranda gözlemlemek için sürekli alım modunu seçin. Görüş alanında en az bir floresan boncuk olduğundan emin olun. Ekran için bir otomatik ölçeklendirme modu kullanın ve odağı ayarlayın.

Ardından, snap'e tıklayarak vimentin ağının geniş alan epifloresan görüntüsünü alın ve görüntüyü kaydedin. TIRF aydınlatmasını kontrol etmek için TIRF'e tıklayın, devamlı'ya basın, homojen bir aydınlatma alanına sahip olmak için alım parametrelerini ayarlayın. Ardından tutturma düğmesine basın ve görüntüyü kaydedin.

555 parçasını kontrol edin. 647 parçasının işaretini kaldırın ve 555 parçasını seçin. Mikrotübül ağının epifloresan görüntüsünü alın ve kaydedin.

Ardından bir TIRF görüntüsü çekin ve kaydedin. Şimdi, 647 izini kontrol edin. 555 parçasının işaretini kaldırın ve 647 parçasını seçin.

Kazancı sıfıra ve pozlama süresini 10 milisaniyeye ayarlayın. Ardından sürekli tuşuna basın. Alexa 642 boyalarının çoğunu karanlık duruma pompalamak için 100 nanometre lazer gücünü %647'e ayarlayın.

Floroforlar yanıp sönmeye başladığında, maruziyeti 15 milisaniyeye ve kazancı 300'e çıkarın. Tek molekül sinyallerinin kırmızı renkle gösterildiği gibi kamerayı doyurmadığını doğrulamak için aralık göstergesi modunu kullanın. Bu durumda, doygunluk kaybolana kadar kazancı azaltın.

Boncuklar, satın almanın başlangıcında doymuş kalacaktır. Hücrenin gözlemini durdurmak için durdur'a basın. Çevrimiçi işleme aracını genişletin ve edinme sırasında STORM görüntüsünü görselleştirmek için çevrimiçi işleme PALM'a tıklayın.

En yüksek maske boyutu için dokuz, gürültüye en yüksek yoğunluk için altı kullanın. Şimdi, edinimi başlat'a basın. Edinme sırasında, gerekirse hücreye yeniden odaklanın.

Pozlama süresini ayarlayın ve sonunda, tek moleküller arasında minimum bir mikrometre mesafe ile orta yoğunlukta bir florofor yoğunluğunu korumak için% 0.001'den başlayarak 405 nanometre lazer çizgisini açın. Yeniden oluşturulan görüntünün altındaki histogramdaki yerelleştirme hassasiyetinin zirvesinin 10 nanometre civarında veya altında ortalandığından emin olun. Bir milyondan fazla yerelleştirmeye ulaşıldığında filmi sonlandırmak için durdur düğmesine basın.

STORM alımından elde edilen ham verileri CZI formatıyla kaydedin. Ardından kanallar aracında 555. parçayı kontrol edin, 647. parçanın işaretini kaldırın ve 555. parçayı seçin. Ardından, sürekli düğmesine basın.

Pozlama süresini 30 milisaniyeye ve kazancı sıfıra ayarlayın. Ardından Alexa 555 boyalarını karanlık duruma pompalamak için hem 488 hem de 561 lazeri %100'e ayarlayın. HILO aydınlatma modunu kullanın.

Floroforlar tükendiğinde, durdur düğmesine basın. Kazancı 250'ye ayarlayın ve 488 lazeri %50'ye düşürün Tek moleküllerin kamerayı doyurmadığını kontrol etmek için aralık göstergesini kullanın. Bu durumda, kazancı azaltın.

Şimdi, edinimi başlat'a basın. Satın alma sırasında, doygunluk sınırına ulaşmak için kazancı kademeli olarak artırın. Molekülleri aktive etmek ve görüş alanında orta yoğunluğa ulaşmak için 405 nanometre lazer gücünü adım adım artırın.

405 lazer yaklaşık% 15 olduğunda 488 nanometre lazer gücünü% 30'a düşürün, Daha sonra moleküllerin göz kırpmasını mümkün olduğunca hızlı ve orta yoğunlukta tutmak için 488 lazer gücünü arttırırken 405'i kademeli olarak azaltın. Maksimum yoğunlukta 561 uyarma lazeri ile birleştirilmiş 488 lazer çizgisi, floroforların hem açılma hem de kapanma oranlarını artırırken, 405 lazer çizgisi yalnızca açılma oranını artırır. 500.000 veya daha fazla lokalizasyona ulaşıldığında veya daha fazla molekül yanıp sönmediğinde alımı durdurun.

Ardından, STORM alımından elde edilen ham verileri CZI biçiminde kaydedin. PAL-Drift aracını kullanarak görüntü yeniden yapılandırması yapmak için, maksimum sekiz boyutlu otomatik segmentlere sahip model tabanlı düzeltme türünü seçin. Sapma düzeltilene kadar arka arkaya birden çok kez uygula'ya basın.

Bu model tabanlı düzeltme, sapmayı düzelten çapraz korelasyon analizine dayalı bir algoritma uygular. PAL filtre araçlarını kullanarak, yalnızca en iyi lokalize olan molekülleri seçerek STORM görüntüsünün görünümünü iyileştirin. Örneğin, yerelleştirme hassasiyetini 30 nanometre ve PSF'yi 120 ila 180 nanometre ile sınırlayın.

PAL-Render aracıyla, beş veya 10 nanometrelik bir piksel çözünürlüğü ve metin protokolüne göre parametreler kullanın. Otomatik dinamik aralık HR'yi %95 değerle oluştur'u ve otomatik dinamik aralık SWF'yi %90 değerle oluştur'u seçin. Ardından en iyi kaliteyi oluştur'u seçin.

İşleme sekmesinin PALM menüsünde PALM dönüştürme'yi seçin. Seç'e ve ardından uygula'ya basın. Son olarak, oluşturulan görüntüyü CZI değil LSM biçiminde kaydedin.

Bu şekil, Alexa 647 ile immüno-etiketlenmiş vimentin filamentlerinin D-STORM görüntüsünün tipik bir örneğini göstermektedir. Çözünürlükteki artış, standart, geniş alan mikroskobu ile elde edilen görüntü ile karşılaştırıldığında açıkça gözlemlenebilir. Bu grafikte sunulan floresan yoğunluk profilleri, süper çözünürlüklü mikroskopi görüntülemenin vimentin demetlerinin çözünürlüğüne izin verdiğini göstermektedir.

D-STORM çözünürlüğü, demetlerde bulunan filamentlerin sayısını saymak için yeterlidir. Burada, sırasıyla Alexa 647 ve Alexa 555 ile immüno-etiketlenmiş vimentin ve mikrotübül ağlarının çift renkli D-STORM görüntülemesinin tipik bir örneği gösterilmektedir. İyi vimentin görüntüleri, mikrotübüller için mikrometre kare başına en az 5.000 lokalizasyona ve mikrometre kare başına 2.500 lokalizasyona sahip olmalıdır.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa üç gün içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, fiksasyon ve parametrizasyon yöntemlerini görüntülenecek proteine uyarlamak önemlidir. Örneğin, sadece glutaraldehit ile fiksasyon, ara filamentler için kötü sonuçlar verir, ancak mikrotübül fiksasyonu için en iyisidir.

Taze hazırlanmış numuneleri ve çözeltileri, özellikle de pH'ı dikkatli bir şekilde ayarlanması gereken MEA'yı kullanmayı unutmamak önemlidir. Geliştirildikten sonra bu teknik, hücre biyolojisi alanındaki araştırmacıların nanoskopik hücresel yapıların morfolojisini keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, ara filamentlerin ve mikrotübüllerin 2D çift renkli D-STORM görüntülerinin numune hazırlama, görüntü elde etme ve yeniden oluşturma işlemlerinin nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız.

Bazı solüsyonlarla, özellikle PFA, NABH4 ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken eldiven giymek, kimyasal başlık altında çalışmak ve belirli kutular kullanmak gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.