Phloem Sap örnekleme gelen Brassica napus 3D-sayfa Protein ve Ribonükleoprotein kompleksleri için

Bu 3D-PAGE prosedürünün genel amacı, ilgili nükleik asit ve protein bileşenlerinin tanımlanması ile birlikte protein ve ribonükleoprotein komplekslerini Brassica napus ploem özsuyundan ayırmaktır. Bu yöntem, biyokimya ve bitki fizyolojisindeki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Örneğin, stres altında floem komplekslerinin bileşimini analiz edebilirsiniz.

Tekniğin temel avantajı, saf floem özsuyunun toplanabilmesi ve nükleik asitlerin yanı sıra protein bileşenlerinin de aynı anda analiz edilebilmesidir. Bu yöntem, yağlı tohum kolzasının floem sistemi içindeki protein, protein ve protein nükleik asit etkileşimleri hakkında bilgi sağlayabilse de, kabakgiller, acı baklalar ve yucca gibi diğer bitkilerin floem analizine de uygulanabilir. Bu yöntem için ilk olarak, spesifik floem proteini için protein ve RNA etkileşim ortaklarını belirlemeye çalıştığımızda aklımıza geldi.

İlk olarak, sekiz haftalık bir B.napus bitkisinin çiçekli sapını 0.8 milimetrelik bir hipodermik iğne kullanarak birkaç kez delin. Yeterli floem özü elde etmek için aynı bitki ve diğer bitkiler üzerinde diğer birkaç çiçekli gövdeyi delin. Her yaralı bölgedeki ilk damlayı filtre kağıdı ile silin.

İlk damlaları çıkardıktan sonra, kalan damlaları toplamak için bir pipet kullanın. Ve bunları önceden soğutulmuş konik 1.5 mililitrelik bir reaksiyon tüpüne aktarın. Daha sonra toplanan eksüdayı buzsuz bir soğutma sistemi kullanarak eksi 20 santigrat derecede saklayın.

Başka damla oluşumu gözlenmeyene kadar, ancak bir saatten fazla olmamak üzere damla toplamaya devam edin. Daha sonra, floem örneğini 10.000 daltonluk bir moleküler ağırlığa sahip bir santrifüj yoğunlaştırıcıya ekleyin ve başlangıç hacminin yaklaşık 1 / 6'sına konsantre edin. Ardından, toz parçacıklarını gidermek için konsantre numuneyi dört santigrat derecede ve 20.000 g'da en az 15 dakika santrifüjleyin.

Mavi yerel PAGE gerçekleştirmek için jel haznesini monte edin. Ve yarıya koyu mavi katot tamponu B ekleyin ve kuyuları katot tamponu ile yıkayın. Oyuk başına 20 ila 30 mikrogram konsantre protein örneğini en az üç kopya halinde ticari bir Bis-Tris radyant jele yükleyin.

Hazneyi katot ve anot tamponu ile doldurun ve jeli, numune jelin 1 / 3'ünü geçene kadar dört santigrat derece ve 150 voltta çalıştırın, bu da 20 ila 30 dakika sürer. Açık mavi katot tamponu B 1/10 ile koyu mavi katot tamponu B'yi değiştirmeyi duraklatın. Koşuyu yeniden başlatın ve mavi ön kısım jelden dışarı çıkmaya başlayana kadar devam edin, bu 120 ila 180 dakika sürer.

Doğal mavi jelden bütün bir jel şeridini kesin, ardından yarı kuru kurutma ile naylon bir zar üzerine aktarın ve zar üzerindeki üst ve alt jel kenarlıklarını bir kalemle işaretleyin. Kurutma işleminden sonra, membranı DEPC ile arıtılmış suyla yıkayın ve kuruması için iki parça filtre kağıdı arasına yerleştirin. Bunu takiben, lekeli zarın santimetre kare başına 120.000 mikro jul uygulanan bir enerji ile UV çapraz bağlamasını gerçekleştirin.

Şimdi, UV çapraz bağlı membranı altı mililitre hibridizasyon tamponu ile bir hibridizasyon fırınında 68 santigrat derecede 60 dakika boyunca önceden hibritleyin. Membrana dört mikrolitre 3-prime biyotinillenmiş prob içeren bir mililitre daha hibridizasyon tamponu ekleyin. Ardından, hibridizasyon fırınını 68 ila 37 santigrat derece arasında soğuturken zarı gece boyunca prob ile inkübe edin.

Ertesi gün, spesifik olmayan şekilde bağlanmış probları çıkarmak için membranı 2x SSC ve% 0.1 SDS içeren tamponla oda sıcaklığında beş dakika boyunca yıkayın. Bir yaban turpu peroksidaz substratı olarak bir streptavidin HRP konjugatı ve luminol ile membran üzerindeki 3-prime biyotinillenmiş probların tespitini gerçekleştirin, bu da hassas bir kemilüminesan reaksiyonu ile sonuçlanır. Mavi yerli jelden tek bantları çıkarın.

Daha fazla karmaşık protein konsantrasyonu elde etmek için 1.5 mililitrelik bir konik reaksiyon tüpünde paralel şeritler halinde çalışan numunelerden alınan bantları birleştirin. % 12'lik bir Tris-Trisin üre jeli hazırlamak için, iki cam plaka arasına 10 mililitre jel çözeltisi A dökün ve izopropanol ile kaplayın. Polimerizasyondan sonra, izopropanolü çıkarın, jele iki ila üç mililitre jel çözeltisi B ekleyin ve 10 kuyulu bir tarak yerleştirin.

Eksize edilen jel parçalarının dengelenmesi için, reaksiyon tüpüne bir mililitre 2x SDS numune tamponu ekleyin. Numuneyi oda sıcaklığında 10 dakika inkübe ettikten sonra, 95 santigrat derecede bir ısıtma bloğunda yaklaşık bir dakika ısıtın. Daha sonra numuneyi oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.

Bunu takiben, aynı kompleksi temsil eden birkaç dengelenmiş jel parçasını tek bir jel cebine istifleyin. Jel haznesini monte ettikten sonra, 45 ila 60 dakika boyunca 150 voltta anot ve katot çalıştırma tamponları kullanarak elektroforez gerçekleştirin. Bittiğinde, tüm jel şeridini kesin.

Kesilen jel şeridini asidik tamponda 20 dakika inkübe edin. Daha sonra, 20 dakika daha pH 6.8'de 125 milimolar Tris-HCL'de dengeleyin. Şeride göre% 15'lik bir SDS ayırıcı jel solüsyonu dökün.

Jel katılaştıktan sonra, izopropanolü çıkarın, %4'lük bir istifleme jeli çözeltisinden üç mililitre ekleyin ve IPG jelleri için özel tarağı yerleştirin. Katılaşmadan sonra, dengeleyici jel şeridini SDS jeli üzerine aktarın ve jeli, bir miktar bromofenol mavisi ile desteklenmiş 1x SDS çalışma tamponunda %0.5 agaroz ile kaplayın. Jel haznesini monte ettikten sonra, jeli 60 dakika boyunca 150 voltta çalıştırın.

Bittiğinde, sonraki kütle spektrometrik analizi için jeli kolloidal Kumasi çözeltisi ile boyayın. Son olarak, matris destekli lazer desorpsiyon iyonizasyon uçuş süresi spektrometrisi kullanarak görünür protein lekelerini analiz edin. Saf bir floem örneğinden elde edilen temsili bir sonuç burada tasvir edilmiştir.

Kontamine olmayan floem örnekleri tioredoksin yaşı için görünür bir bant gösterirken, RuBisCO ve polen kaplama proteini için herhangi bir sinyal gözlenmemiştir. BN PAGE'den sonra en az dört ana protein kompleksi bandı görünür hale gelir. Çok düşük veya çok yüksek konsantrasyonlarda floem özü, komplekslerin net bir şekilde ayrılmasına izin vermez.

Üre ve SDS-PAGE jellerindeki farklı protein migrasyon davranışlarına bağlı olarak 3D PAGE'de yüksek çözünürlüklü ayrışma gözlenir. Tipik olarak, tek bir komplekse ait proteinler, jel boyunca çapraz bir çizgi olarak görünür olacaktır. Bu çizginin üzerindeki proteinler artmış bir hidrofobikliğe sahipken, çizginin altındaki proteinler daha hidrofiliktir.

BN kuzey bürünmesi, belirli bir tRNA'nın yalnızca belirli bir komplekste mevcut olduğunu gösterir. Kütle spektrometrik analizi, bu kompleksin esas olarak BN kuzey blotlaması tarafından bulunan tRNA bağlanma aktivitesini doğrulayan tRNA ligazları içerdiğini gösterdi. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa üç gün içinde yapılabilir.

Bu prosedürü denerken, kütle spektrometrik analizini engelleyecek karoten kontaminasyonunu en aza indirmek için eldiven ve laboratuvar önlüğü giymeyi unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, karmaşık aktivite ve inhibisyon çalışmaları gibi ek soruları yanıtlamak için toplanan floem özü ile zimogramlar ve enzim testleri gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, bitki bilimi alanındaki araştırmacıların, farklı bitki türlerinden floem örneklerinde çok alt birimli kompleksleri keşfetmelerinin yolunu açtı.

Bu videoyu izledikten sonra, Brassica napus bitkilerinden floem özsuyunun nasıl izole edileceğini ve protein proteini ve protein nükleik asit komplekslerinin nasıl izole edileceğini ve analiz edileceğini iyi anlamış olmalısınız. SDS, akrilamid ve TMET ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman eldiven ve laboratuvar önlüğü ile kapüşon altında çalışmak gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.