Name: Phloem Sap örnekleme gelen Brassica napus 3D-sayfa Protein ve Ribonükleoprotein kompleksleri için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 23 s
Description: Öğrenin Brassica napus floem özsuyundan protein ve ribonükleoprotein komplekslerini izole etmek ve analiz etmek için 3D-PAGE yöntemini. Bu protokol bitki biyokimyası ve uzun mesafe sinyalleşme çalışmalarında yüksek çözünürlüklü ayrıştırma sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jennifer Deke ve Urszula Zarzenska onların bilimsel destek için teşekkür ederiz. Bu eser mali bir kariyer Tümleştirme Grant (çiğ, PCIG14-GA-2013-63 0734) tarafından 7 çerçeve programı, Litvanya-GK06 'DELIGRAH' (Landesforschungsförderung Hamburg) hibe ve DFG hibe (DFG KE 856_6-1) Avrupa Komisyonu tarafından desteklenen JK için verilmiştir.

1. örnekleme ve B. napus SAP'den phloem hazırlanması bitkiler 4,8,20
<ol><li>Örnekleme phloem sap için iyi sulanan 8-hafta-yaşlı kullanın B. napus polen contaminations önlemek için bu gösteri sadece ilk çiçekli bitkiler.</li>
	<li>Bir şırınga iğnesi kullanın (Ø 0.8 mm) ve punctate önümüzdeki birkaç kez kaynaklanıyor. Birkaç diğer önümüzdeki kaynaklanıyor ve yeterli phloem sap (şekil 2a) elde etmek için diğer bitkiler üzerinde yineleyin. Not: karmaşık analiz için phloem sap en az 600 µL ile başlatmak için önerilir. 4-5 bitkiler phloem sap 200 ila 700 µL arasında ortaya çıkarır.</li>
	<li>Filtre kağıdı ile yaralı sitelerden ilk damla yok etmek. Bu damlalar esas olarak yaralı doku çevreleyen yüksek oranda kirlenmiş malzeme içeren ve atılacak gerekiyor.</li>
	<li>Pipetting tarafından aşağıdaki damla toplamak ve toplanan çıktı önceden soğutulmuş konik 1,5 mL tepki tüp buz bir soğutma sistemi kullanarak-20 ° C'de depolayın.</li>
	<li>Yok daha fazla damla oluşumu gözlemlenebilir ama 1 saat daha uzun kadar toplama devam. Bu yordamı, toplanan phloem sap önemli kaybı olmadan iki gün sonra tekrar edilebilir. Not: Toplanan phloem sap hemen kullanılabilir veya ilerideki analizleri için-80 ° C'de depolanan. -80 ° C depolama için şok-tepki tüp sıvı azot kıpırdama.</li>
	<li>Phloem örnek yaklaşık 1/6inci santrifüj yoğunlaştırıcıları (MWCO) 10.000 Dalton (Da) kesilmiş bir molekül ağırlığı ile kullanarak ilk birim için konsantre. Konsantre örnek 4 ° C ve 20.000 x g toz parçacıkları kaldırmak en az 15 dakika santrifüj kapasitesi. Not: Phloem sap toplama önemli bir protein kaybına yol açmaz.</li>
	<li>Daha sonraki karmaşık analiz için adım 3.1 ile devam edin.</li>
</ol>2. ters transkriptaz PCR (RT-PCR) 4,8,20 ile phloem sap saflık kontrolü
<ol><li>--Dan phloem su sıvı madde için standart bir RNA ayıklama yöntemini kullanan toplam RNA izole (örneğin TRIzol veya fenol kloroform çıkarma isopropanol yağış sulu faz ve adımları göre yıkama etanol tarafından takip üreticinin iletişim kuralı). Dikkat: Fenol kloroform zehirlidir. Uygun bireysel koruma araçları ile bir örtünün altında çalışır. Ayıklanan RNA etanol-80 ° C'de altı aya kadar saklanabilir.</li>
	<li>Dnaz ile sindirim tarafından DNA'ın kirlilik ben (1 u/µg) için 45 dk 37 ° C'de ve enzim için son bir konsantrasyon 5 mm EDTA ekleyerek devre dışı bırakın ve örnek için 10 dk. 75 ° C'de kuluçkaya.</li>
	<li>Saf RNA almak için arındırmak ve örnek bir arıtma adım (RNA Temizleme kitleri, üreticinin yönergelerine göre kullanarakörneğin ) tarafından konsantre ol.</li>
	<li>Ters transkriptaz PCR (RT-PCR) cDNA sentezi için 150 kullanarak cDNA sentez kiti ile gerçekleştirmek ng saf RNA'ın üretici tarafından açıklandığı gibi protokol. Not: CDNA-20 ° C'de daha fazla kullanılmasını kadar saklanır.</li>
	<li>CDNA 5 µL yuvası özel transkript yükseltmek ve özel Jel Elektroforez tarafından kontrol için üretici tarafından belirtildiği gibi standart bir PCR reaksiyon için şablon olarak kullanın. Phloem örnekleri saflığı örneğin rubisco küçük alt birimi, thioredoxin h ve polen kat protein (Şekil 1b, Tablo 1) için primerler kullanılarak onaylayın.</li>
</ol>3. mavi yerel sayfa 4,25,26,31
<ol><li>Ya kendi kendine döktü yerli degrade jelleri açıklandığı gibi başka bir yerde27 veya ticari Bis-Tris degrade jelleri kullanın.</li>
	<li>En az 20-30 µg yoğun protein örneği iyi jel üzerine başına triplicates yük.</li>
	<li>4 ° C ve 150 V jel çalışmasını Örnek 1/3rd jel (yaklaşık 20-30 dk, şekil 3a) geçti kadar koyu mavi katot tampon B ve anot tampon (Tablo 2) kullanarak. Not: Kuzey kurutma için bir tek jel lane, süre 3D sayfa ve kütle spektrometresi daha az bol protein konsantre olmaya en çok on jel şerit aynı gruptan birleştirmek için önerilen protein kompozisyon analizi için yeterlidir.</li>
	<li>Çalıştır duraklatmak ve ışık mavi katot ile Satım koyu mavi katot tampon B B/10 (Tablo 2) tampon ve Çalıştır devam. Mavi açık dışarı jel (ca. 120 ile 180 dk, şekil 3a) elute başladığında Çalıştır jel bitirmek. Not: Bitmiş mavi yerli jel en az bir hafta için 4 ° C'de muhafaza edilebilir. Uzun süreli depolama bantları diffüz yol açabilir ve kaçınılmalıdır. Koyu mavi arabellek B yeniden kullanılabilir.</li>
</ol>4. isteğe bağlı: Mavi yerel Kuzey kurutma 4 kullanarak RNA tespiti
<ol><li>Farklı bantları kesip veya tüm jel şeritli mavi yerli jel gelen kullanın onları yarı kuru 3,5 mA/cm2 60 dk için kurutma tarafından bir naylon membran transfer ve membran (şekil 4a) üzerinde bir kalem ile alt ve üst jel sınır işareti.</li>
	<li>Kurutma sonra membran DEPC tedavi su ile yıkayıp kurulayın arasında iki filtreyi bildiri.</li>
	<li>UV-zenginlikte membran ile 120.000 µJ/cm2 polietilenin gerçekleştirmek (85 Crosslinker Malzemeler tablokullanıyorsanız s).</li>
	<li>Membran hibridizasyon fırında (şekil 4a) 68 ° C'de 60 dk için hibridizasyon arabellek (ticari veya kendi kendine yapılan) 6 mL ile önceden melezlemek.</li>
	<li>Hibridizasyon arabellek 3'-biotinylated sondalar 4 µL içeren bir ek 1 mL ekleyin (100 nM).</li>
	<li>Membran ile probe gecede, 68 ° C fırında 37 ° C'ye soğutma kuluçkaya</li>
	<li>Membran unspecifically bağlı probları kaldırmak için oda sıcaklığında 5 min için 2 x SSC ve % 0.1 SDS içeren bir arabellek ile yıkayın. Dikkat: SDS tahrişleri neden olabilir. SDS ve çözümler içeren SDS ile çalışırken eldiven ve önlük giymek.</li>
	<li>3'-biotinylated sondalar tespiti membran örneğin Streptavidin-HRP-eşlenik ve luminol ile hassas bir chemiluminescent reaksiyon (şekil 4a) kaynaklanan bir horseradish peroksidaz (HRP) substrat olarak gerçekleştirin.</li>
</ol>5. ikinci Boyut: Tris-Tricine-üre sayfa 4,28
<ol><li>Mavi yerli jel tek grup tüketim. Paralel şerit karmaşık proteinleri (şekil 5) daha fazla konsantrasyon ulaşmak için çalıştırmak örnekleri grup birleştirin. Not: 4 ° C'de daha fazla kullanılmasını kadar tek tepki tüplerde eksize gruplarından saklanabilir</li>
	<li>% 12 Tris-Tricine-üre jel dökmek (kalınlığı 1 mm, 6.8 cm x 8,6 cm (genişlik x uzunluk)). 10 mL jel çözeltisi A ayıran jel (Tablo 2), için hazırlamak pour iki cam levha ve yerleşimi ile isopropanol arasında. Ve 4 mL jel ve 10 de tarak Ekle üzerine jel çözeltisi B (Tablo 2) yığın jel için transfer polimerizasyon tamamlandıktan sonra isopropanol çıkarın. Dikkat: Unpolymerized Akrilamid Nörotoksik olabilir ve TEMED Eğer inhale zararlıdır. Her zaman bireysel koruma araçları giymek ve bir başlık altında çalışma.</li>
	<li>Eksize jel bantları 1,5 mL tepki tüp içine aktarmak ve SDS örnek arabellek için denge jel adet (şekil 5, Tablo 2) x 2 1 mL ekleyin.<ol>
<li>Örnekleri, oda sıcaklığında (95 ° C) bir Isıtma blok veya bir mikrodalga kaynar önce 10 min için kuluçkaya ve başka bir 15 dakika oda sıcaklığında tekrar örnekleri kuluçkaya.</li>
		<li>Aynı kompleks bir tek jel cebine temsil eden birkaç dengelenmiş jel adet yığını.</li>
		<li>Anot ve katot arabellekleri koşma vasıl 150 V 45-60 dk kullanarak Elektroforez gerçekleştirmek ve bütün jel lane tüketim.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Asidik arabellek (100 mM Tris, 100 mM Asetik asit) içinde 20 dk için kesme şerit kuluçkaya ve 125 mm Tris-HCl, pH 6.8 için başka bir 20 dk (şekil 5) equilibrate.</li>
</ol>6. üçüncü Boyut: SDS-sayfa 4,32
<ol><li>Jel Laemmli32 göre ayıran bir % 15 SDS dökün (kalınlığı: 1.5 mm, 6.8 cm x 8,6 cm (genişlik x uzunluk)) (Tablo 2) ve ince bir tabaka halinde % 4 jel yukarıdaki istifleme ekleyin. Dikkat: SDS, Akrilamid ve TEMED zehirli ve zararlı. Bir başlık altında iş ve kişisel koruyucu donanımları.</li>
	<li>Dengelenmiş jel lane SDS jel üzerine transfer ve jel bromophenol mavi (şekil 5) izleme ile desteklenmiş arabellek çalışan 1 x SDS % 0,5 (w/w) özel ile kaplayın.</li>
	<li>Arabellek önceden jel yükleme özel mikrodalga ile çalışan SDS kaynatın.</li>
	<li>Moleküler ağırlık tek bileşenlerinin tahmin etmek için bir protein marker çalıştırmak, özel katılaşmış kadar jel bir ucunda filtre kağıt yerleştirin veya genellikle IPG jeller için kullanılan özel bir tarak kullanın.</li>
	<li>Jel 150 V 60 dk ve leke için çalıştırılacak jel ile kolloidal Coomassie, gümüş leke veya herhangi bir diğer yöntemi daha sonraki kitle spektrometrik analiz için uygun boyama.</li>
	<li>Matris yardımlı lazer desorpsiyon/iyonlaşma gibi kitle spektrometrik yaklaşımlar kullanarak görünür protein noktalar analiz zaman uçuş (MALDI-TOF) veya LC-MS/MS kütle spektrometresi. Not: Zaten olarak açıklanan33boyama kolloidal Coomassie kullanmak için önerilir. Bizim ellerde daha az bol protein yeterince Boyanabilen ve makul veri kalitesiyle bir kitle spektrometrik analiz sağlar.</li>
</ol>

<ol><li>Kempers, R., van Bel, A. J. E. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF01007704">Symplasmic connections between sieve element and companion cell in the stem phloem ofVicia faba L. have a molecular exclusion limit of at least 10 kDa.</a> Planta. 201 (2), 195-201 (1997).</li>
<li>Stadler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+GFP-fusions+in+Arabidopsis+companion+cells+reveals+non-specific+protein+trafficking+into+sieve+elements+and+identifies+a+novel+post-phloem+domain+in+roots%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Expression of GFP-fusions in Arabidopsis companion cells reveals non-specific protein trafficking into sieve elements and identifies a novel post-phloem domain in roots.</a> Plant J. 41 (2), 319-331 (2005).</li>
<li>Imlau, A., Truernit, E., Sauer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-to-cell+and+long-distance+trafficking+of+the+green+fluorescent+protein+in+the+phloem+and+symplastic+unloading+of+the+protein+into+sink+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Cell-to-cell and long-distance trafficking of the green fluorescent protein in the phloem and symplastic unloading of the protein into sink tissues.</a> Plant Cell. 11 (3), 309-322 (1999).</li>
<li>Ostendorp, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+Brassica+napus+phloem+protein+and+ribonucleoprotein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of Brassica napus phloem protein and ribonucleoprotein complexes.</a> New Phytol. 214 (3), 1188-1197 (2017).</li>
<li>Paultre, D. S. G., Gustin, M. -P., Molnar, A., Oparka, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lost+in+Transit%3A+Long-Distance+Trafficking+and+Phloem+Unloading+of+Protein+Signals+in+Arabidopsis+Homografts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Lost in Transit: Long-Distance Trafficking and Phloem Unloading of Protein Signals in Arabidopsis Homografts.</a> Plant Cell. 28 (9), 2016-2025 (2016).</li>
<li>Sali, A., Glaeser, R., Earnest, T., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+words+to+literature+in+structural+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">From words to literature in structural proteomics.</a> Nature. 422 (6928), 216-225 (2003).</li>
<li>Lin, M. -K., Lee, Y. -J., Lough, T. J., Phinney, B. S., Lucas, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+Pumpkin+Phloem+Proteome+Provides+Insights+into+Angiosperm+Sieve+Tube+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Analysis of the Pumpkin Phloem Proteome Provides Insights into Angiosperm Sieve Tube Function.</a> Mol. Cell. Proteomics. 8 (2), 343-356 (2008).</li>
<li>Giavalisco, P., Kapitza, K., Kolasa, A., Buhtz, A., Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+the+proteome+of+Brassica+napus+phloem+sap%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Towards the proteome of Brassica napus phloem sap.</a> Proteomics. 6 (3), 896-909 (2006).</li>
<li>Lucas, W. J., Yoo, B. C., Kragler, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+as+a+long-distance+information+macromolecule+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell.+Bio%22%5BJournal%5D)">RNA as a long-distance information macromolecule in plants.</a> Nat. Rev. Mol. Cell. Bio. 2 (11), 849-857 (2001).</li>
<li>Dinant, S., Kehr, J. Sampling and Analysis of Phloem Sap. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDinant%2C+S+%22Plant+Mineral+Nutrients%22">Plant Mineral Nutrients</a>. 953, 185-194 (2013).</li>
<li>Kennedy, J. S., Mittler, T. E. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/nature/journal/v171/n4351/abs/171528a0.html">A Method of obtaining Phloem Sap via the Mouth-parts of Aphids.</a> Nature. 171 (4351), 528(1953).</li>
<li>King, R. W., Zeevaart, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+Phloem+exudation+from+cut+petioles+by+chelating+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Enhancement of Phloem exudation from cut petioles by chelating agents.</a> Plant Physiol. 53 (1), 96-103 (1974).</li>
<li>Alosi, M. C., Melroy, D. L., Park, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+gelation+of+Phloem+exudate+from+cucurbita+fruit+by+dilution%2C+glutathione%2C+and+glutathione+reductase%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The regulation of gelation of Phloem exudate from cucurbita fruit by dilution, glutathione, and glutathione reductase.</a> Plant Physiol. 86 (4), 1089-1094 (1988).</li>
<li>Dinant, S., Bonnemain, J. -L., Girousse, C., Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phloem+sap+intricacy+and+interplay+with+aphid+feeding%5BTitle%5D)+AND+%22Comptes+rendus+biologies%22%5BJournal%5D)">Phloem sap intricacy and interplay with aphid feeding.</a> Comptes rendus biologies. 333 (6-7), 504-515 (2010).</li>
<li>Tetyuk, O., Benning, U. F., Hoffmann-Benning, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collection+and+analysis+of+Arabidopsis+phloem+exudates+using+the+EDTA-facilitated+Method%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Collection and analysis of Arabidopsis phloem exudates using the EDTA-facilitated Method.</a> J Vis Exp. (80), e51111(2013).</li>
<li>Kovalskaya, N., Owens, R., Baker, C. J., Deahl, K., Hammond, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+a+modified+EDTA-mediated+exudation+technique+and+guttation+fluid+analysis+for+Potato+spindle+tuber+viroid+RNA+detection+in+tomato+plants+%28Solanum+lycopersicum%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Application of a modified EDTA-mediated exudation technique and guttation fluid analysis for Potato spindle tuber viroid RNA detection in tomato plants (Solanum lycopersicum).</a> J. Virol. Methods. 198, 75-81 (2014).</li>
<li>Rodriguez-Medina, C., Atkins, C. A., Mann, A. J., Jordan, M. E., Smith, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macromolecular+composition+of+phloem+exudate+from+white+lupin+%28Lupinus+albus+L%29%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Macromolecular composition of phloem exudate from white lupin (Lupinus albus L).</a> BMC Plant Biol. 11 (1), 36(2011).</li>
<li>Taylor, J. S., Thompson, B., Pate, J. S., Atkins, C. A., Pharis, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokinins+in+the+Phloem+Sap+of+White+Lupin+%28Lupinus+albus+L.%29%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cytokinins in the Phloem Sap of White Lupin (Lupinus albus L.).</a> Plant Physiol. 94 (4), 1714-1720 (1990).</li>
<li>Yoo, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Systemic+Small+RNA+Signaling+System+in+Plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">A Systemic Small RNA Signaling System in Plants.</a> Plant Cell. 16 (8), 1979-2000 (2004).</li>
<li>Buhtz, A., Springer, F., Chappell, L., Baulcombe, D. C., Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+small+RNAs+from+the+phloem+of+Brassica+napus%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of small RNAs from the phloem of Brassica napus.</a> Plant J. 53 (5), 739-749 (2008).</li>
<li>Chalhoub, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+genetics.+Early+allopolyploid+evolution+in+the+post-Neolithic+Brassica+napus+oilseed+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Plant genetics. Early allopolyploid evolution in the post-Neolithic Brassica napus oilseed genome.</a> Science. 345 (6199), 950-953 (2014).</li>
<li>Sasaki, T., Chino, M., Hayashi, H., Fujiwara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+several+mRNA+species+in+rice+phloem+sap%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Phys%22%5BJournal%5D)">Detection of several mRNA species in rice phloem sap.</a> Plant Cell Phys. 39 (8), 895-897 (1998).</li>
<li>Doering-Saad, C., Newbury, H. J., Bale, J. S., Pritchard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+aphid+stylectomy+and+RT-PCR+for+the+detection+of+transporter+mRNAs+in+sieve+elements%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Use of aphid stylectomy and RT-PCR for the detection of transporter mRNAs in sieve elements.</a> J Exp. Bot. 53 (369), 631-637 (2002).</li>
<li>Ruiz-Medrano, R., Xoconostle-Cázares, B., Lucas, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phloem+long-distance+transport+of+CmNACP+mRNA%3A+implications+for+supracellular+regulation+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Dev%22%5BJournal%5D)">Phloem long-distance transport of CmNACP mRNA: implications for supracellular regulation in plants.</a> Dev. 126 (20), 4405-4419 (1999).</li>
<li>Schägger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+molecular+masses+and+oligomeric+states+of+protein+complexes+by+blue+native+electrophoresis+and+isolation+of+membrane+protein+complexes+by+two-dimensional+native+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis.</a> Anal. Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).</li>
<li>Schägger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+electrophoresis+for+isolation+of+membrane+protein+complexes+in+enzymatically+active+form%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form.</a> Anal. Biochem. 199 (2), 223-231 (1991).</li>
<li>Fiala, G. J., Schamel, W. W. A., Blumenthal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+polyacrylamide+gel+electrophoresis+%28BN-PAGE%29+for+analysis+of+multiprotein+complexes+from+cellular+lysates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates.</a> J Vis Exp. (48), e2164(2011).</li>
<li>Rais, I., Karas, M., Schägger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+electrophoresis+for+the+isolation+of+integral+membrane+proteins+and+mass+spectrometric+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional electrophoresis for the isolation of integral membrane proteins and mass spectrometric identification.</a> Proteomics. 4 (9), 2567-2571 (2004).</li>
<li>Schägger, H. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/nprot/journal/v1/n1/full/nprot.2006.4.html">Tricine-SDS-PAGE.</a> Nature protocols. 1 (1), 16-22 (2006).</li>
<li>Wittig, I., Braun, H. -P., Schägger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Blue native PAGE.</a> Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).</li>
<li>Eubel, H., Braun, H. -P., Millar, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue-native+PAGE+in+plants%3A+a+tool+in+analysis+of+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Blue-native PAGE in plants: a tool in analysis of protein-protein interactions.</a> Plant Methods. 1 (1), 11(2005).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li>
<li>Dyballa, N., Metzger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+sensitive+colloidal+coomassie+G-250+staining+for+proteins+in+polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Fast and sensitive colloidal coomassie G-250 staining for proteins in polyacrylamide gels.</a> J Vis Exp. (30), (2009).</li>
<li>Turnbull, C. G. N., Lopez-Cobollo, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heavy+traffic+in+the+fast+lane%3A+long-distance+signalling+by+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">Heavy traffic in the fast lane: long-distance signalling by macromolecules.</a> New Phytol. 198 (1), 33-51 (2013).</li>
<li>Hall, S. M., Baker, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemical+composition+of+Ricinus+phloem+exudate%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">The chemical composition of Ricinus phloem exudate.</a> Planta. 106 (2), 131-140 (1972).</li>
<li>Barnes, A., Bale, J., Constantinidou, C., Ashton, P., Jones, A., Pritchard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+protein+identity+from+sieve+element+sap+in+Ricinus+communis+L.+by+quadrupole+time+of+flight+%28Q-TOF%29+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Determining protein identity from sieve element sap in Ricinus communis L. by quadrupole time of flight (Q-TOF) mass spectrometry.</a> J. Exp. Bot. 55 (402), 1473-1481 (2004).</li>
<li>Walz, C., Giavalisco, P., Schad, M., Juenger, M., Klose, J., Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+of+curcurbit+phloem+exudate+reveals+a+network+of+defence+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Proteomics of curcurbit phloem exudate reveals a network of defence proteins.</a> Phytochemistry. 65 (12), 1795-1804 (2004).</li>
<li>Walz, C., Juenger, M., Schad, M., Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+the+presence+and+activity+of+a+complete+antioxidant+defence+system+in+mature+sieve+tubes%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Evidence for the presence and activity of a complete antioxidant defence system in mature sieve tubes.</a> Plant J. 31 (2), 189-197 (2002).</li>
<li>Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phloem+sap+proteins%3A+their+identities+and+potential+roles+in+the+interaction+between+plants+and+phloem-feeding+insects%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Phloem sap proteins: their identities and potential roles in the interaction between plants and phloem-feeding insects.</a> J Exp. Bot. 57 (4), 767-774 (2006).</li>
<li>Ham, B. -K., Brandom, J. L., Xoconostle-Cázares, B., Ringgold, V., Lough, T. J., Lucas, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+polypyrimidine+tract+binding+protein%2C+pumpkin+RBP50%2C+forms+the+basis+of+a+phloem-mobile+ribonucleoprotein+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">A polypyrimidine tract binding protein, pumpkin RBP50, forms the basis of a phloem-mobile ribonucleoprotein complex.</a> Plant Cell. 21 (1), 197-215 (2009).</li>
<li>Schamel, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biotinylation+of+protein+complexes+may+lead+to+aggregation+as+well+as+to+loss+of+subunits+as+revealed+by+Blue+Native+PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Biotinylation of protein complexes may lead to aggregation as well as to loss of subunits as revealed by Blue Native PAGE.</a> J. Immunol. Methods. 252 (1-2), 171-174 (2001).</li>
<li>Zhang, S., Sun, L., Kragler, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phloem-delivered+RNA+pool+contains+small+noncoding+RNAs+and+interferes+with+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The phloem-delivered RNA pool contains small noncoding RNAs and interferes with translation.</a> Plant Physiol. 150 (1), 378-387 (2009).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Photoassimilates için ana ulaşım yol teşkil eder ve aynı zamanda uzun mesafe farklı bitki parçaları9,20,34arasındasinyal için önemlidir beri phloem bir kompartıman yüksek ilgi var, 35. Küçük moleküller yanı sıra oluştururlar protein ve RNA gibi phloem bakım ve sinyal4,7,8ile karıştığı olmuştur. Phloem kompozisyon analizi tarafından sınırlı erişilebilirlik çoğu bitki türü phloem örnekleri için sınırlıdır. Böcek stylet tekniği yaygın olarak uygulanabilir, ancak deneysel olarak talep ve phloem örnekleri11çok küçük miktarlarda. Phloem örnekleme için kullanılan bir kolay EDTA kolaylaştırdı reaksiyon12tekniğidir. EDTA divalent iyonları kalsiyum gibi chelates ve böylece P-proteinler ve callose elek plakaların kapanış engeller. Bu kullanımı kolay, ancak kirlenme hasarlı hücreleri tarafından eğilimli ve örnekleri seyreltilmiş. EDTA tarafından divalent iyonları tüketen da varolan kompleksleri bir arıza neden olabilir. Ancak, örnekleme tür model bitki A. thaliana15dahil geniş bir dizi sağlar. İn phloem su kendiliğinden reaksiyon yalnızca az sayıda bitki türleri içinde oluşur. Bitki doku10önemli yaralanma içerir invaziv bir yöntemdir. Son zamanlarda şehirlerarası ulaşım4,8,20eğitim için bir modeli tür olarak B. napus kurulmuş. Burada, phloem sap küçük kesik, yaralama etkileri ve kirlenme kaynakları azaltan tatmak mümkündür.
Farklı örnekleme teknikleri kullanarak, farklı bitki türü phloem örnekleri Proteom son yıllarda7,8,17,36,37içinde, araştırmış 38,39. Bu Proteom çalışmalar için proteinler çıkarılan ve koşulları denaturing altında çöktürülmüş ve bu nedenle protein: protein ve protein hakkında sonuçlar izin verme: nükleik asit etkileşimleri mevcut yerel koşullar altında. Co-immunoprecipitation (COIP) ve bindirme deneyleri belirtilen büyük Ribonükleoprotein karmaşık phloem sap kabak40mevcut, ama o herhangi bir makromoleküllerin kompleksleri içinde yerel koşullar altında bulunduğunu gösterilmiştir değil phloem sistemi.
Schägger ve ark. tarafından tanıtılan mavi yerel sayfa 26, sonraki yüksek çözünürlüklü Jel Elektroforez adımları ile birlikte büyük protein kompleksleri her bileşeninin ayrılması etkinleştirin. Yerel B. napus 3D-sayfa analizleri kullanarak phloem çıktı, biz son zamanlarda göstermek birkaç yüksek molekül ağırlıklı protein: protein ve RNP kompleksleri phloem örnekleri var ve enzimatik aktif4vardır. RNPs yanı sıra protein kompleksleri boyutu dışlama Kromatografi gibi izole etmek için alternatif yöntemler var ama BN-sayfasına göre çözünürlük açısından başarısız. Ayrıca, karmaşık ayrılık makul kalitesi için boyutu dışlama sütun matrisler soruşturma altında genel olarak karmaşık moleküler ağırlık göre adapte olmak zorunda. Farklı büyüklükte konut projeleri analiz bu nedenle yoğun maliyet ve BN sayfası olarak yüksek odaklama gücü olarak izin vermez sütunları farklı türde talep edecek.
Kompleksleri B. napus üzerinden analiz etmek için kritik adımlar phloem sap malzeme başlangıç olarak kullanılan toplam miktarı içerir. Phloem örneği en az 600 µL gerekli olan ve beş iyi sulanan bitkilerden elde edilebilir. 3D-sayfa ve BN Kuzey kurutma için ilk BN jel phloem örnekleri yeterli miktarda ile başlatmak gereklidir. 20-30 µg protein her içine de ve en az yüklenebilir kadar bunu başarmak için phloem örnekleri triplicates aynı örneği paralel olarak çalıştır yoğunlaşmıştır. Çok düşük veya çok yüksek konsantrasyonları kompleksleri (şekil 3) algılanmasını azaltır. Phloem örnekleri içine buz üzerine tepki boruları toplanması ve daha sonra kullanmak üzere protein yıkımı ve ciro önlemek donmuş muhafaza edilmelidir. Proteaz inhibitörleri analiz bütün phloem proteomes bulduk, ama aynı zamanda tam etkin bir proteasome B. napus4phloem içinde tanımlanmıştır. Ayrıca, birim ve phloem örnekleri bileşimi örnekleme süresi-noktası ve çevre koşulları10bağlıdır. Bu nedenle benzer koşullar altında günün aynı zamanda toplamak için özen göstermelidir. Stres Tedaviler (örneğin kuraklık) toplanabilir phloem miktarını azaltabilirsiniz. Tek proteinler tarafından kütle spektrometresi tanımlamak için olası keratin contaminations tarafından giyen eldiven her zaman sınırlamak için zorunludur. Keratin ek sinyallere kitle spec Çözümleme sırasında yol açar ve protein kimlik engellemektedir. BN-sayfa daha yüksek bir voltaj veya ortam sıcaklığı çalışan Isıtma kırılgan kompleksleri sökme içinde sonuçlanabilir jel yol açabilir.
Burada sunulan Protokolü protein: protein kompleksleri analiz için uygundur. Ayrıca paralel komplekslerinde yer alan belirli RNA'ların algılamak için kullanılabilir gösterir. Bunu başarmak için biz yeni bir protokol BN4kurutma Kuzey tanıttı. RNA'ların RNAse contaminations tarafından bozulması yatkındır. Bu tür bozulma sınırlamak için DEPC-tedavi, su kullanılmalıdır.
Sunulan yönteminin ana sınırlamalarını boyut, şekil ve ardından değişiklikleri kompleksleri31bile geçiş davranışını bağlıdır beri BN-PAGE tarafından ayrılmış protein kompleksleri molekül ağırlığı tahmini dahil, 41. RNP kompleksleri boyut tahmini nükleik asitler etkisi geçiş davranışı nedeniyle daha karmaşıktır. Bu da kompleksleri aynı boyutta bir tek grupta birlikte geçirmek önlenebilir değil. Bu karmaşık besteleri hatalı tahmin için yol açabilir. Bu nedenle tamamlayıcı teknikleri ile gözlenen etkileşimleri doğrulama, örneğin fonksiyonel deneyleri4,-ebilmek var olmak gerekli. Ayrıca sadece zayıf veya geçici bir makromoleküllerin karmaşık ilişkili proteinler kullanılan BN arabellekte kaybetmiş. Bunu önlemek için örnekleri çapraz, ne de eserler neden olabilir ya da protein tanımlama, engel olabilir veya arabellek koşulları optimize edilebilir.
Klasik 2D-sayfa, aksine kasanın üre SDS sayfa, hydrophobicity ve molekül ağırlığı isoelectric noktası (PI) ve molekül ağırlığı 28yerine göre ayırma verir ve proteinler için ayırma sınırı yok bir belirli pI aralığı. Benzer Klasik 2D sayfa, ayrılmış proteinler, ama tek noktaları olarak görünür bir çapraz çizgi 4,28 (şekil 5, şekil 6). Hidrofilik proteinler daha satır28bulunur, ancak daha fazla hidrofobik proteinler bu çapraz, yukarıda noktalar görünür. Bu protokol için kullanılan polyacrylamide konsantrasyonları proteinler arasında 25-80 kDa de ayıracak. Bir ayrılık daha küçük veya daha büyük proteinlerin polyacrylamide izin vermek için konsantrasyon değiştirilebilir veya Degrade jelleri üçüncü boyutu kullanılabilir. 3D-sayfa (şekil 6) tarafından ayrılmış bileşenleri karmaşık IV (şekil 3) dışarı, sindirmek ve kütle spektrometresi tarafından analiz tripsin kesilmiş. Bu birkaç tRNA ligazlar tanımlaması içinde sonuçlandı. Diğer kompleksleri bileşenlerinin olmuştur son 4yayınlandı. 3D SAYFAMIZI farklı ligazlar, yani aspartat, asparagine, treonin, benzer moleküler ağırlıkları (Tablo 3) ile lizin ve glisin ligazlar ayrılması etkin. Metiyonin tRNA özgü sonda kullanarak, biz karmaşık IV içinde potansiyel olarak ilişkili tRNA algılamak başardık, ama tam uzunlukta tRNA veya tRNA parçaları karmaşık ise kullanılan problar ile ayrımcılık yapamam. Nükleik asitler gerçekten kompleksi içinde ilişkili ve eş geçirme iseniz, proteaz phloem sap sindirilmiş kontrol etmek için örnekleri uygun geçiş denetimleri hizmet verebilir.
Bu daha önce hemen hemen çoğu bileşen tüm ribozom hem de uzatma faktörlere phloem örnekleri4,7' bulduğumda protein çeviri phloem elek tüpler içinde oluşabilir spekülasyonlar. Bizim bulma tRNA ve tRNA ligazlar bu fikri destek gibi görünüyor. Ancak, tRNA parçaları kabak phloem örnekleri mevcut çeviri42 güçlü inhibitörleri olduğu gösterilmiştir ve fonksiyonel ribozomlara çeviri yer alamaz düşündüren4, görünmektedir.
Birlikte ele alındığında, burada sunulan Protokolü yerli protein: protein ve phloem örnekleri ve ayrılık bile RNP kompleksleri ayrılması ve yüksek çözünürlüklü bireysel bileşenleri tanımlaması sağlar. Bu yöntemin uygulama keşif phloem örneklerinde RNP kompleksleri ve roman protein sağlar ve bu nedenle bu çok özel bitki yerde yeni işlevler aydınlatmak.

Phloem uzun mesafe hatları daha yüksek bitkilerde organik besin tahsisi için gerekli olan, ama aynı zamanda birçok farklı işlemler önemli büyüme ve kalkınma, patojen savunma ve adaptasyon için olumsuz düzenlenmesinde katılmaktadırlar çevre koşulları. İyonlar, etki veya metabolitleri kendileri gibi küçük effectors yanı sıra oluştururlar protein ve RNA gibi son zamanlarda potansiyel sinyaller olarak ortaya çıkmıştır.
Çalışmalar proteinlerin phloem yükleme boyutu bağımlı ve dışlama boyutunda (SEL) eşlik eden hücreler (CC) bağlanma gözenek plasmodesmal birimleri tarafından kontrol olduğunu göstermiştir ve elek genellikle 10 aralığındaki öğeleri (SE) > 67 kDa1 , 2 , 3. ancak, rağmen bu boyutu sınırlamaları daha büyük protein ve protein kompleksleri boyutu dışlama4fikri zor phloem sistemi içinde bulundu ve se CC den proteinlerin bile nonspesifik kaybı önerilen5 oldu .
Multiprotein gibi büyük Ribonükleoprotein kompleksleri içinde biyosentezi ve hücre6yapısal bütünlüğünü korumak çok önemli rol oynarlar. Phloem-mobil protein-protein ve Ribonükleoprotein kompleksleri4,7, mevcut kanıt ama bugüne kadar onların işlevi hakkında az şey bilinmektedir. Phloem elek elemanları uzun mesafe taşımacılığı ve / veya sinyal8,9ile protein: protein ve RNP kompleksleri karıştığı. Değişen altında çevre onların kompozisyon translocated kompleksleri fonksiyonları çözmek veya stres koşulları gereklidir. Bunu başarmak için yerel kompleksleri izole olmak zorunda ve bileşenlerinin yeterli çözünürlükte ayrılması gerekiyor.
Yüksek molekül ağırlıklı kompleksleri phloem dan izole etmek için yeterli kalite ve miktar sap örneklerini almak için ilk gerekli olduğunu. Phloem örnekleme için kullanılan teknik faiz bitki türü üzerinde bağlıdır. Phloem su elde etmek için üç ana yöntem mevcut 10: böcek stylectomy11, EDTA kolaylaştırdı reaksiyon12ve spontan reaksiyon13.
Phloem örnekleri Arabidopsis thaliana (A. thaliana), laboratuvarlar dünya çapında, büyük modeli fabrikasında sadece EDTA kolaylaştırdı reaksiyon veya yaprak biti stylectomy14,15tarafından elde edilebilir. Her iki yöntem son derece seyreltik phloem sap veya çok düşük örnek tutarlar için yol. EDTA kolaylaştırdı reaksiyon da kontaminasyon için eğilimli ve gerçek phloem kompozisyon16gösterebilir değil. Spontan phloem reaksiyon nereye çıktığını bitki parçalar keserek kolayca toplanan13,17,18olabilir phloem sap spontan bir emisyon için cucurbits, lupine veya avize, gibi tür bitki sınırlıdır, 19. Son zamanlarda phloem analiz için uygun modeli sistemi olarak yağlı tohum tecavüz (Brassica napus) kurulmuş, ondan beri onun ' A. thaliana yakın akrabası ve birkaç microliters in phloem su için gösterilen küçük insizyon elde edilebilir yüksek saflıkta4,8,20olması. Ayrıca, B. napus genom sırası 201421yılında yayımlanmıştır.
Yaprak biti stylectomy dışında doku örnekleme sitesinde çevreleyen zarar açıklanan tüm phloem toplama yöntemleri içerir ve phloem sap bileşimi yaralanma yanıt olarak değişebilir. Bu nedenle phloem örnekleri, ne olursa olsun uygulanmış örnekleme kalitesini kontrol etmek için esastır. Toplanan phloem sap, örneğin belirlenmesi RNase etkinliği22,23, RT-PCR ile astar Rubisco8,24karşı veya şeker analizi tarafından kalite kontrolü için farklı yöntem vardır kompozisyon8.
Yalıtmak ve protein kompleksleri ayırmak için farklı yöntemler uygulanabilir, boyutu dışlama Kromatografi, sukroz yoğunluğu ultrasantrifüj veya örnek filtrasyon farklı molekül ağırlığı kesim ile membranlar yoluyla dahil olmak üzere off. Ancak, bu yaklaşımların yüksek çözünürlüklü izin vermez. İlk Schägger ve arktarafından açıklanan mavi yerel sayfa (BN SAYFALIK) olarak adlandırılan teknik. 25, çözünürlük açısından üstün. Bu şekilde büyük yerli protein kompleksleri çeşitli organelleri veya hücresel lysates ve onların göreceli zenginliği26,27moleküler ağırlıkları belirlemek için kullanıldı.
Daha fazla protein kompleksleri karmaşık bileşimi aydınlatmak için koşullar, karmaşık bileşenleri tam demontaj için önde gelen denaturing altında tek tek bileşenleri ayırmak gereklidir. Bu ikinci boyutu SDS-sayfa 28,29 veya isoelectric (yardımcı) odaklanan ikinci bir boyuta göre ardından SDS-sayfa30 third dimension ve sonraki tanımlaması daha yüksek çözünürlük elde etmek için elde edilebilir Kütle spektrometresi kullanılarak proteinler.
Bu protokol için saf phloem sap B. napus bitkilerden örnekleme ve protein kompleksleri BN-sayfa Tris-Tricine-üre-sayfa ve SDS-sayfa ile birleştiren bir 3D elektroforetik yaklaşım kullanarak böyle phloem örneklerinden analizini açıklar. Ayrılmış protein karmaşık bileşenleri daha sonra kütle spektrometresi kullanılarak tanımlanır. Buna ek olarak, biz mavi yerel Kuzey büyük RNP kompleksleri4' te, RNA'ların algılanmasını sağlayan bir yöntem olarak kurutma tanıtmak yaklaşımının uygulanabilirliği genişletme.

<table><tbody><tr><td>1,5 mL reaksiyon tüpleri</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td></td></tr><tr><td>SDS PAGE için 10 kuyulu tarak, kalınlık 1 mm</td><td>BioRad</td><td>1653359</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>AppliChem</td><td>131090</td><td></td></tr><tr><td>%30 Akrilamid-bisakrilamid çözeltisi (29:1) çözeltisi</td><td>BioRad</td><td>1610156</td><td></td></tr><tr><td>%30 Akrilamid-bisakrilamid çözeltisi (37.5:1) çözeltisi</td><td>BioRad</td><td></td><td></td>1610158</tr><tr><td>%96 Etanol</td><td>Carl Roth</td><td>P075</td><td></td></tr><tr><td>Asetik asit</td><td>Carl Roth</td><td>6755</td><td></td></tr><tr><td>Agaroz</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>Alüminyum sülfat-(14-18)-hidrat</td><td>AppliChem</td><td>141101</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum peroksodisülfat (APS)</td><td>Carl Roth</td><td>9592.3</td><td></td></tr><tr><td>Bis-Tris</td><td>AppliChem</td><td>A3992</td><td></td></tr><tr><td>Borik asit</td><td>AppliChem</td><td>A2940</td><td></td></tr><tr><td>Bromofenol mavisi</td><td>AppliChem</td><td>A2331</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj yoğunlaştırıcılar örn. Vivaspin 500 (Mwco 10 kDa)</td><td>Sartorius</td><td>VS0102</td><td></td></tr><tr><td>Kemilüminesan Nükleik Asit Algılama Modülü Kiti</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89880</td><td></td></tr><tr><td>Kromatografi kağıtları Örn. 3 mm CHR</td><td>Whatman</td><td>3030-153</td><td></td></tr><tr><td>CoolBox M30 Sistem</td><td>Biyosiyonu</td><td>BCS-133</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie parlak Mavi G-250</td><td>AppliChem</td><td>A3480</td><td></td></tr><tr><td>Dietil pirokarbonat (DEPC)</td><td>AppliChem</td><td>A0881</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>AppliChem</td><td>A1101</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>AppliChem</td><td>A3778</td><td></td></tr><tr><td>Etanol abs.</td><td>AppliChem</td><td>A3693</td><td></td></tr><tr><td>Etilendiamintetraasetik asit (EDTA)</td><td>AppliChem</td><td>A1103</td><td></td></tr><tr><td>Jel Görüntüleme sistemi örn.</td><td></td><td>1708370</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 1kb artı</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SM1331</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>AppliChem</td><td>141339</td><td></td></tr><tr><td>Glisin</td><td>Uygulaması</td><td>131340</td><td></td></tr><tr><td>Isıtma bloğu TS1</td><td>Biometra</td><td>846-051-500</td><td></td></tr><tr><td>Hibridizasyon fırını örn. GFL Hibridizasyon İnkübatörü 7601</td><td>GFL</td><td>7601</td><td></td></tr><tr><td>Hipodermik iğne (0,8 mm)</td><td>B Braun</td><td>4658309</td><td></td></tr><tr><td>IPG jel tarak, kalınlık 1 mm</td><td>BioRad</td><td>1653367</td><td></td></tr><tr><td>RNA'nın etiketlenmesi örn.Biotin 3'end DNA Etiketleme Kiti</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89818</td><td></td></tr><tr><td>Doğal gradyan jel örn. Novex NativePAGE 4&ndash; % 16 Bis-Tris protein jeli</td><td>Invitrogen</td><td>BN1002BOX</td><td></td></tr><tr><td>Naylon membran örn. Hybond-N+</td><td>Amersham Pharmacia</td><td>RPN203B</td><td></td></tr><tr><td>Orto-fosforik asit</td><td>Carl Roth</td><td>6366.1</td><td></td></tr><tr><td>PageRuler boyalı protein merdiveni</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26616</td><td></td></tr><tr><td>Jel elektroforezi için güç kaynağı EPS</td><td>Amersham Pharmacia</td><td>18-1130-01</td><td>GE Healthcare</td></tr><tr><td>RNA Temizleme Kiti'nden</td> edinilebilir <td>Qiagen</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>Yarı kuru leke e.g. Fastblot 43B yarı kuru Leke</td><td>Biometra</td><td>846-015-100</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür (NaCl)</td><td>AppliChem</td><td>A1149</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum dodesil sülfat (SDS)</td><td>AppliChem</td><td>142363</td><td></td></tr><tr><td>cDNA sentezi örn. RevertAid First Strand cDNA Sentez Kiti</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K1621</td><td></td></tr><tr><td>Tetrametiletilendiamin (TEMED)</td><td>AppliChem</td><td>A1148</td><td></td></tr><tr><td>Tricine</td><td>AppliChem</td><td>A3954</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>AppliChem</td><td>A1086</td><td></td></tr><tr><td>Tri-sodyum sitrat dihidrat</td><td>AppliChem</td><td>A3901</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reaktif</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>ULTRAhyb Ultra Hassas Hibridizasyon Tamponu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM8670</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>AppliChem</td><td>A1360</td><td></td></tr><tr><td>UV Çapraz Bağlayıcı ör Fisher Scientific'ten Stratalinker 2400</td><td>Agilent</td><td>NC0477671</td><td></td></tr><tr><td>Dikey elektroforez cihazı örn.XCell SureLock Mini-Cell veya Mini-Protean III Sistemi</td><td>Thermo Fisher Scientific veya BioRad</td><td>EI0001 veya 1658004</td><td></td></tr><tr><td>Silecekler örn KIMWIPES Hassas Görev Silecekleri</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34120</td><td></td></tr></tbody></table>

phloem sap örnekleme gelen brassica napus 3d-sayfa protein ve ribonükleoprotein kompleksleri için

Phloem Sap Sampling from Brassica napus for 3D-PAGE of Protein and Ribonucleoprotein Complexes

Phloem daha yüksek bitkilerin örnekleme kez zahmetli ve önemli ölçüde bağlı olarak bitki türü. Ancak, koşullar denaturing altında Proteom çalışmaları farklı bitki türü içinde elde edilebilir. Yerli protein: protein ve protein: nükleik asit kompleksleri phloem örneklerinden henüz pek analiz, her ne kadar onlar bu özel bölümü bakım veya uzun mesafeli sinyal önemli roller oynamak. Büyük moleküler gruplar mavi yerli Jel Elektroforez (BN-sayfa) kullanarak ayrılmış olabilir. Protein bileşenleri bir sonraki Sodyum Lauryl Sülfat (SDS-sayfa) tarafından ayrılabilir. Ancak, protein benzer moleküler ağırlıkları ile ne tarafından kütle spektrometresi protein kimlik engel olabilir ortak göç eder. İki farklı denaturing Jel Elektroforez adımları ile yani Tris-Tricine-üre ve SDS-sayfa, BN-sayfa birleştirerek proteinler onların hydrophilicity/hydrophobicity göre ek ayrılması sağlar ve böylece çözünürlük ve başarı artırır protein tanımlaması. Hatta sadece onların ardından değişikliklerini farklı proteinler ayırt sağlar. Ayrıca, mavi yerel Kuzey kurutma makromoleküllerin komplekslerinde RNA bileşenlerini belirlemek için uygulanır. Bizim iletişim kuralı protein ve RNA bileşenlerini yerli protein: protein ve phloem örneklerinde meydana gelen Ribonükleoprotein (RNP) kompleksleri çözülmeye uygun olduğunu göstereceğiz. Bir mavi birleştirerek iki farklı denaturing sayfa adımlar ile yerel sayfa büyük protein kompleksleri farklı türde ayırmak için yardımcı olabilir ve ayrıca tarafından kütle spektrometresi bileşenlerinin bir artan tanıma oranı sağlar. Ayrıca, aynı anda tek protein kompleksleri içinde potansiyel olarak ilişkili nükleik asitler algılamak için sağlam bir protokoldür.

Burada protein: protein analizi sağlayan bir protokol mevcut yanı sıra protein: RNA kompleksleri Brassica napusphloem örnekleri içinde. İş akışını şekil 1' de gösterilmiştir. B. napus diğer canlılar bir büyük avantajı nispeten kolay phloem örnek koleksiyon önümüzdeki kök küçük delikler imkanı vardır. Bu saf phloem örneklerini nispeten büyük miktarda almak için sağlar. Phloem örnekleme zaman, her zaman contaminations için örneğin RT-PCR8tarafından kontrol etmek için tavsiye edilir. Saf phloem örnekten elde edilen bir temsilcisi sonuç Şekil 2' de tasvir edilir. Sinyal rubisco ve polen kat protein için görünmelidir ise sigara-kirlenmiş phloem örnekleri thioredoxin h, görünür bir bantını göstermelidir. Rubisco küçük alt birim bir denetim yaprakları, örnekleri olarak hizmet verebilir önümüzdeki kaynaklanıyor olsa veya polen. Polen kat protein transkript sadece çiçek tomurcuk örneklerinde görünür gerekirken onun mRNA farklı tür, phloem içinde bulundu beri Thioredoxin h tüm örnekleri, tespit olmalıdır. Contaminations phloem örnekleme tam çiçekli bitkiler (polen kat protein) veya delikler örnekleme phloem gelen ilk damlacıkları düzgün atılır değil gerçekleştirildiğinde oluşabilir (rubisco).
BN-sayfa önce phloem sap konsantre zorunluluğu vardır. 20-30 µg protein iyi kullanarak, en az dört büyük protein karmaşık bant B. napus phloem sap, çok düşük BN sayfa sonra görünür hale gelir veya çok yüksek konsantrasyonda kompleksleri (şekil 3) net bir ayrım izin vermiyor. Bu aynı kompleks bir tek cep daha da aşağı akım işleme ve sonraki kitle spektrometrik kimlik tek her karmaşık gelen proteinler konsantre için ikinci boyut jel içine temsil eden birkaç jel bantları yüklemek için tavsiye edilir.
Phloem makromoleküllerin kompleksleri bireysel bileşenlerini belirlemek için biz ilk BN SAYFALIK bir ikinci boyut Tris-Tricine-üre ile kombine ve bir üçüncü bir ayrılık tek protein elde etmek için SDS-sayfa boyut. Burada, yüksek çözünürlüklü bir ayrılık nedeniyle de üre ve SDS-sayfa jelleri farklı protein geçiş davranışları görülebilir. Genellikle, proteinler için tek bir kompleks ait jel arasında çapraz bir çizgi görünür. Proteinler sınırının altında daha hidrofilik olanlar28 (şekil 5, şekil 6) temsil ise proteinler bu çizginin üzerinde artan bir hydrophobicity var.
RNP kompleksleri karakterizasyonu için BN Kuzey kurutma gerçekleştirmek için BN-sayfa jel bir parçası kullanılır. Bütün sokağın üstüne bir naylon membran ve çapraz UV radyasyon kurutma sonra RNA RNA özgü probları şekil 4' te gösterildiği gibi kullanarak görüntülenmeyecektir. Burada belirli bir tRNA sadece belirli bir kompleks mevcuttur gösterilir. Bu tRNA-bağlama kompleks protein bileşenleri yukarıda açıklanan 3D jel yaklaşım kullanarak daha fazla araştırılması. Kitle spektrometrik analizi bu tesis ne BN Kuzey Blot tarafından bulundu tRNA bağlama etkinliği onaylar özellikle tRNA ligazlar içerir gösterdi.
<img alt="Phloem sap analiz süreci akış şeması; mavi yerel SAYFA; RNA, protein bileşimi tanımlaması." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57097/57097fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Şekil 1: iş akışı Ribonükleoprotein kompleksleri analiz yağlı tohum tecavüz phloem sap. Örnekleme ve phloem örnekleri hazırlanması sonra BN-sayfa yerel kompleksleri ayırmak için gerçekleştirilir. Böyle BN-sayfa jelleri nükleik asitler BN Kuzey Blot tarafından paralel analizi ve kütle spektrometresi tarafından kompleksleri protein bileşenlerinin tanımlaması izin verir. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57097/57097fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Bitki protein ekspresyon analizi; jel elektroforezi; yaprak, floem, çiçek örnekleri; moleküler bantlar." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57097/57097fig2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Şekil 2: örnekleme ve saflık kontrolü B. napusözlerinin phloem. 8-10 haftalık yağlı tohum tecavüz bitkiler steril bir şırınga iğnesi ile önümüzdeki kök delinme sonra çıktı bir pipet ile toplanır ve RT-PCR gerçekleştirilen phloem örnekleri saflığı onaylamak için bir buz gibi tepki tüp için (a) transfer, thioredoxin h, rubisco küçük alt birim ve polen kat protein özel doku örneklerinde (b) transkriptaz olmadan RT-PCR transkript yükseltecek denetimi (-) olarak gerçekleştirildi. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57097/57097fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Protein elektroforezi: Protein kompleksi ayrımı ve analizi için jel bantlı SDS-PAGE diyagramı." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57097/57097fig3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Şekil 3: BN-sayfa. Mavi yerel sayfa şematik gösterim konsantre phloem örnekleri ile B. napus. (a) 15-20 µL in konsantre phloem su ile degrade protein jel yükleme sonra BN-sayfa 1 x koyu mavi katot arabellek B 150 V 20-30 dk soğuk bir odada ile gerçekleştirilir. Daha sonra arabellek karşı 1 x ışık mavi katot tampon B/10 değiştirilir ve sayfa açık çalışır jel dışında çalışan koyu mavi kadar 150 V 120-180 dakika bitti. BN-sayfa jelleri dört farklı yüksek molekül ağırlıklı kompleksleri temsil eden dört farklı bant göster. (b) (c) çok az veya çok fazla (d) phloem proteinler yükleniyor bireysel kompleksleri görünürlüğünü azaltır. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57097/57097fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Mavi yerel PAGE diyagramı: jel elektroforezi, membran transferi, UV çapraz bağlama, Northern blot işlemi." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57097/57097fig4.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> Şekil 4: BN Kuzey Blot. BN Blot yöntemi Kuzey şematik gösterimi. (a) bir lane BN sayfasının naylon membran yarı kuru Blot tarafından aktarılır. UV-çapraz ve öncesi hibridizasyon sonra membran biotinylated hibridizasyon fırında 3'-son gece boyunca olan RNA belirli problar (burada metiyonin tRNA özgü sonda), ile inkübe. Ücretsiz probları adımları yıkayarak kaldırılır ve RNA tespiti streptavidin-HRP eşlenik ve luminol tarafından yapılmaktadır. Bu yaklaşımı kullanarak, biz BN sayfasından karmaşık IV metionin içerir gözlenen tRNA. (b) lekeli Coomassie jel ve tRNA leke geçiş farklılıkları önlemek için paralel olarak çalıştır iki farklı jel şeritli benzer. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57097/57097fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Protein elektroforez analizi için mavi yerel PAGE, Tris-Trisin-üre PAGE ve SDS-PAGE diyagramı." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57097/57097fig5.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> Şekil 5: 3D-sayfa. 3D-sayfa yaklaşım şematik gösterimi. Aynı kompleks birkaç grup BN-sayfa jel eksize, arabellek yüklenirken inkübe ve ikinci boyutu Tris-Tricine-üre-sayfa bir kuyunun içine aktarılır. Elektroforez sonra bütün jel şerit kesip, asidik asit arabellekte yıkanmış, equilibrated ve % 15 SDS-sayfa jel yerleştirilir. Üçüncü boyut sayfa sonra lekeli ve kütle spektrometresi tarafından analiz Coomassie ayrılmış proteinlerdir. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57097/57097fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Protein komplekslerinin BN-PAGE ve SDS-PAGE ayrımını gösteren elektroforez diyagramı, kompleks IV." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57097/57097fig6.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 6"> Şekil 6: temsilcisi sonuçlar 3D-sayfa sonra. İlk boyut BN-sayfa içinde birkaç kompleksleri ortaya çıktı. Protein bileşenleri daha fazla bir diyagonal nokta şeklinde sonuçlanan iki sonraki denaturing sayfaları tarafından ayrılmış. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57097/57097fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Sonda</td>
			<td>Sıra</td>
		</tr>
<tr>
<td>Thioredoxin h</td>
			<td>
 İleri: CTCAAGGCAGCCAAAGAATC geriye doğru: ATGGCCTGAACATCGAACTC</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rubisco küçük bir zincir</td>
			<td>
 İleri: TTCACCGGCTTGAAGTCATC geriye doğru: CCGGGTACTCCTTCTTGCAT</td>
		</tr>
<tr>
<td>Polen kat protein BRU77666</td>
			<td>
 İleri: TCAGAACTGGAGCTTCAACG geriye doğru: TTCCTTAATGGCCTCAGTGG</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: phloem örnek saflık kontrolü için kullanılan astar. Phloem örnek saflık onaylamak için astar rubisco küçük bir zincir, thioredoxin h ve polen kat protein için özel cDNA amplifikasyon için kullanılabilir.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Arabellekleri ve çözümleri</td>
			<td colspan="2">İçerik</td>
			<td>Yorum</td>
		</tr>
<tr>
<td>koyu mavi katot arabellek B</td>
			<td colspan="2">15 mM Bis-Tris pH 7,0 50 mM Tricine %0,02 (w/v) Coomassie mavi G250</td>
			<td>tarifi Fiala vd. 17 uyarlanmıştır pH 7,0 için ayarlanması gereken Arabellek 10 x stok olarak yapılabilir</td>
		</tr>
<tr>
<td>hafif mavi katot arabellek B/10</td>
			<td colspan="2">15 mM Bis-Tris pH 7,0 50 mM Tricine %0,002 (w/v) Coomassie mavi G250</td>
			<td>Arabellek katot katot arabellek Coomassie olmadan B önbellekle sulandrarak hazır olun</td>
		</tr>
<tr>
<td>anot arabellek</td>
			<td colspan="2">
 50 mM Bis-Tris pH 7,0</td>
			<td>Arabellek 10 x hisse senedi çözüm olarak hazırlanan</td>
		</tr>
<tr>
<td>SDS örnek arabellek x 2</td>
			<td colspan="2">
 125 mM Tris-HCl pH 6.8 %4 SDS % 20 gliserol 0,2 M DTT %0,02 (w/v) bromophenol mavi</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Aktarım arabellek 1 x TBE arabellek</td>
			<td colspan="2">
 89 mM Tris pH 7,6 89 mM Borik asit 2 mM EDTA</td>
			<td>TBE tampon yapılan ve 5 x veya 10 x hisse senetleri depolanan. Kullanım RNase free deiyonize su için önemlidir.</td>
		</tr>
<tr>
<td>SSC arabellek x 2</td>
			<td colspan="2">
 300 mM NaCl 30 mM Na3sitrat pH 7,0</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>3 x jel arabellek</td>
			<td colspan="2">
 3 M Tris 1 M HCl %0,3 SDS pH 8.45</td>
			<td>Schägger 19 adapte tarifi
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tris-Tricine jel çözüm A</td>
			<td colspan="2">
 10 mL için: % 30 Akrilamid-bisacrylamide (29:1) 3.34 mL 6 M üre 3 x jel arabellek 3.34 mL % 70 gliserol 1.4 mL GKD2O 10 mL için eklemek % 10 APS 40 ΜL TEMED 4 ΜL</td>
			<td>6 M üre ağırlık ve 3 x jel arabellek, Akrilamid-bisacrylamide çözüm ve % 70 gycerol ekleyin. Üre solubilize için bir su banyosunda 60 ° c ısı. GKD2O 10 mL, % 10 ekleyin APS ve nihayet TEMED polimerizasyon için.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tris-Tricine jel çözüm B</td>
			<td colspan="2">
 6 mL için: % 30 Akrilamid-bisacrylamide (29:1) 0.8 mL 6 M üre 3 x jel arabellek 1,5 mL GKD2O 6 mL için eklemek % 10 APS 45 ΜL TEMED 4.5 ΜL</td>
			<td>6 M üre ağırlık ve 3 x jel tampon ve Akrilamid-bisacrylamide çözüm ekleyin. Üre solubilize için bir su banyosunda 60 ° c ısı. GKD2O 10 mL, % 10 ekleyin APS ve nihayet TEMED polimerizasyon için.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tris-Tricine çalışan arabellek (anot) x 1</td>
			<td colspan="2">
 100 mM Tris 22.5 mM HCl pH 8,9</td>
			<td>Schägger 19 adapte tarifi
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tris-Tricine çalışan arabellek (katot) x 1</td>
			<td colspan="2">
 100 mM Tris 100 mM Tricine % 1 SDS pH 8,25</td>
			<td>Schägger 19 adapte tarifi
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Asidik arabellek</td>
			<td colspan="2">
 100 mM Tris 100 mM Asetik asit</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>%4 SDS yığın jel</td>
			<td colspan="2">
 2 mL için: GKD2O 1.4 mL % 30 Akrilamid-bisacrylamide (37.5:1) 0.33 mL 1 M Tris pH 6.8 0.25 mL % 10 SDS 20 ΜL % 10 APS 20 ΜL TEMED 2 ΜL</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Jel ayıran % 15 SDS</td>
			<td colspan="2">
 10 mL için: GKD2O 2.3 mL % 30 Akrilamid-bisacrylamide (37.5:1) 5 mL 1.5 M Tris pH 8,8 2.5 mL % 10 SDS 100 ΜL % 10 APS 100 ΜL TEMED 4 ΜL</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>SDS çalışan arabellek x 1</td>
			<td colspan="2">
 25 mM Tris 192 mM glisin %0.1 SDS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Çözüm boyama Coomassie</td>
			<td colspan="2">
 %5 (w/v) alüminyum sülfat-(14-18)-hidrat % 10 (v/v) etanol (% 96) %2 (v/v) dezenfektan maddeler (% 85) %0,02 (w/v) Coomassie parlak mavi G-250 
			 </td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>ULTRAhyb vericiyi hibridizasyon arabellek</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>Ambion, yaşam teknolojileri</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 2: çözümler ve arabellek tarifleri. Liste-in tüm arabellekleri ve çözümleri 3D-sayfa analizi için gerekli.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Hayır nokta.</td>
			<td>MW obs. [kDa]</td>
			<td colspan="2">Kimlik</td>
			<td>Organizma</td>
			<td>Hayır katılım.</td>
			<td>MW [kDa]</td>
			<td>Maskot puanı</td>
		</tr>
<tr>
<td>CIV_1</td>
			<td>130</td>
			<td colspan="2">Sözde hastalık direnci protein At4g19050</td>
			<td>B. napus</td>
			<td>CDX78917</td>
			<td>131.1</td>
			<td>110</td>
		</tr>
<tr>
<td>CIV_2</td>
			<td>130</td>
			<td colspan="2">Sözde hastalık direnci protein At4g19050</td>
			<td>B. napus</td>
			<td>CDX78917</td>
			<td>131.1</td>
			<td>89</td>
		</tr>
<tr>
<td>CIV_3</td>
			<td>100</td>
			<td colspan="2">Isı şok 70 kDa protein 14 gibi</td>
			<td>B. napus</td>
			<td>XP_013748865</td>
			<td>89.9</td>
			<td>113</td>
		</tr>
<tr>
<td>CIV_4</td>
			<td>90</td>
			<td colspan="2">Ökaryotik uzama faktör 2 Hücre bölünmesi kontrol protein 48 homolog A</td>
			<td>B. napus B. napus</td>
			<td>CDX90241 CDY41316.1</td>
			<td>89,5 89,5</td>
			<td>111 197</td>
		</tr>
<tr>
<td>CIV_5</td>
			<td>85</td>
			<td colspan="2">Isı şok protein 90-2-gibi</td>
			<td>B. rapa</td>
			<td>XP_009132342</td>
			<td>79,8</td>
			<td>172</td>
		</tr>
<tr>
<td>CIV_6</td>
			<td>80</td>
			<td colspan="2">Treonin--tRNA ligaz Glisin--tRNA ligaz</td>
			<td>B. oleracea B. napus</td>
			<td>XP_013599115 CDY43195</td>
			<td>81,5 80.8</td>
			<td>110 88</td>
		</tr>
<tr>
<td>CIV_7</td>
			<td>70</td>
			<td colspan="2">Isı şok protein 70 kDa Lizin - tRNA ligaz benzeri</td>
			<td>B. oleracea B. napus</td>
			<td>XP_013685267 XP_013747530</td>
			<td>67,8 69.9</td>
			<td>230 150</td>
		</tr>
<tr>
<td>CIV_8</td>
			<td>65</td>
			<td colspan="2">Myrosinase Aspartat--tRNA ligaz 2 Asparagine--tRNA ligaz 1</td>
			<td>B. napus B. napus B. napus</td>
			<td>ABQ42337 XP_013670803 XP_013729126</td>
			<td>60.6 61.6 63,5</td>
			<td>183 141 153</td>
		</tr>
<tr>
<td>CIV_9</td>
			<td>60</td>
			<td colspan="2">Myrosinase</td>
			<td>B. napus</td>
			<td>ABQ42337</td>
			<td>60.6</td>
			<td>164</td>
		</tr>
<tr>
<td>CIV_10</td>
			<td>55</td>
			<td colspan="2">Adenosylhomocysteinase 2 gibi</td>
			<td>B. rapa</td>
			<td>XP_009135865</td>
			<td>53.1</td>
			<td>139</td>
		</tr>
<tr>
<td>CIV_11</td>
			<td>55</td>
			<td colspan="2">Uzama faktör 1-alfa 1-gibi</td>
			<td>B. oleracea</td>
			<td>XP_013586115</td>
			<td>51,9</td>
			<td>161</td>
		</tr>
<tr>
<td>CIV_12</td>
			<td>50</td>
			<td colspan="2">Sistin liyaz CORI3 gibi</td>
			<td>B. napus</td>
			<td>XP_013653143</td>
			<td>48.1</td>
			<td>237</td>
		</tr>
<tr>
<td>CIV_13</td>
			<td>44</td>
			<td colspan="2">Sistin liyaz CORI3 gibi</td>
			<td>B. rapa</td>
			<td>XP_009108611</td>
			<td>48.3</td>
			<td>213</td>
		</tr>
<tr>
<td>CIV_14</td>
			<td>38</td>
			<td colspan="2">Fruktoz-bisphosphate aldolaz</td>
			<td>B. rapa</td>
			<td>XP_009115993</td>
			<td>38.4</td>
			<td>226</td>
		</tr>
<tr>
<td>CIV_15</td>
			<td>45</td>
			<td colspan="2">Sistin liyaz CORI3 gibi</td>
			<td>B. rapa</td>
			<td>XP_009108611</td>
			<td>48.3</td>
			<td>219</td>
		</tr>
<tr>
<td>CIV_16</td>
			<td>45</td>
			<td colspan="2">Sistin liyaz CORI3</td>
			<td>B. rapa</td>
			<td>CDY69765</td>
			<td>46.9</td>
			<td>209</td>
		</tr>
<tr>
<td>CIV_17</td>
			<td>38</td>
			<td colspan="2">Fruktoz-bisphosphate aldolaz</td>
			<td>B. rapa</td>
			<td>XP_009115993</td>
			<td>38.4</td>
			<td>124</td>
		</tr>
<tr>
<td>CIV_18</td>
			<td>18</td>
			<td colspan="2">Peptit-prolyl CIS-trans izomeraz CYP18 3 gibi</td>
			<td>B. napus</td>
			<td>XP_009101932</td>
			<td>18,3</td>
			<td>128</td>
		</tr>
<tr>
<td>CIV_19</td>
			<td>45</td>
			<td colspan="2">Sistin liyaz CORI3 gibi</td>
			<td>B. rapa</td>
			<td>XP_009108611</td>
			<td>48.3</td>
			<td>177</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 3: tanımlanan protein bileşenler karmaşık IV. Birkaç tRNA ligazlar ve daha fazla protein tRNA bağlayıcı kompleksi içinde bulunan 3D-sayfa sonra kitle spektrometrik analizi MALDI-TOF kullanarak.

Burada büyük yerli protein: protein ve protein protein bileşimi çözümlemek için bir protokol mevcut: yağlı tohum tecavüzünün nükleik asit kompleksleri (B. napus) mavi birleştiren 3D polyacrylamide Jel Elektroforez (sayfa) yaklaşımı kullanılarak, phloem çıktı yerli (BN) tarafından kitle spektrometrik kimlik ardından iki tane denaturing sayfa.

Phloem Sap örnekleme gelen Brassica napus 3D-sayfa Protein ve Ribonükleoprotein kompleksleri için

Sampling the phloem of higher plants is often laborious and significantly dependent on the plant species. However, proteome studies under denaturing ...

Bu 3D-PAGE prosedürünün genel amacı, ilgili nükleik asit ve protein bileşenlerinin tanımlanması ile birlikte protein ve ribonükleoprotein komplekslerini Brassica napus ploem özsuyundan ayırmaktır. Bu yöntem, biyokimya ve bitki fizyolojisindeki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Örneğin, stres altında floem komplekslerinin bileşimini analiz edebilirsiniz.Tekniğin temel avantajı, saf floem özsuyunun toplanabilmesi ve nükleik asitlerin yanı sıra protein bileşenlerinin de aynı anda analiz edilebilmesidir. Bu yöntem, yağlı tohum kolzasının floem sistemi içindeki protein, protein ve protein nükleik asit etkileşimleri hakkında bilgi sağlayabilse de, kabakgiller, acı baklalar ve yucca gibi diğer bitkilerin floem analizine de uygulanabilir. Bu yöntem için ilk olarak, spesifik floem proteini için protein ve RNA etkileşim ortaklarını belirlemeye çalıştığımızda aklımıza geldi.İlk olarak, sekiz haftalık bir B.napus bitkisinin çiçekli sapını 0.8 milimetrelik bir hipodermik iğne kullanarak birkaç kez delin. Yeterli floem özü elde etmek için aynı bitki ve diğer bitkiler üzerinde diğer birkaç çiçekli gövdeyi delin. Her yaralı bölgedeki ilk damlayı filtre kağıdı ile silin.İlk damlaları çıkardıktan sonra, kalan damlaları toplamak için bir pipet kullanın. Ve bunları önceden soğutulmuş konik 1.5 mililitrelik bir reaksiyon tüpüne aktarın. Daha sonra toplanan eksüdayı buzsuz bir soğutma sistemi kullanarak eksi 20 santigrat derecede saklayın.Başka damla oluşumu gözlenmeyene kadar, ancak bir saatten fazla olmamak üzere damla toplamaya devam edin. Daha sonra, floem örneğini 10.000 daltonluk bir moleküler ağırlığa sahip bir santrifüj yoğunlaştırıcıya ekleyin ve başlangıç hacminin yaklaşık 1 / 6'sına konsantre edin. Ardından, toz parçacıklarını gidermek için konsantre numuneyi dört santigrat derecede ve 20.000 g'da en az 15 dakika santrifüjleyin.Mavi yerel PAGE gerçekleştirmek için jel haznesini monte edin. Ve yarıya koyu mavi katot tamponu B ekleyin ve kuyuları katot tamponu ile yıkayın. Oyuk başına 20 ila 30 mikrogram konsantre protein örneğini en az üç kopya halinde ticari bir Bis-Tris radyant jele yükleyin.Hazneyi katot ve anot tamponu ile doldurun ve jeli, numune jelin 1 / 3'ünü geçene kadar dört santigrat derece ve 150 voltta çalıştırın, bu da 20 ila 30 dakika sürer. Açık mavi katot tamponu B 1/10 ile koyu mavi katot tamponu B'yi değiştirmeyi duraklatın. Koşuyu yeniden başlatın ve mavi ön kısım jelden dışarı çıkmaya başlayana kadar devam edin, bu 120 ila 180 dakika sürer.Doğal mavi jelden bütün bir jel şeridini kesin, ardından yarı kuru kurutma ile naylon bir zar üzerine aktarın ve zar üzerindeki üst ve alt jel kenarlıklarını bir kalemle işaretleyin. Kurutma işleminden sonra, membranı DEPC ile arıtılmış suyla yıkayın ve kuruması için iki parça filtre kağıdı arasına yerleştirin. Bunu takiben, lekeli zarın santimetre kare başına 120.000 mikro jul uygulanan bir enerji ile UV çapraz bağlamasını gerçekleştirin.Şimdi, UV çapraz bağlı membranı altı mililitre hibridizasyon tamponu ile bir hibridizasyon fırınında 68 santigrat derecede 60 dakika boyunca önceden hibritleyin. Membrana dört mikrolitre 3-prime biyotinillenmiş prob içeren bir mililitre daha hibridizasyon tamponu ekleyin. Ardından, hibridizasyon fırınını 68 ila 37 santigrat derece arasında soğuturken zarı gece boyunca prob ile inkübe edin.Ertesi gün, spesifik olmayan şekilde bağlanmış probları çıkarmak için membranı 2x SSC ve% 0.1 SDS içeren tamponla oda sıcaklığında beş dakika boyunca yıkayın. Bir yaban turpu peroksidaz substratı olarak bir streptavidin HRP konjugatı ve luminol ile membran üzerindeki 3-prime biyotinillenmiş probların tespitini gerçekleştirin, bu da hassas bir kemilüminesan reaksiyonu ile sonuçlanır. Mavi yerli jelden tek bantları çıkarın.Daha fazla karmaşık protein konsantrasyonu elde etmek için 1.5 mililitrelik bir konik reaksiyon tüpünde paralel şeritler halinde çalışan numunelerden alınan bantları birleştirin. % 12'lik bir Tris-Trisin üre jeli hazırlamak için, iki cam plaka arasına 10 mililitre jel çözeltisi A dökün ve izopropanol ile kaplayın. Polimerizasyondan sonra, izopropanolü çıkarın, jele iki ila üç mililitre jel çözeltisi B ekleyin ve 10 kuyulu bir tarak yerleştirin.Eksize edilen jel parçalarının dengelenmesi için, reaksiyon tüpüne bir mililitre 2x SDS numune tamponu ekleyin. Numuneyi oda sıcaklığında 10 dakika inkübe ettikten sonra, 95 santigrat derecede bir ısıtma bloğunda yaklaşık bir dakika ısıtın. Daha sonra numuneyi oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.Bunu takiben, aynı kompleksi temsil eden birkaç dengelenmiş jel parçasını tek bir jel cebine istifleyin. Jel haznesini monte ettikten sonra, 45 ila 60 dakika boyunca 150 voltta anot ve katot çalıştırma tamponları kullanarak elektroforez gerçekleştirin. Bittiğinde, tüm jel şeridini kesin.Kesilen jel şeridini asidik tamponda 20 dakika inkübe edin. Daha sonra, 20 dakika daha pH 6.8'de 125 milimolar Tris-HCL'de dengeleyin. Şeride göre% 15'lik bir SDS ayırıcı jel solüsyonu dökün.Jel katılaştıktan sonra, izopropanolü çıkarın, %4'lük bir istifleme jeli çözeltisinden üç mililitre ekleyin ve IPG jelleri için özel tarağı yerleştirin. Katılaşmadan sonra, dengeleyici jel şeridini SDS jeli üzerine aktarın ve jeli, bir miktar bromofenol mavisi ile desteklenmiş 1x SDS çalışma tamponunda %0.5 agaroz ile kaplayın. Jel haznesini monte ettikten sonra, jeli 60 dakika boyunca 150 voltta çalıştırın.Bittiğinde, sonraki kütle spektrometrik analizi için jeli kolloidal Kumasi çözeltisi ile boyayın. Son olarak, matris destekli lazer desorpsiyon iyonizasyon uçuş süresi spektrometrisi kullanarak görünür protein lekelerini analiz edin. Saf bir floem örneğinden elde edilen temsili bir sonuç burada tasvir edilmiştir.Kontamine olmayan floem örnekleri tioredoksin yaşı için görünür bir bant gösterirken, RuBisCO ve polen kaplama proteini için herhangi bir sinyal gözlenmemiştir. BN PAGE'den sonra en az dört ana protein kompleksi bandı görünür hale gelir. Çok düşük veya çok yüksek konsantrasyonlarda floem özü, komplekslerin net bir şekilde ayrılmasına izin vermez.Üre ve SDS-PAGE jellerindeki farklı protein migrasyon davranışlarına bağlı olarak 3D PAGE'de yüksek çözünürlüklü ayrışma gözlenir. Tipik olarak, tek bir komplekse ait proteinler, jel boyunca çapraz bir çizgi olarak görünür olacaktır. Bu çizginin üzerindeki proteinler artmış bir hidrofobikliğe sahipken, çizginin altındaki proteinler daha hidrofiliktir.BN kuzey bürünmesi, belirli bir tRNA'nın yalnızca belirli bir komplekste mevcut olduğunu gösterir. Kütle spektrometrik analizi, bu kompleksin esas olarak BN kuzey blotlaması tarafından bulunan tRNA bağlanma aktivitesini doğrulayan tRNA ligazları içerdiğini gösterdi. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa üç gün içinde yapılabilir.Bu prosedürü denerken, kütle spektrometrik analizini engelleyecek karoten kontaminasyonunu en aza indirmek için eldiven ve laboratuvar önlüğü giymeyi unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, karmaşık aktivite ve inhibisyon çalışmaları gibi ek soruları yanıtlamak için toplanan floem özü ile zimogramlar ve enzim testleri gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, bitki bilimi alanındaki araştırmacıların, farklı bitki türlerinden floem örneklerinde çok alt birimli kompleksleri keşfetmelerinin yolunu açtı.Bu videoyu izledikten sonra, Brassica napus bitkilerinden floem özsuyunun nasıl izole edileceğini ve protein proteini ve protein nükleik asit komplekslerinin nasıl izole edileceğini ve analiz edileceğini iyi anlamış olmalısınız. SDS, akrilamid ve TMET ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman eldiven ve laboratuvar önlüğü ile kapüşon altında çalışmak gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.

phloem-sap-sampling-from-brassica-napus-for-3d-page-protein

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Mekansal özel Fitokrom yanıtlar moleküler temeli, doku ve organ spesifik Fitokrom eksiklikleri gösteren transgenik bitkiler kullanılarak araştırılmaktadır. Belirli hücrelerin izolasyonu mikroarray analizleri takip Sıralama mekansal özel Fitokrom yanıtları yer genleri tanımlamak için kullanılmaktadır Floresan-Aktif Hücre tarafından uyarılan Fitokrom kromofor tükenmesi sergiliyor.

Hücre tipi Özgül gösterilmeden FACS yardımlı kullanarak Doku ve Organ spesifik Fitokrom Yanıtları incelenmesi Arabidopsis thaliana</em

Biz bitki protein-protein etkileşimleri test etmek için bir teknik geliştirdik. Sarı floresan protein (YFP) örtüşmeyen iki parça halinde bölünmüş durumda. Her parçası füzyon proteinleri ifade sağlayan, Gateway sistemi üzerinden ilgi bir gen-frame klonlanmış. YFP sinyal Sulandırma sadece tahkikat proteinler etkileşime girdiğinde oluşur.

Ağ Geçidi Uyumlu Bimoleküler Floresan tamamlama (BiFC) kullanarak Bitki Protein Etkileşimleri Tespiti

Burada bitki protein komplekslerinin saflaştırılması ve karakterizasyonu için bir protokol açıklar. Biz bir kompleks içinde bir tek proteini imüno tarafından, bu yüzden onun translasyon sonrası modifikasyonlar ve etkileşim ortakları belirlemek olduğunu göstermektedir.

Plant protein kompleksleri, çevirim sonrası değişikliklerin belirlenmesi

Tarif edilen karşılaştırmalı nicel proteomik yaklaşım, farklı koşullar altında multiprotein komplekslerinin bileşimi içine bir bakış açısı elde etmeyi amaçlamaktadır ve genetik olarak farklı suşların karşılaştırılması ile gösterilmiştir. Kantitatif analiz için bir sükroz yoğunluk gradyanı farklı fraksiyonların eşit hacimleri kütle spektrometresi ile analiz edilir ve karıştırılır.

Multiprotein kompleksleri Karşılaştırmalı Analizi için Yeni Bir Yaklaşım dayanarak<sup&gt; 15</sup&gt; N Metabolik Etiketleme ve Kantitatif Kütle Spektrometre

Floem sap bileşimi yanı sıra yükleme ve uzun mesafe taşıma mekanizmasının Bilgi bitki gelişimi ve stres / patojen yanıt olarak ve ulaşım asimile uzun mesafe sinyal anlaşılması için gereklidir. Bu el yazması EDTA-kolaylaştırdı yöntemi kullanılarak floem eksuda toplanması açıklar.

Toplanması ve analizi<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Floem EDTA-kolaylaştırdı Yöntemi eksuda

Hedeflenen protein yıkımı, hücre fonksiyonu için önemli bir düzenleyici mekanizmasını temsil eder. Daha sonra, 26S proteazomu için moleküler "etiketleri" hizmet hedef proteine ​​bağlanan bir Poliübikütin zincirleri korunmuş ubikitin-proteazom süreci yoluyla gerçekleşir. Burada, proteinlerin proteozomal indirgenmesi için basit ve güvenilir bir hücre içermeyen tahlili tarif eder.

Bitkilerde bir Cell-serbest Sistemde proteozomal indirgenme Assaying

Bu protokol, model örnek olarak Fransız fasulye bitkileri (Phaseolus vulgaris) kullanılarak bitki yapraklarından apoplast yıkama sıvısının optimize edilmiş ekstraksiyonunu detaylandırır.

Tesisinden Akışkan apoplastik çıkarımı için infiltrasyonu-santrifüj Tekniği Kullanarak bırakır Phaseolus vulgaris Bir örnek olarak

Burada, Arabidopsis thaliana yaprak mezofil protoplastlarına uygulanan bir etkileşimli yakalama protokolünü sunuyoruz. Bu yöntem kritik olarak in vivo UV çapraz bağlanmaya dayanır ve fizyolojik bir ortamdan bitki mRNA'ya bağlanan proteinlerin izole edilmesine ve tanımlanmasına izin verir.

Bitki Protoplastlarından mRNA İnteraktom Yakalama

Protein-protein ve protein-metaboliti etkileşimler tüm hücresel fonksiyonları için önemlidir. Burada, biz seçim bir protein ile bu etkileşimlerin paralel analiz sağlayan bir protokol tanımlamak. Bizim iletişim kuralı bitki hücre kültürleri için optimize edildi ve benzeşme arıtma kütle spektrometresi tabanlı protein ve metaboliti algılama ile birleştirir.

2 in 1: tek adımlı benzeşme arıtma paralel analizi için Protein-Protein ve Protein-metaboliti kompleksleri

Burada sunulan fosfoproteomik bir yaklaşımdır, yani arabidopsis fosfoproteomun yüksek verimli ve derin kapsamasını sağlayan dur ve git ekstraksiyon ucu bazlı fosfoproteomik. Bu yaklaşım Arabidopsis'te ozmotik stres sinyaline genel bakışı tanımlamaktedir.

Arabidopsis'te Osmotik Stres Sinyali Profili Çıkarmak için Fosfoproteomik Strateji

Mevcut protokol, Plasmodiophora brassicae tarafından indüklenen safra kesesi histolojik gözlemi için optimize edilmiş bir yöntemi tanımlamaktadır. Hipokotillerin vibratom kesitleri, hastalığın ilerlemesi sırasında transkripsiyon faktörlerinin ve fitohormonların tutulumunu incelemek için floresan görüntülemeden önce temizlenir. Bu protokol, reçine gömme sınırlamalarının üstesinden gelerek floresan proteinlerinin planta görselleştirmesini sağlar.

Gen İfadesindeki Değişiklikleri ve Plasmodiophora brassicae'ye Fizyolojik Yanıtları Görselleştirmek için Temizleme ve Floresan Mikroskopisinin Birleştirilmesi

Öğrenin Brassica napus floem özsuyundan protein ve ribonükleoprotein komplekslerini izole etmek ve analiz etmek için 3D-PAGE yöntemini. Bu protokol bitki biyokimyası ve uzun mesafe sinyalleşme çalışmalarında yüksek çözünürlüklü ayrıştırma sağlar.

Phloem Sap örnekleme gelen Brassica napus 3D-sayfa Protein ve Ribonükleoprotein kompleksleri için

Daha fazla video keşfet