Bimolecular tamamlayıcı benzeşme arıtma (BiCAP) tarafından parçalanmış çok protein sinyal kompleksleri

Bu yöntem, hücre biyolojisi ve biyokimyasındaki, protein ve protein komplekslerinin dinamik montajının sinyal yollarını ve hücre davranışını nasıl kontrol ettiği gibi temel soruları yanıtlamamıza yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, kompleks olmayan bireysel proteinleri ve rakip bağlanma ortaklarını hariç tutarken, etkileşen iki proteini spesifik olarak izole edebilmemizdir. Bu yöntemi meme kanserinde reseptif tirozin kinaz dimerizasyonu hakkında bilgi vermek için kullanmamıza rağmen, başka herhangi bir fizyolojik ortama veya hastalığa da uygulanabilir.

Bu yöntem için ilk olarak, GFP nano gövdesinin GFP ve diğer floresan proteinlerin üç boyutlu epitopunu tanıdığını fark ettiğimizde bir fikrimiz vardı. Başlamak için, 0.2 mililitrelik bir tüpe 150 nanogram giriş vektörü, 150 nanogram hedef vektör ve sekiz mikrolitre TE tamponu ekleyin. Daha sonra iki mikrolitre rekombinaz ve ZiMex ekleyin ve ikisini kısaca santrifüjleyin.

Reaksiyonu oda sıcaklığında bir saat inkübe edin, ardından bir mikrolitre Proteinaz K çözeltisi ekleyin ve reaksiyonu durdurmak için 37 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin. Ardından, ısı şokuna yetkin hücreleri buz üzerinde çözün. Ve 50 mikrolitre hücreyi 14 mililitrelik yuvarlak tabanlı bir polipropilen tüpe aktarın.

Hücrelere bir mikrolitre reaksiyon ürünü ekleyin ve hafifçe karıştırın. Hücreleri buz üzerinde 20 dakika inkübe edin. Daha sonra, hücreleri buza geri döndürmeden önce 42 santigrat derece su banyosunda 45 saniye boyunca hücreleri ısıtın.

Hücrelere bir mililitre LB ortamı ekleyin. Ve numuneyi 37 santigrat derecede bir saat çalkalayarak inkübe edin. Daha sonra, dönüşümü ampisilin içeren 10 santimetrelik bir agar plakasına yerleştirin ve gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Plazmid saflaştırmasına başlamak için, büyük bir erlene ampisilin ve 100 mililitre LB ortamı ekleyin. Ardından, agar plakasından tek bir koloniyi çıkarmak için bir aşılama halkası kullanın. Aşılama döngüsünü LB ortamına batırın ve kısa bir süre karıştırın, ardından şişenin üstünü alüminyum folyo ile örtün ve gece boyunca 37 santigrat derecede çalkalanarak inkübe edin.

Buradan, transfeksiyona devam etmeden önce standart bir Maxiprep plazmit DNA saflaştırma kiti kullanarak plazmit DNA'yı saflaştırın. İlk olarak, 10 mililitre DMEM içeren 10 santimetrelik tabaklarda HEK 293T hücrelerini tohumlayın. Daha sonra her bir bimoleküler floresan tamamlama vektörünün 2.5 mikrogramını 500 mikrolitre transfeksiyon tamponu içinde seyreltin.

10 mikrolitre transfeksiyon reaktifi ekleyin ve karışımı 10 saniye boyunca girdaplayın. Daha sonra numuneleri kısaca santrifüjleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Daha sonra DNA transfeksiyon karışımını tabağa damla damla ekleyin.

Daha sonra numuneleri sekiz ila 24 saat inkübe edin. Metin protokolünde belirtildiği gibi bir hücre lizis tamponu ve takviye edilmiş hücre lizis tamponu hazırlayın. Ardından hücreleri buz gibi soğuk PBS ile iki kez yıkayın.

PBS'yi aspire edin ve bir milimetre buz gibi soğuk takviyeli hücre lizis tamponu ekleyin. Sonra, çanağı buzun üzerine yerleştirin ve beş dakika inkübe edin. Daha sonra hücreleri çıkarmak için bir hücre kazıyıcı kullanın ve bunları soğutulmuş bir mikro santrifüj tüpüne aktarın.

Hücresel kalıntıları gidermek için tüpü dört santigrat derecede beş dakika boyunca yerçekiminin 18.000 katında santrifüjleyin, ardından berrak süpernatanı yeni bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Uygun hacimde agaroz boncuklarını bir mililitre PBS'de yıkayın, ardından boncukları 300 kez yerçekiminde santrifüjleyin ve süpernatanı dikkatlice çıkarın. Daha sonra her numuneye 20 mikrolitre agaroz boncuk ekleyin.

Ve uçtan uca rotasyonla iki saat boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Boncukları yerçekiminin 300 katı sıcaklıkta santrifüjleyin ve hücre lizis tamponunda üç kez yıkayın. Daha sonra yıkanmış boncukları 50 mikrolitre seyreltilmiş numune tamponunda yeniden süspanse edin.

Son olarak, numuneleri 95 santigrat derecede iki ila üç dakika ısıtın. Bu çalışmada, BiCAP yöntemi, HEK293T hücrelerinin birlikte transfeksiyonundan yaklaşık 16 saat sonra çeşitli protein tipleri için pozitif bir etkileşimi gözlemlemek için kullanılmıştır. Konfokal mikroskopi, plazma zarındaki RTKERBB2 dimerizasyonunu ve Ubiquitin'in E3 ligaz UBR5'e bağlanmasını gözlemlemek için kullanılır.

GFB nanobody ile afinite saflaştırmasından sonra, ko-transfeksiyon örneğinde sadece tam uzunlukta Venüs kontrol proteini ve etkileşimli V1 ve V2 etiketli proteinler tespit edilebilir. Bu prosedürü denerken, bi-moleküler floresan tamamlama etiketinin yerleşimini ve ilgilendiğiniz proteinin C-terminali veya N-terminal ucunu optimize etmeyi unutmayın. Bu, pozitif bir protein/protein etkileşimini gözlemlemek için gereklidir.

Bu videoyu izledikten sonra, BiCAP tekniğini nasıl uygulayacağınızı ve ilgilendiğiniz protein etkileşimine nasıl uygulayacağınızı iyi anlamış olmalısınız. Bu prosedürü takiben, transkripsiyon faktörlerinin dimerizasyonunun DNA bağlanmasını nasıl kontrol ettiği gibi ek soruları yanıtlamak için ChIPseek gibi aşağı akış karakterizasyon tekniklerinin çoğu kullanılabilir.