Name: İlk - ve geç-aşamalarında Organ oluşumu kuş modelindeki keşfetmek için iki adımlı yaklaşım: timus ve paratiroid bezleri Organogenesis paradigma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 43 s
Description: Keşfedin, kuş modelinde timus ve paratiroid bezlerinin organ oluşumunu in vitro ve in ovo teknikleriyle araştırmak için iki adımlı yaklaşım. Bu yöntem erken ve geç aşamaları detaylı incelemeye olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar António Cidadão, Isabel Alcobia ve Leonor Parreira Padma Akkapeddi video anlatım için için el yazması eleştirel okuma için minnettarız ve Instituto de Histologia e Histoloji hizmetinden Vitor Proa için Biologia yapın Desenvolvimento, Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa, teknik destek için. Unidade de audiovisuais (görsel-işitsel birimi), Faculdade de Paulo Caeiro ve Hugo Silva için özellikle borçlu olduğumuzu Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa olağanüstü bağlılıklarını bu video üretimi için. Lütfen Interaves ve video sistemi ile donatılmış bir stereoscope sağlamak için Leica Microsystems anıyoruz - Sociedade Agro-Pecuária, S.A bıldırcın ile katkıda bulunmak için yumurta döllenmiş. Bu eser Faculdade de tarafından desteklenen Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa (FMUL).

Bu deneylerin hayvan bakımı ve Centro Académico de Medicina de etik kuralları izleyin Lisboa.
1. döllenmiş bıldırcın ve tavuk yumurtası kuluçka
<ol><li>Japon bıldırcın (Coturnix coturnix japonica) ve tavuk (Gallus gallus) döllenmiş yumurta 3 ve 8 gün boyunca sırasıyla kuluçkaya.<ol>
<li>Hava yukarı bakacak şekilde 38 ° C'de oksijen bir kuluçka odası (yumurta künt son) ile yumurta yer</li>
		<li>Yaklaşık 20 bıldırcın yumurtası ve 40 tavuk yumurtası bu deney yapmak için kullanın. Not: Bu rakamlar bu yordamı ilk kez kurarken iki katına.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. izolasyon timik ve paratiroid esaslar meşru topraklarının içeren bıldırcın embriyonik bölgesi
Not: yumurta gerçekleştirmek işleme yordamları steril koşullarda yatay laminar akış kukuIeta ve sterilize edilmiş aletler ve malzemeler kullanarak.
<ol><li>Hakkında büyük borosilikat cam kase hazırlamak 3/4 soğuk fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) çözüm ile dolu.</li>
	<li>Bıldırcın yumurta kabuğu dokunarak ve dairesel bir açılış künt sonuna karşı tarafta eğri makasla kesme kuluçka 3 gün sonra açın. Dikkatle ve soğuk PBS ile dolu cam kase için embriyo transfer kabuk parçaları çıkarın.</li>
	<li>Bıldırcın (q) embriyo E3'te tutun (qE3) (HH-sahne alanı'na 21 tavuk karşılık gelen bıldırcın sahne) ince forseps yardımıyla. Bir kesim eğri makas kullanarak sarısı Zarflama vitelline membran olun. Çevresinde ve harici ekstra embriyonik damarları çevresi kesmeye devam.</li>
	<li>Transfer embriyo için küçük bir kase yaklaşık 3/4 ince forseps yardımıyla soğuk PBS ile dolu. Embriyo üzerinden kalan ekli sarısı iyice yıkayın.</li>
	<li>100 mm cam Petri kabına siyah temel ile embriyo transfer için bir kepçe kullanın (bkz. Tablo reçetesi) 10 mL soğuk PBS içeren.</li>
	<li>Bir stereomicroscope altında Petri kabına yerleştirin. Not: Şu andan itibaren ilerici büyütme için bir stereomicroscope altında mikrocerrahi yordamları gerçekleştirin. Bir ışık kaynağı olarak LED ışıklar sınırlı ısı yükü dikkate alınarak stereomicroscope veya optik lifler dahil kullanmak için tavsiye edilir.</li>
	<li>Embriyo alt kısmında ince böcek pimleri ile plaka için basılı tutun. Ekstra embriyonik bölgesinde bir kare şekli oluşturan dört iğne yerleştirin.</li>
	<li>Sefalik bölge ekstra embriyonik zarı ince forseps yardımıyla çıkarın ve beşinci bir PIN oraya yerleştirin. Not: embriyo doğru konumlandırdıysanız, sonra ve vezikül, kalbini tüp ve 1st, 2ndve 3rd faringeal kemerler (PAs) görünür olmalıdır.</li>
	<li>Wecker göz makas kullanarak embriyonik bölgenin ilgi, yani,rd 3 ve 4th faringeal kemer bölgesi (3/4PAR), incelemek.<ol>
<li>Somite/nöral tüp ve PAs arasındaki embriyo eksenine boyuna ve paralel kesme başlatın.</li>
		<li>Ventrally konumlandırılmış kalbini tüp kesim tarafından kaldırın. Makas aynı konumda tutmak, Petri kabına embriyo kesme yönüne göre yeniden konumlandırmak için döndürün.</li>
		<li>2nd ve 3rd PAs arasında ve 4th PA aşağıda kesmek</li>
		<li>3/4PAR ince forseps yardımıyla üzerinden kalan membranlar bağlantısını kesin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>İzole doku (3/4PAR) ve onlara bir cam tabak 3/4 2 mL steril plastik pipet kullanarak soğuk PBS ile dolu transfer Aspire edin. Not: Bundan sonra dokular yetişkin vitro -ebilmek var olmak ilâ 48 s veya hemen bir tavuk embriyo E8, CAM üzerine aşılı.</li>
	<li>İzole 3/4PAR buzda vitro tahlil hazırlanması sırasında içeren cam çanak tutmak.</li>
</ol>3. Vitro Organotypic tahlil: timik ve paratiroid esaslar meşru topraklarının içeren embriyonik bölgesinin kültürü
<ol><li>RPMI-%1640 10 FBS ve % 1 penisilin/streptomisin ile desteklenmiş orta ile kültür ortamı hazırlamak. Not:-Ebilmek üstelemek çözünür farmakolojik reaktifler ortamına (örneğin, LY-411.575 (Ly) ve di-benzazepine veya cyclopamine ve vismodegib, çentik ve yollar, sırasıyla sinyal Kirpi (Hh) inhibe. Bu tahlil 4PAR. cyclopamine 20 µM veya kullanın vismodegib 10 µM Hh 3/4PAR5' te sinyal etkisizleştirmek için / Ly 50-200 nM veya Di-benzazepine 5-15 µM çentik 3'te sinyal etkisizleştirmek için kullanın.</li>
	<li>3/4PP explant 6-şey plaka vitro kültürü hazırlayın.<ol>
<li>6-şey plaka bir kuyudan kültür orta 5 mL ile doldurulması. 24 mm Polikarbonat membran Ekle yerleştirin (bkz. Tablo reçetesi) üzerine ince forseps yardımıyla iyi.</li>
		<li>Stereomicroscope altında 3/4PAR explant cam yemek membran yüzeyine bir nakli kaşık (veya spatula) yardımı ile nazikçe kaydırarak aktarmak ve ince forseps. Explants ventral tarafı yukarı ve dorsal tarafta membran temas yerleştirin. Yedi explants membran Ekle başına ekleyin. 3.4 adıma geçin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Alternatif olarak, kültür membran filtreleri yüzen explants.<ol>
<li>35 mm ile 5 mL kültür ortamının Petri kabına hazırlayın. İnce forseps, bir membran ( Tablo malzemelerigörmek) filtre ve hava ile temas halinde bir kuru yüzey tutun kayan nokta yardımıyla.</li>
		<li>Stereomicroscope altında 3/4PAR explant cam yemek membran filtre için nazik bir nakli kaşık (veya spatula) yardımı ile kaydırarak aktarmak ve ince forseps. Explants ventral tarafı yukarı ve dorsal tarafta membran temas yerleştirin. Membran filtre başına 8 adete kadar explants ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dikkatlice adımları 3.2 ve %3.3 5 CO237 ° C'de oksijen bir kuluçka hazırlanan explants koyun.</li>
	<li>48 h kuluçka süresinden sonra 6-şey plaka ve 35 mm Petri kabına kuluçka makinesi kaldırın.<ol>
<li>Kültürlü explants gelen 6-şey plaka membran Ekle toplamak.<ol>
<li>PBS oda sıcaklığında (RT) membran Ekle'nin üzerine ekleyin.</li>
			<li>Explants membran gelen güçlü bir 2 mL steril plastik pipet kullanarak temizlenerek bağlantısını kesin.</li>
			<li>Spatula ve ince forseps yardımıyla, kültürlü explants RT. adlı PBS ile dolu bir cam tabak 3/4 için transfer</li>
		</ol>
</li>
		<li>Benzer şekilde, kültürlü explants 35 mm Petri kabına kayan membran filtre toplamak.<ol>
<li>Membran filtre yeni 35 mm Petri kabına PBS RT., dolu ince forseps ile aktarmak</li>
			<li>Explants membran filtre üzerinden dinç pipetting 2 mL steril plastik pipet kullanarak bağlantısını kesin.</li>
			<li>Hiçbir explants kaldı teyit ona bağlı sonra ince forseps yardımıyla, explant-Alerjik membran filtre taburcu et.</li>
			<li>Bir spatula ve ince forseps ile explants RT. adlı PBS ile dolu bir cam tabak transfer</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kültürlü explants bir reaktif toplam RNA izolasyonu için 1 ml bir spatula ile transfer edecek ve gen ekspresyonu çalışmaları için. Uyarı: Bu reaktif maruz ( Tablo malzemelerigörmek) bir ciddi sağlık tehlikesi olabilir. Uygun koruyucu gözlük, giyim ve eldiven giymek. İşleme yönergeleri izleyin ve üretici tarafından sağlanan güvenlik bilgi formları okuyun.</li>
	<li>Alternatif olarak, tavuk bebekleri E8, CAM üzerine kültürlü doku grefti. Adım 4'e izleyin.</li>
</ol>4. CAM hazırlanması
<ol><li>8 gün embriyonik gelişim ile tavuk yumurtası kuluçka makinesi kaldırın. Not: Yumurta hava odası 38 ° C oksijen kuluçka, yukarı doğru bakan ile inkübe.</li>
	<li>Yumurta kabuğu parçaları hava odanın içine düşmesini önlemek için şeffaf plastik bant ile künt sonu kapak. Kabuk dokunun ve yumurta dairesel bir açılış eğri makasla kesme. Hava odası görünür olmalıdır.</li>
	<li>Dikkatli bir şekilde hava odası Beyaz zar ince forseps ile kaldırın. CAM sonra görünür ve ektopik doku nakli için erişilebilir. Not: PBS kayar ve explants saklanmalıdır PBS teşvik beri CAM, önce veya sonra nakli, hidrat için kullanmayın. Membran kurur, yumurta atmak.</li>
</ol>5. CAM üzerine kültürlü Explants ve aşılama
<ol><li>Küçük vasküler lezyonlar/yaralar cam bir tutucu bir microscalpel ile daha küçük damarları oluşturun. Not: Pasteur pipet ucu aşırı kanama durumunda capillarity tarafından kan kaldırmak için kullanın.</li>
	<li>Bir spatula ve ince forseps kültürlü explant CAM yaralı bölgeye aktarmak için kullanın.</li>
	<li>Bir filtre kağıt explant biraz daha geniş keser ve explant üst kısmında yerleştirir. Not: Filtre kağıdı gelişimi cam sonra explant konum izleme yardımcı olur. Gerekirse explant için günlük ilaç dağıtım ovo içinde geliştirme sırasında Ayrıca, sağlar (5.6 adımda anlatılan).</li>
	<li>Şeffaf plastik bant ile yumurta penceresini kapatın ve kömür kalem kullanarak tanımlar. Not: Plastik bant dehidratasyon kuluçka dönemi sırasında embriyo korur.</li>
	<li>Oksijen kuluçka 38 ° C'de 10 gün boyunca işlenmiş yumurta kuluçkaya Adım 6 izleyin.</li>
	<li>İsteğe bağlı adım: Kuluçka dönemi günlük ilaç idaresi.<ol>
<li>Filtre erişmek için kısmen plastik bandı kaldırın. Uyuşturucu çözüm, kağıdın üstüne damla damla, 100 µL ekleyin. Pencerenin yeniden mühürle ve yumurtayı geri oksijen kuluçka makinesi 38 ° C'de yer Not: Bu tahlil için Hh ovo içinde geliştirme5sırasında sinyal cyclopamine 20 µM doz yapılmasını engeller.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. ektopik Organ oluşumu CAM Ovo içinde gelişimi 10 gün sonra
<ol><li>10 günden, kuluçka yumurta kuluçka makinesi kaldır ve dikkatle plastik bant tutar.</li>
	<li>Eğri makas ve transfer CAM elde edilen explant küçük bir bardak için filtre kağıdı ile yaklaşık 3/4 soğuk PBS ile dolu kase kullanarak filtre bölgenin etrafında CAM kesti.</li>
	<li>İnce forseps yardımıyla CAM elde edilen explant siyah Bankası PBS 10 mL içeren bir 100 mm Petri kabına aktarın. Filtre kağıdı ve membran Wecker göz makas ve ince forseps kullanarak fazlalığı yavaşça çıkarın.</li>
	<li>CAM explant sabitleştirici eriyik-e doğru nakletmek (% 3.7 PBS PFA) bir kepçe ile. Tavuk bebekleri embriyo boyun bölgesinde büyük makas yardımıyla kesin bir kesim yaparak yumurtadan kaldırmadan ötenazi.</li>
	<li>Organ oluşumu CAM elde edilen explants bölümlerini parafin geleneksel Histoloji ve immünhistokimya tarafından değerlendirmek.</li>
</ol>

<ol><li>Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Nogent+Institute-50+years+of+embryology%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The Nogent Institute-50 years of embryology.</a> Int J Dev Biol. 49 (2-3), 85-103 (2005).</li>
<li>Chuong, C. M., Wu, P., Plikus, M., Jiang, T. X., Bruce Widelitz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+stem+cells+into+organs%3A+topobiological+transformations+demonstrated+by+beak%2C+feather%2C+and+other+ectodermal+organ+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Engineering stem cells into organs: topobiological transformations demonstrated by beak, feather, and other ectodermal organ morphogenesis.</a> Curr Top Dev Biol. 72, 237-274 (2006).</li>
<li>Davey, M. G., Tickle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chicken+as+a+model+for+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenet+Genome+Res%22%5BJournal%5D)">The chicken as a model for embryonic development.</a> Cytogenet Genome Res. 117 (1-4), 231-239 (2007).</li>
<li>Nowak-Sliwinska, P., Segura, T., Iruela-Arispe, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chicken+chorioallantoic+membrane+model+in+biology%2C+medicine+and+bioengineering%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering.</a> Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).</li>
<li>Figueiredo, M., Silva, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+and+Hedgehog+in+the+thymus%2Fparathyroid+common+primordium%3A+Crosstalk+in+organ+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Notch and Hedgehog in the thymus/parathyroid common primordium: Crosstalk in organ formation.</a> Dev Biol. 418 (2), 268-282 (2016).</li>
<li>National Research Council. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+6+-+Recent+Advances+in+Developmental+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Frontiers+in+Developmental+Toxicology+and+Risk+Assessment%22%5BJournal%5D)">Chapter 6 - Recent Advances in Developmental Biology.</a> Scientific Frontiers in Developmental Toxicology and Risk Assessment. , The National Academies Press. Washington, DC. (2000).</li>
<li>Moura, R. S., Coutinho-Borges, J. P., Pacheco, A. P., Damota, P. O., Correia-Pinto, J. <a target="_blank" href="http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0017660">FGF signalling pathway in the developing chick lung: expression and inhibition studies.</a> PLoS One. 6 (3), e17660(2011).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Morphol%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> J. Morphol. 88, 49-92 (1951).</li>
<li>Takahashi, Y., Bontoux, M., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelio-mesenchymal+interactions+are+critical+for+Quox+7+expression+and+membrane+bone+differentiation+in+the+neural+crest+derived+mandibular+mesenchyme%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Epithelio-mesenchymal interactions are critical for Quox 7 expression and membrane bone differentiation in the neural crest derived mandibular mesenchyme.</a> EMBO J. 10 (9), 2387-2393 (1991).</li>
<li>Maeda, Y., Noda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+development+of+embryonic+long+bone+on+chorioallantoic+membrane+in+ovo+prevents+perichondrium-derived+suppressive+signals+against+cartilage+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Coordinated development of embryonic long bone on chorioallantoic membrane in ovo prevents perichondrium-derived suppressive signals against cartilage growth.</a> Bone. 32 (1), 27-34 (2003).</li>
<li>Ishida, K., Mitsui, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+bioengineered+feather+buds+on+a+reconstructed+chick+skin+from+dissociated+epithelial+and+mesenchymal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Generation of bioengineered feather buds on a reconstructed chick skin from dissociated epithelial and mesenchymal cells.</a> Dev Growth Differ. 58 (3), 303-314 (2016).</li>
<li>Le Douarin, N. M., Jotereau, F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/239088">Tracing of cells of the avian thymus trough embryonic life in interspecific chimeras.</a> J. Exp. Med. 142, 17-40 (1975).</li>
<li>Farley, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+thymus+organogenesis+and+colonization+in+early+human+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Dynamics of thymus organogenesis and colonization in early human development.</a> Development. 140, 2015-2026 (2013).</li>
<li>Gordon, J., Bennett, A. R., Blackburn, C. C., Manley, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gcm2+and+Foxn1+mark+early+parathyroid-+and+thymus-specific+domains+in+the+developing+third+pharyngeal+pouch%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Gcm2 and Foxn1 mark early parathyroid- and thymus-specific domains in the developing third pharyngeal pouch.</a> Mech Dev. 103, 141-143 (2001).</li>
<li>Neves, H., Dupin, E., Parreira, L., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+Bmp4+signalling+in+the+epithelial-mesenchymal+interactions+that+take+place+in+early+thymus+and+parathyroid+development+in+avian+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Modulation of Bmp4 signalling in the epithelial-mesenchymal interactions that take place in early thymus and parathyroid development in avian embryos.</a> Dev Biol. 361 (2), 208-219 (2012).</li>
<li>Jerome, L. A., Papaioannou, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DiGeorge+syndrome+phenotype+in+mice+mutant+for+the+T-box+gene%2C+Tbx1%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">DiGeorge syndrome phenotype in mice mutant for the T-box gene, Tbx1.</a> Nat Genet. 27 (3), 286-291 (2001).</li>
<li>Nie, X., Brown, C. B., Wang, Q., Jiao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+Bmp4+from+the+Tbx1+expression+domain+causes+abnormal+pharyngeal+arch+artery+and+cardiac+outflow+tract+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cells+Tissues+Organs%22%5BJournal%5D)">Inactivation of Bmp4 from the Tbx1 expression domain causes abnormal pharyngeal arch artery and cardiac outflow tract remodeling.</a> Cells Tissues Organs. 193 (6), 393-403 (2011).</li>
<li>Zou, D., Silvius, D., Davenport, J., Grifone, R., Maire, P., Xu, P. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+of+the+third+pharyngeal+pouch+into+thymus%2Fparathyroid+by+Six+and+Eya1%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Patterning of the third pharyngeal pouch into thymus/parathyroid by Six and Eya1.</a> Dev Biol. 293 (2), 499-512 (2006).</li>
<li>Uematsu, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+in+ovo.+chorioallantoic+membrane+engraftment+to+culture+testes+from+neonatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Med%22%5BJournal%5D)">Use of in ovo. chorioallantoic membrane engraftment to culture testes from neonatal mice.</a> Comp Med. 64 (4), 264-269 (2014).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu yöntemin başarısı için çok önemli bir yönü kalitesidir tavuk ve Bıldırcın yumurta. Göz önüne alarak uzun bir kuluçka dönemlerde, özellikle içinde ovo tahlil, kaliteli tavuk yumurta geliştirir canlılığı yordamının sonuna (%90) oranları. Bunu başarmak için yumurta farklı tedarikçilerden sınayın. Uzun süre unmanipulated yumurtaları kuluçkaya (ilâ 16-17 gün) ve gelişimlerini kontrol edin. Kaliteli toplu değerlendirilmesi için embriyo % 80'den fazla normal gelişim mevcut olmalıdır. Her kuluçka adım güvenilir güven...

Kuş embriyo seminal gelişim biyolojisi çalışmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Kuş modelinin başlıca avantajları açmak için yumurta, embriyo ve embriyolardan gerçekleştirmesini nispeten kolay erişim imkanı bulunmaktadır. Bazı örnekler hücre kader1, uygulama2embriyo için belirli büyüme faktörlerinin ve CAM1,3ektopik hücresel yapılar büyüme çalışmak için klasik bıldırcın-tavuk chimera sistemi oluşturan, 4.
Organ oluşumu farklı aşamalarında yeni görüşler elde etmek için biz son zamanlarda embriyonik dokular5 vitro manipülasyon ile aşılama teknikleri birleştiren bir yöntem geliştirdik. Ayrımcılık ve keşif, her iki erken - ve geç-sık sık son derece dinamik ve karmaşık doku etkileşimleri2nedeniyle sınırlı dönemlerinde organogenesis, iki aşamalı yaklaşım sağlar. Ayrıca, uygun doku özgü işaretleri eksikliği sık genetik olarak değiştirilmiş kısıtlar hayvan modelleri6. Bu roman yöntemi iki aşamalı yaklaşım, büyük ölçüde bu tür sınırlamalar üstesinden gelir.
Erken aşamalarında organ oluşumu, ilk adım, eğitim için potansiyel organ rudiment oluşan bıldırcın embriyonik bölge izole ve 48 h bir vitro organotypic sisteminde büyüdü. Bu dönemde belirli sinyal yollar farmakolojik modülasyon kültür orta5,7' ye uyuşturucu ekleyerek gerçekleştirilir. Ayrıca, kültürlü doku vitro büyüme herhangi bir aşamada toplanan olabilir ve gen-ifade için probed (qPCR, microarrays, vbgibi yöntemleri kullanarak).
İkinci adımda, 48 h kültürlü dokulara sonra tavuk (c) embriyo (cE8) embriyonik gün (E) 8, CAM aşılı (Hamburger ve Hamilton (HH)-33-35 aşamalarında)8. CAM besin vasküler bir tedarikçi olarak davranır ve onun geliştirme ovo içinde daha uzun süreler için etkinleştirme aşılı dokulara gaz alışverişi1,3,4 sağlar. Tam biçimli organları içinde ovo geliştirme5,9,10,11 10 gün sonra elde edilebilir gibi bu deneysel adım özellikle de geç-aşamaları organogenesis, çalışmaya uygun . Morfolojik analiz kolayca uygun organ oluşumu onaylamak için geleneksel Histoloji tarafından gerçekleştirilir ve donör kökenli hücre species-specific antikorlar (yani, MAb bıldırcın Perinükleer (QCPN)) kullanarak immünhistokimya tarafından belirlenebilir. CAM kuluçka döneminde Greftler Ayrıca huzurunda farmakolojik ajanlar yetiştirilen ve herhangi bir organogenesis ilerlemesini değerlendirmek için geliştirme aşamasında toplanan.
Burada ayrıntılı olarak açıklanan iki aşamalı yaklaşım zaten Figueiredo vd. istihdam kuş paratiroid/timus ortak primordium geliştirme keşfetmek için 5 . Buna göre embriyonik topraklarının doğal özellikleri ve timus ve paratiroid bezleri içinde organogenesis ilgili gelişme aşamalarında aşağıda sunulacak.
Timus ve paratiroid bezleri epiteli, işlevsel olarak farklı olsa da, faringeal torbalar endoderm (PP)12türetmek. İçinde kuş, bu organların epiteli üçüncü ve dördüncü PP endoderm (3/4PP)12den, memelilerde timik epitel 3PP türeyen ve paratiroid bezleri epitel elde etmek 3PP ve 3/4PP fare ve insan kaynaklı, sırasıyla13,14.
Bu organların oluşumu en erken aşamalarında biridir ayrı timus ve paratiroid etki alanlarında ortak primordium ortaya çıkması. Tavuk, bu etki alanları, E4.515belirli moleküler imleçli in situ hibridizasyon tarafından belirlenebilir. Geliştirme devam ettikçe, bu organ esaslar kişiselleştirmek ve nöral crest kaynaklı hücreler tarafından ince bir mezenkimal kapsül (E5; onları çevreleyen iken yutak ayrı HH-stage 27). Daha sonra timik epitel (E6.5; hematopoetik progenitör hücreler tarafından kolonize HH-stage 30)12.
Klasik bıldırcın-tavuk çalışmalar1,12olduğu gibi iki aşamalı yaklaşım hematopoetik/lenfoid organlar, yani timus5oluşumunu incelemek özellikle yararlıdır. Bıldırcın, organ rudiment ile explant olarak aşılı hematopoetik progenitör hücre kolonizasyon önce tavuk embriyo chimeric timus bir bıldırcın timik epitel muadili infiltre tavuk kan yoluyla progenitör hücre ile oluşturulur. Bu yöntem, bu nedenle, kuş hemato/lenfoid sistemi geliştirilmesi hematopoetik hücrelerin katkısını keşfetmek için yararlı bir araçtır.

<table><tbody><tr><td>Tavuk döllenmiş yumurtaları (Gallus gallus)</td><td>Pintobar, Portekiz</td><td></td><td>Tavuk çiftliği&nbsp;</td></tr><tr><td>Bıldırcın döllenmiş yumurtaları (Coturnix coturnix)</td><td>Interaves, Portekiz</td><td></td><td>Kuş çiftliği&nbsp;</td></tr><tr><td>15 mL PP santrifüj tüpleri</td><td>Corning</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>50 mL PP santrifüj tüpleri</td><td>Corning</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>60 x 20 mm ateşe dayanıklı kaplar</td><td>Duran grubu</td><td>21 755 41</td><td></td></tr><tr><td>100 x 20 mm ateşe dayanıklı kaplar</td><td>Duran grubu</td><td>21 755 48</td><td></td></tr><tr><td>Polikarbonat Membran Insert&nbsp;</td><td>Corning</td><td>3412</td><td>24 mm transwell, 0,4 mm Gözenekli Polikarbonat Membran Ek&nbsp;</td></tr><tr><td>Membran filtre</td><td>Millipore DTTP01300</td><td></td><td>0,6 mm İzopor membran filtre</td></tr><tr><td>6 oyuklu kültür plakaları</td><td>Nunc, Thermo Fisher Scientific</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>Petri kabı, 35 x 10 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5112&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Süpermarketten Pyrex kaseler</td><td></td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Transfer pipetleri</td><td>Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific</td><td>2041S</td><td>2 mL plastik pipet</td></tr><tr><td>Cam pastör pipeti</td><td>normax</td><td>5426015</td><td></td></tr><tr><td>Whatman&nbsp; kalitatif filtre kağıdı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA1001090</td><td>Filtre kağıdı</td></tr><tr><td>Süpermarketten şeffaf plastik bant</td><td></td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Sitokeratin (pan; asidik ve bazik, tip I ve II sitokeratinler), klon Lu-5</td><td>BMA Biyomedikaller</td><td>T-1302</td><td></td></tr><tr><td>Siklopamin hidrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4116</td><td>Hh sinyalinin farmakolojik inhibitörü</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>İnvitrojeni, Thermo Fisher Scientific Standart</td><td></td><td>FBS</td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>İnvitrojeni, Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Salin (PBS)</td><td>GIBCO, Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>QCPN antikoru</td><td>Gelişimsel Çalışmalar Hibridoma Bankası</td><td>QCPN</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Orta, GlutaMAX Takviyesi&nbsp;</td><td>GIBCO, Thermo Fisher Scientific</td><td>61870010</td><td></td></tr><tr><td>Bluesil RTV141A/B Silikon Elastomer 1.1Kg Kiti</td><td>ELKEM/Silmid</td><td>RH141001KG</td><td>Petri kabı için arka tabanı hazırlamak için</td></tr><tr><td>Stemolekül LY411575</td><td>Stemgent</td><td>04-0054</td><td>Çentik sinyalleme TRIzol Reaktifinin farmakolojik inhibitörü</td></tr><tr><td></td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td><td>15596026</td><td>Toplam RNA izolasyonu için reaktif</td></tr><tr><td>Dumont #5 Forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11251-30&nbsp;</td><td>İnce forseps</td></tr><tr><td>Ekstra ince Bonn makası, kavisli</td><td>İnce Bilim Araçları</td><td>14085-08</td><td>Kavisli makas</td></tr><tr><td>Böcek iğneleri&nbsp;</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>26001-30</td><td></td></tr><tr><td>Mikro spatula&nbsp;</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>10087-12</td><td>Transplantasyon kaşığı</td></tr><tr><td>Minutien Pimleri</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>26002-20</td><td>Mikro Neşter</td></tr><tr><td>Moria Nikel Kaplama Pim Tutucu</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>26016-12</td><td>Tutucu</td></tr><tr><td>Moria Delikli Kaşık</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>10370-17</td><td>Skimmer</td></tr><tr><td>Wecker Göz Makası</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>15010-11</td><td></td></tr><tr><td>Kamera</td><td>Leica Microsystems&nbsp;</td><td>MC170 HD</td><td></td></tr><tr><td>Stereoskop</td><td>Leica Microsystems&nbsp;</td><td>Leica M80</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Leica Microsystems&nbsp;</td><td>DM2500</td><td></td></tr></tbody></table> Serisi

İlk - ve geç-aşamalarında organ oluşumu kuş modelindeki keşfetmek için iki adımlı yaklaşım: timus ve paratiroid bezleri organogenesis paradigma

Two-step Approach to Explore Early- and Late-stages of Organ Formation in the Avian Model: The Thymus and Parathyroid Glands Organogenesis Paradigm

Kuş embriyo deneysel bir model gelişim biyolojisi seminal buluşlar için son derece önemli olmuştur. Birkaç yaklaşım, bıldırcın-tavuk chimeras oluşumu ve chorioallantoic membran (ektopik doku tarihinden geriye son yüzyılda gelişimi sürdürmek için CAM) kullanımı arasında. Günümüzde, son vitro metodolojileri ile klasik bu tekniklerin birleşimi roman umutları daha fazla organ oluşumu keşfetmek için sunuyor.
Burada ilk - ve geç-aşamalarında organogenesis çalışmaya bir iki adım yaklaşım tarif. Kısaca, embriyonik bölge organ meşru bölge içeren bir organotypic sistemi (en fazla 48 s) içinde bıldırcın embriyo ve yetişkin vitro izole edilmiştir. Kültürlü doku daha sonra tavuk embriyo CAM aşılı. Ovo içinde gelişimi 10 gün sonra tam biçimli organları aşılı dokulardan elde edilir. Bu yöntem aynı zamanda vitro ve ovo içinde gelişimsel adımları boyunca doku genetik manipülasyon ve farmakolojik düzenli yönetim tarafından yolları sinyal modülasyonu sağlar. Ayrıca, onların (kullanarak kantitatif PCR (qPCR), microarrays, vb) gen ekspresyon profili ve Morfoloji (geleneksel Histoloji ve İmmünokimya ile değerlendirildi) çözümlemek için herhangi bir zaman penceresi, dokularda gelişen toplanabilir.
Açıklanan deneysel işlemin organ oluşumu tam olarak kurulan organogenesis erken dönemlerinde ve fonksiyonel organları kuş embriyo dışında takip için bir araç olarak kullanılabilir.

Yukarıdaki Protokolü ayrıntıları araştırma, her iki erken - ve geç-dönemlerinde organogenesis, sık sık hücresel ve moleküler karmaşık etkileşimler tarafından sınırlı izin veren bir yöntem tarif etti.
Bu yöntem daha önce Figueiredo vd. istihdam edildi Çentik ve kuş paratiroid/timus ortak primordium geliştirilmesinde sinyal Hh rolü çözülmeye 5 .
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-p...

Bu makalede klasik bıldırcın-tavuk chimera sistemin roman vitro ve ovo içinde deneysel prosedürler birleştirerek organ oluşumu, çalışma Güncellenme Zamanı bir yaklaşım sağlar.

İlk - ve geç-aşamalarında Organ oluşumu kuş modelindeki keşfetmek için iki adımlı yaklaşım: timus ve paratiroid bezleri Organogenesis paradigma

The avian embryo, as an experimental model, has been of utmost importance for seminal discoveries in developmental biology. Among several approaches, the ...

Bu prosedürün genel amacı, embriyonik dokuların in vitro manipülasyonunu kuş modeli kullanılarak in ovo greftleme teknikleriyle birleştirerek organogenezin erken ve geç aşamalarını incelemek için iki aşamalı bir yaklaşım sağlamaktır. Bu yöntemde, prospektif organ ilkesini içeren embriyonik bölge izole edilir ve 48 saat boyunca organotipik bir sistemde büyütülür. Normal gelişimi taklit eden bu in vitro yaklaşım, spesifik moleküler belirteçlere ihtiyaç duymadan embriyonik bölgelere kolay erişim sağlar ve son derece dinamik mekansal modifikasyonlara ve karmaşık doku etkileşimlerine dayanan organ oluşumundaki erken gelişim aşamalarının deneysel manipülasyonunu sağlar.Daha sonra kültürlenmiş dokular bir tavuk embriyosunun koryoallantoik membranına aşılanır. Koryoallantoik membran, vasküler bir besin tedarikçisi gibi davranır ve aşılanmış dokulara gaz değişimine izin vererek ovo içinde gelişmesini sağlar. Bu adım, özellikle organogenezin geç aşamalarını incelemek için çok uygundur, çünkü tam olarak oluşmuş organlar 10 günlük yumurta gelişiminden sonra elde edilebilir.Ek olarak, farmakolojik ajanlar in vitro ve in ovo gelişim boyunca uygulanabilir ve bu da sinyal yolaklarının gelişimsel a

two-step-approach-to-explore-early-late-stages-organ-formation-avian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Bu video, diseksiyon ve fetal timus çıkarılması de 2-dGuo ile tedavi edilen timus ex vivo kültürlerin hazırlanmasında gösteriyor.

2-dGuo Boyalı Thymus Organ Kültürleri hazırlanması

Bu protokol, fare embriyonik tiroid anlajeninin diseksiyonunu ve eksplantların yarı gözenekli filtreler veya mikroskopi plastik slaytlar üzerinde kültürünü tanımlar. Bu sistem, vahşi tip veya nakavt embriyoların tiroid gelişimi sırasında meydana gelen morfogenetik veya farklılaşma olaylarını incelemek için idealdir ve fonksiyon kazancı ve kaybı deneylerine uygundur.

Bir<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kültür Sistemi Tiroid Geliştirme Çalışması

Burada, embriyonik tavuk organları büyümeye Protokolü kültür bir organotypic mevcut tüp bebek. Bu yöntemi kullanarak, embriyonik tavuk doku gelişimi, kültür ortamı üzerinde kontrol yüksek derecede korunarak okudu.

Embriyonik tavuk doku gelişimi çalışmaya Organotypic kültür yöntemi

Bu makalede embriyonik dokulardan saf formu ex vivo chimeric organları için bir araya getirilebilen bıldırcın ve tavuk embriyolar izole etmek için bir yöntem sağlar.

Yalıtım embriyonik doku ve timus örnek kullanarak bıldırcın-tavuk Chimeric organ oluşumu

Bu çalışma, organ gelişimini incelemek için iki yöntem, kültürlü embriyonik organ ve organoidlerin vaskülarizasyonuna olanak sağlayan kuş embriyolarından koryoallantoik membran (CAM) üzerine geliştirilmiş bir ksinotransplantasyon kurulumu ve yeni bir sabit z-yönü yüksek çözünürlüklü zaman atlamalı konfokal görüntüleme sağlayan modifiye deneysel koşulları ile organ kültürü yöntemi.

Vaskülarizasyon, Uzatılmış Gelişim ve Geliştirilmiş Mikroskopi Görüntüleme için Renal Organoid ve Organotipik Kültürün Optimizasyonu

Civciv, çeşitli çalışmalar için uygun maliyetli, erişilebilir ve yaygın olarak bulunan bir model organizmadır. Burada, kuş iç kulağı gelişimi ve yenilenmesinin altında yatan moleküler mekanizmaları anlamak için bir dizi protokol detaylandırılmıştır.

Ovo ve Ex Ovo'da Kuş İç Kulak Gelişimini İnceleme Yöntemleri

Burada, tavuk embriyolarının selomik boşluğunda böbrek organoidlerinin transplantasyonu için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, 8 gün içinde organoidlerin vaskülarizasyonunu ve gelişmiş olgunlaşmasını indükler ve bu süreçleri verimli bir şekilde incelemek için kullanılabilir.

Tavuk Embriyolarında İntralomik Transplantasyon Yoluyla Böbrek Organoidlerinin Etkin Vaskülarizasyonu

Burada, doku etkileşimlerini, 4D görüntüleme timelapse filmini (3D artı zaman), moleküler fonksiyonun küresel veya yerel bozulmasını ve sistem biyolojisi karakterizasyonunu incelemek için kullanılabilecek üç tip kuş embriyonik deri eksplant kültürü için protokolleri açıklıyoruz.

Doku Desenini ve Organogenezi İncelemek için Kuş Derisi Eksplantlarının Kullanılması

Burada, insan beyni organoidlerini çoklu olgunlaşma aşamalarında civciv koryoallantoik membranına (CAM) aşılamak için bir protokol sunuyoruz. Beyin organoidleri, kılavuzsuz standartlaştırılmış protokoller izlenerek büyütüldü.

Erken Güdümsüz İnsan Beyni Organoid Nörovasküler Niş İzin Veren Civciv Embriyo Korioallantoik Membran Modellemesi

Xenopus laevis embriyosu, büyük boyutu ve manipülasyon kolaylığı nedeniyle erken gelişim çalışmalarında son derece yararlı olmaya devam ediyor.   Bu model sistemde belirli organların tanımlanmasında kullanılabilecek tam montajlı in situ hibridizasyon protokolü için basitleştirilmiş bir protokol sağlanmıştır.

Anlamak Basitleştirilmiş kullanma Erken Organogenez<em&gt; In Situ</emIçinde&gt; Hibridizasyon Protokolü<em&gt; Ksenopus</em

Keşfedin, kuş modelinde timus ve paratiroid bezlerinin organ oluşumunu in vitro ve in ovo teknikleriyle araştırmak için iki adımlı yaklaşım. Bu yöntem erken ve geç aşamaları detaylı incelemeye olanak tanır.

İlk - ve geç-aşamalarında Organ oluşumu kuş modelindeki keşfetmek için iki adımlı yaklaşım: timus ve paratiroid bezleri Organogenesis paradigma (Video) | JoVE Journal

İlk - ve geç-aşamalarında Organ oluşumu kuş modelindeki keşfetmek için iki adımlı yaklaşım: timus ve paratiroid bezleri Organogenesis paradigma

Daha fazla video keşfet