Name: Roman pasif optik şeffaflık bütün sinir dokusunda hızlı üretim için yöntemleri Temizleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 14 s
Description: Öğrenin fare ve sıçan merkezi sinir sistemi dokusunu psPACT ve mPACT yöntemleriyle hızla şeffaflaştırma tekniklerini. Bu yöntemler Alzheimer hastalığı ve tümör oluşumu gibi nöropatolojik koşulları incelemek için değerli araçlar sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser Tıp bilimi, Yonsei Üniversitesi beyin Kore 21 artı proje tarafından desteklenmiştir. Buna ek olarak, bu eser Ulusal Araştırma Vakfı Kore (NMK-2017R1D1A1B03030315) bir hibe tarafından desteklenmiştir.

Tüm yordamları Yonsei Üniversitesi Tıp Fakültesi, uygun araştırma Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır. Tüm deneysel hayvan laboratuvar hayvan bakımı Komitesi Yonsei Üniversitesi Tıp Fakültesi, kuralları uyarınca feda etti.
1. hazırlanması reaktifler
Dikkat: Paraformaldehyde (PFA), Akrilamid ve Sodyum Lauryl Sülfat (SDS) toksik tahriş edici vardır ve böylece bir duman başlıklı uygun kişisel koruyucu ekipman (PPE; önlük, eldiven, koruyucu gözlük) ile ele alınmalıdır.
<ol><li>%4 Akrilamid (AA) çözüm (A4P0): 20 mL % 40 Akrilamid çözüm için 180 mL 0.1 M fosfat tamponlu tuz (PBS) ekleyin.</li>
	<li>% 0.25 VA-044 çözüm: 2,2´-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane 0.5 g ekleyin] dihydrochloride (VA-044) toz 200 ml 0.1 M fosfat tamponlu tuz (PBS). VA-044 toz-ebilmek var olmak stok oda sıcaklığında iken, PBS solubilization üzerine 4 ° C'de depolanmalıdır. En iyi sonucu elde etmek için sadece deneme için gerekli çözüm miktarda hazırlamak.</li>
	<li>ANLAŞMA kokteyl çözüm: 10 g Akrilamid 225 mL % 4 paraformaldehyde (PFA) çözeltisi ekleyin ve 200 ml % 4 ile ses seviyesini PFA. Kullanılmadan önce VA-044 tozu 100 mg 40 mL 50 mL konik tüp içinde karışımı ekleyin.</li>
	<li>Çözüm arabelleği temizleyerek PAKTI: 40 g Sodyum Lauryl Sülfat (SDS) 350 mL 0.1 M PBS ekleyin ve 500 ml 0.1 M PBS ile ses seviyesini. Çözüm takas mPACT için % 0,5 α-thioglycerol çözüm arabelleği temizleyerek PAKTI ekleyin.</li>
	<li>Bu çalışmada kullanılan fareler 2-hafta-yaşlı BALB erkek fareler vardı; Bu çalışmada kullanılan fareler 2 hafta eski erkek SD-sıçan vardı.</li>
</ol>2. anestezi ve perfüzyon cerrahi
Dikkat: PFA ve Akrilamid toksik tahriş edici ve böylece bir duman başlıklı uygun KKE ile ele alınmalıdır.
<ol><li>30 mg/kg 1 mL şırınga ile 26'lik iğne kullanarak zoletil patojen-Alerjik bir odada hayvan anestezi. İzlemek hayvan için 5-10 dak.</li>
	<li>Hayvan cerrahi anestezi uçağa ulaştı sonra anestezi derinliği belirlemek için ayak-çimdik yanıt yöntemini kullanın. Yanıt vermeyi durdurma sorununu onaylayın. Not: bir önceki çalışmada11' kullanılan benzer bir iletişim kuralı fare ve sıçan cerrahi içeren aşağıdaki adımları izleyin.</li>
	<li>Göğüs kafesi, deri ve karın duvarı altında 5-6 cm kesi yapmak.</li>
	<li>Eğri, künt makas bir kesik kesik önceden siteyi bulmak için göğüs alan palpating diyafram içinde olun</li>
	<li>Kesik göğüs kafesi plevral boşluğu ortaya çıkarmak için tüm uzunluğu boyunca uzanır.</li>
	<li>Dikkatli bir şekilde akciğerlere yerinden. Köprücük kemiği kadar göğüs kafesi ile kesme yapmak. Iris makas kullanarak, küçük bir insizyon attım sol ventrikül arka bitene kadar dayanabilir. Bir 18'lik perfüzyon künt veya zeytin uçlu iğne kesilmiş ventrikül geçen artan aort içine yerleştirin.</li>
	<li>İğne güvenli ve kalp bir hemostat ile sıkma tarafından kaçağı önlemek. Alternatif olarak, değiştirilmiş bir hemostat aorta iğne ucu etrafında kelepçe için kullanın.</li>
	<li>Azalan aortaya en az hasar sağlamak için dikkat çekici sağ atriyumu büyük bir kesi yapmak. Fare şimdi perfüzyon için hazırdır.</li>
</ol>3. bütün perfüzyon ve sıçan diseksiyon
Dikkat: PFA ve Akrilamid toksik tahriş edici ve böylece bir duman başlıklı uygun KKE ile ele alınmalıdır.
Not: Aşağıdaki tüm perfüzyon adımları bir önceki çalışmada Woo ve arktarafından kullanılan bir iletişim kuralı benzer. (2016) 10 , 11.
<ol><li>Kalbin sağ atrium herhangi bir hava kabarcıkları tanıtmak değil dikkat çekici bir 18'lik iğne için ekleyin.</li>
	<li>50 mL şırınga kullanarak, hızlı bir şekilde ve eşit olarak 50 mL heparin (10 adet/mL) içeren soğuk 0.1 M PBS çözeltisi pompa.</li>
	<li>18'lik iğne Peristaltik pompa tüp takın.</li>
	<li>200 mL heparin (10 adet/mL) içeren soğuk 0.1 M PBS çözeltisi ile 10 mL/dak bir dolaşım hızda yıkayın.</li>
	<li>250 mL kan dolaşımı hızla 10 mL/dk soğuk % 4 İngiltere'de yılın çözeltisi ile düzeltmek. Fare bu aşamada sert olmalıdır.</li>
	<li>Toplar ve kalan PFA çözüm bertarafı için saklarız.</li>
	<li>ANLAŞMA için bir soğutulmuş PAKTI kokteyl çözüm %4 PFA, % 4 Akrilamid ve % 0.25 VA-044 toz kurcalayarak bir 18'lik iğne ile sıvı ve baş ve omurga kaldır. Kafatası bir ensizyon boyun burun yaparak ortaya çıkarmak. Bu ek perfüzyon adım psPACT ve mPACT yöntemleri için gerekli değildir; fiksasyon sonra hemen baş ve omurga yalıtmak ve kafatası bulaşmasına neden.</li>
	<li>Kafatasının herhangi bir kalıntı boyun ve omurga kas kaldırarak maruz.</li>
	<li>Peel away kafatası için rongeurs ve makas kullanın. Beyin ve omurilik kaldırın.</li>
	<li>Dokuya %4 oranında depolamak PFA 4 ° c; doku 1 hafta kadar saklanabilir.</li>
</ol>4. hidrojel Monomer infüzyon ve fare ve fare MSS polimerizasyonu
Dikkat: Akrilamid, SDS, α-thioglycerol ve İngiltere'de yılın tahriş edici ve böylece bir duman Hood ve uygun çiş ile ele alınmalıdır.
<ol><li>
PAKTI (pasif Temizleme tekniği)
	<ol>
<li>İzole etmek ve tüm MSS (beyin ve omurilik) sabit fareler ve sıçanlar %4 PFA, % 4 Akrilamid ve % 0.25 VA-044 toz ve mağaza 24 h doku tamamen s içinde dalmış sağlamak için 4 ° C'de soğutulmuş PAKTI kokteyl solüsyon içeren bir 50 mL tüp için kültür olution.</li>
		<li>10 dk mendil kullanarak bir azot tanka bağlı hibridizasyon sistem jel için örnek azot gazı içinde katıştırma: sistem 37 ° C'ye ayarla Dokuların taze soğuk (4 ° C) PAKTI içeren bir 50 mL tüp transferi kokteyl çözüm ve tüp kap ile bağlayın ve vakum üzerine açın.</li>
		<li>Hidrojel polimerize için örnek bir sallayarak kuluçka (150 d/d, 37 ° C) içeren tüp 3 h için veya polimerizasyon tamamlanana kadar koyun.</li>
		<li>Bloting kağıt kullanarak (bakınız Tablo malzemeler), Kaldır dokuları çevreleyen kalan polimerli hidrojel.</li>
		<li>Doku takas solüsyon (0.1 M PBS, pH %8.0 8 SDS) içeren bir 50 mL tüp aktarın.</li>
		<li>Örnek doku temizlenmiş oldu kadar 37 ° C ve 150 rpm için ayarla titreyen bir kuluçka makinesine koyun. Ortalama olarak, bu tam açıklığı elde etmek için yaklaşık 20 gün boyunca fareyi CNS alır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
psPACT (işlem ayrı pasif Temizleme tekniği)
	<ol>
<li>Bütün MSS (beyin ve omurilik) kemik kesici ve makas PFA-sabit fare ve sıçanlar temiz bir banka üzerinden ayırma.</li>
		<li>Doku transferi doku tamamen sabitleştirici dalmış PFA ve mağaza 24 h için 4 ° C'de % 4 içeren bir 50 mL tüp sağlamak.</li>
		<li>1s için sabit doku 0.1 M PBS yıkama ve A4P0 çözüm (0.1 M PBS %4 Akrilamid) aktarın. Mağaza 24 h 37 ° C'de.</li>
		<li>5 min için doku 0.1 M PBS içinde yıkayın.</li>
		<li>% 0.25 dokusunda bırakın VA-044 0.1 M PBS içinde. 6-24 h 37 ° C'de depolayın ve sonra taze % 0.25 VA-044/PBS çözüm için transfer.</li>
		<li>10 dk mendil kullanarak hibridizasyon jel için örnek azot gazı embed sistemi ( Tablo malzemelerigörmek) bağlı bir azot tankı: Transfer dokuların taze soğuk (4 ° C) içeren bir 50 mL tüp % 0.25 VA-044/PBS çözüm ve tüp kap ile bağlamak. Vakum üzerine açın.</li>
		<li>Doku çözüm (0.1 M PBS, pH %8.0 8 SDS) temizlemek için transfer.</li>
		<li>Titreyen bir kuluçka doku temizlenmiş oldu kadar 37 ° C ve 150 rpm için ayarla örnek kuluçkaya. Ortalama olarak, yaklaşık 17 gün boyunca fare CNS tam açıklığı elde etmek için alır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
mPACT (değiştirilmiş pasif Temizleme tekniği)
	<ol>
<li>Bütün MSS (beyin ve omurilik) kemik kesici ve makas PFA-sabit fare ve sıçanlar temiz bir banka üzerinden ayırma.</li>
		<li>4.2.2 - psPACT Protokolü'nün 4.2.8 adımları.</li>
		<li>Doku çözüm temizlenmesi için transfer. ANLAŞMA ve psPACT protokollerinden farklı olarak, mPACT % 0.5 α-thioglycerol ek olarak % 8 SDS 0.1 M PBS, pH 8.0 içinde oluşan bir takas çözüm gerektirdiğini unutmayın. Α-thioglycerol doku daha hızlı ve etkili bir şekilde temizlemek yardımcı olur un esmerleşme bir ajandır. Doku tam çözümde dalmış emin olun.</li>
		<li>Örnek doku temizlenmiş oldu kadar 37 ° C ve 150 rpm için ayarla titreyen bir kuluçka makinesine koyun. Ortalama olarak, fare CNS tam açıklığı elde etmek için yaklaşık 2 hafta sürer.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Kırılma indisi eşleme ve temizlenen MSS Immunostaining
Not: njantlar (Kırılma indisi eşleşen çözüm Nycodenz tabanlı) 0.8 g/mL Nycodenz toz içinde 30 mL temel tampon (% 0,01 sodyum azid ve ara-20 0.1 M PBS, pH 8.0) çözünmüş oluşur. Bu çözüm toz uygun solvasyon için izin vermek için kuluçka sallayarak 37 ° C yerleştirilir önerilir.
<ol><li>Kuluçkaya dokularda % 0.1 0.1 M PBS için 2 h, Triton X-100 sonra blok 0.1 M PBS 6 h için de %2 sığır serum albümin (BSA) ile.</li>
	<li>Bölümlerde üç kez PBST yıkamak (% 0.1 0.1 M PBS ara-20) için 2 h. bölümleri (Bu durumda, kan damarlarının lekeleri bir anti-tavşan PECAM-CD31 antikor) birincil antikorlar ile 2 gün boyunca leke.</li>
	<li>Bölümleri de %2 BSA (Bu durumda, bir keçi Anti-tavşan IgG Cy3 floresan eşlenik) ikincil antikor ile 2 gün boyunca leke.</li>
	<li>Yıkama üç kez içinde PBST 2 h için doku ve mağaza 15 mL 2-10 gün boyunca njantlar etiketli.</li>
	<li>Görüntüleme önce etiketli dokular njantlar küçük bir miktar için 35 veya 60 mm doku kültürü yemekleri üzerinde hareket ettirin. Silikon çevresinde çanak alt kenarı ile düzeltmek.</li>
	<li>1.5-2 mL taze njantlar ekleyin.</li>
</ol>6. görüntü işleme
<ol><li>Kiremit bir confocal lazer tarama microscopewith 10 x büyütme kullanarak tarama ile temizlenmiş dokuların görüntüleri elde etmek ( Tablo malzemelerigörmek). Cy3 etiketli dokusunun 550-600 nm dalga boyu kullanın.</li>
</ol>

<ol><li>Zhu, X., Xia, Y., Wang, X., Si, K., Gong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+brain+imaging%3A+A+powerful+tool+for+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Bull%22%5BJournal%5D)">Optical brain imaging: A powerful tool for neuroscience.</a> Neurosci Bull. 33 (1), 95-102 (2017).</li>
<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li>
<li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).</li>
<li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLARITY+reveals+dynamics+of+ovarian+follicular+architecture+and+vasculature+in+three-dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">CLARITY reveals dynamics of ovarian follicular architecture and vasculature in three-dimensions.</a> Sci Rep. 7, 44810(2017).</li>
<li>Lee, H., Park, J. H., Seo, I., Park, S. H., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+application+of+the+electrophoretic+tissue+clearing+technology%2C+CLARITY%2C+to+intact+solid+organs+including+brain%2C+pancreas%2C+liver%2C+kidney%2C+lung%2C+and+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine.</a> BMC Dev Biol. 14, 48(2014).</li>
<li>Jensen, K. H. R., Berg, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+and+perspectives+in+tissue+clearing+using+CLARITY%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chem+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">Advances and perspectives in tissue clearing using CLARITY.</a> J Chem Neuroanat. 86, 19-34 (2017).</li>
<li>Treweek, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+tissue+stabilization+and+selective+extractions+via+tissue-hydrogel+hybrids+for+high-resolution+intact+circuit+mapping+and+phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping.</a> Nat Protoc. 10 (11), 1860-1896 (2015).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158 (4), 945-958 (2014).</li>
<li>Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Just, L., Mack, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+tissue+clearing+%28PACT%29%3A+Technical+evaluation+and+new+perspectives+in+immunofluorescence%2C+histology%2C+and+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Large-scale tissue clearing (PACT): Technical evaluation and new perspectives in immunofluorescence, histology, and ultrastructure.</a> Sci Rep. 6, 34331(2016).</li>
<li>Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+optical+transparency+of+rodent+tissues+by+modified+PACT-based+passive+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing.</a> Exp Mol Med. 48 (12), 274(2016).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J Vis Exp. (65), (2012).</li>
<li>Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+clearing+of+the+mouse+central+nervous+system+using+passive+CLARITY%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Optical clearing of the mouse central nervous system using passive CLARITY.</a> J Vis Exp. (112), (2016).</li>
<li>Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SeeDB%3A+A+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">SeeDB: A simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nat Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).</li>
<li>Choi, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+expression+of+the+receptor+for+advanced+glycation+end+products+in+neurons+and+astrocytes+in+a+triple+transgenic+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Increased expression of the receptor for advanced glycation end products in neurons and astrocytes in a triple transgenic mouse model of Alzheimer's disease.</a> Exp Mol Med. 46, 75(2014).</li>
<li>Chang, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contralaterally+transplanted+human+embryonic+stem+cell-derived+neural+precursor+cells+%28ENStem-A%29+migrate+and+improve+brain+functions+in+stroke-damaged+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Contralaterally transplanted human embryonic stem cell-derived neural precursor cells (ENStem-A) migrate and improve brain functions in stroke-damaged rats.</a> Exp Mol Med. 45, 53(2013).</li>
<li>Kim, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+differential+plaque+depositions+in+the+brains+of+Tg2576+and+Tg-APPswe%2FPS1dE9+transgenic+mouse+models+of+Alzheimer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Analysis of differential plaque depositions in the brains of Tg2576 and Tg-APPswe/PS1dE9 transgenic mouse models of Alzheimer disease.</a> Exp Mol Med. 44 (8), 492-502 (2012).</li>
<li>Kinameri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prdm+proto-oncogene+transcription+factor+family+expression+and+interaction+with+the+Notch-Hes+pathway+in+mouse+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Prdm proto-oncogene transcription factor family expression and interaction with the Notch-Hes pathway in mouse neurogenesis.</a> PLoS One. 3 (12), e3859(2008).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Pasif, elektroforetik sigara ekstraksiyon yöntemleri istihdam ederken PAKTI önceki doku NETLİK2,3,4,7 gibi yöntemleri temizlenmesi ile elde tutarlılık önemli ölçüde geliştirilmiş , 8, teknik hala birkaç eksiklikler, maksimal doku netlik12ulaşmak için gereken süreyi en önemli biri olduğunu taşımaktadır. Mevcut çalışmada, biz önemli ölçüd...

Klinik ve bilimsel açıdan soruşturma temel amacı organ yapısı ve fonksiyonu tam bir anlayış ulaşmak içerir; Ancak, memeli organları son derece karmaşık doğası kez tamamen bu amaç1ulaşmak için bir engel olarak hizmet vermektedir. Sağlam dokulara gelen bir hidrojel Akrilamid tabanlı melez inşa içerir, berraklık (açık Lipid değiş tokuş Akrilamid melezleşmiştir katı görüntüleme uyumlu Tisssue-hidrojel)2,3,4, elde organ, beyin, karaciğer ve dalak, onların yapısal bütünlük5koruyarak dahil olmak üzere çeşitli optik geçiş izni. NETLİK böylece sadece görselleştirme ince karmaşık hücresel ağlar ve doku türleri Morfoloji kesit gerek kalmadan incelemek için bir fırsat aynı zamanda sağlamıştır.
Doku izni elde etmek için NETLİK örnek el altında lipit içeriğini kaldırmak için elektroforetik yöntemleri kullanır. NETLİK fiziksel olarak istikrarlı doku-hidrojel melez üretmek için kaydetti iken, elektroforetik doku takas (vb) yöntemleri kullanımı, esmerleşme epitope hasar, dahil olmak üzere, doku kalitesi açısından değişken sonuçlar verir çalışmalar göstermiştir ve protein kaybı5,6. Bu sorunları gidermek için vb tedavi yerini alan bir pasif, deterjan iyonik bağlı delipidation tekniği ile anlaşma (pasif netlik tekniği), gibi değiştirilmiş protokolleri gelişmiş7,8,9olmuştur. Sonuçlarında büyük bir tutarlılık ulaşmak rağmen ancak, PAKTI maksimal izni elde etmek için daha fazla zaman gerektirir. Ayrıca, bu teknikleri hiçbiri henüz tüm CNS formu veya fareler ve eskiden şiling şimdi pigs gibi daha büyük kemirgen modellerinde uygulandı.
Bu da çalışmanın roman metodolojileri, psPACT (işlem-ayrı PAKTI) ve mPACT (değiştirilmiş PAKTI), Bütün CNS ve iç organlar fare ve sıçan modelleri10hızlı Gümrükleme kolaylaştırmak için teklif tarafından bu sınırlamaları gidermek çalışmaktadır. Özellikle, psPACT % 4 Akrilamid ve % 0.25 dokulara işleyen VA-044 hidrojel oluşumu sırasında; iki ayrı adımda mPACT esasen aynı adımları içerir, ancak % 0.5 α-thioglycerol anahtar reaktifi olarak SDS tabanlı takas Çözümle takviyeleri. Her iki teknikleri endojen sistemik ve cerebrospinal dolaşım optik temizleme üretmek için gereken süreyi önemli ölçüde azaltmak için sistemleri koşum. İlke kanıtı olarak biz confocal mikroskopi kan damarı desenleri temizlenen doku10analiz kullanımını göstermektedir.

<table><tbody><tr><td>Sodyum Dodesil Sülfat (SDS)</td><td>Affymetrix, Inc.</td><td>75819</td><td>Temizleme çözümü</td></tr><tr><td>Nycodenz</td><td>Axia-Shield</td><td>1002424</td><td>nRIMS çözeltisi</td></tr><tr><td>%40 Akrilamid Çözeltisi</td><td>Bio Rad Laboratories, Inc.</td><td>161-0140</td><td>Polimerizasyon (A4P0)</td></tr><tr><td>2,2&akut;-Azobis [2- (2-imidazolin-2-il) propan] Dihidroklorür</td><td>Wako Saf Kimya Endüstrileri, Ltd.</td><td>017-19362</td><td>Polimerizasyon (VA-044)</td></tr> <tr><td>1-Tiyogliserol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1753-100ML</td><td>Temizleme çözeltisi (mPACT)</td></tr> <tr><td>Ara-20</td><td>Georgiachem</td><td>9005-64-5</td><td>nRIMS çözeltisi</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787-50ML</td><td>İmmün Boyama</td></tr><tr><td>Sığır serum albümini (BSA)</td> <td>Bovogen</td><td>BSA100</td><td>İmmüno Boyama</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Merck Millipore</td><td>375095</td><td>Perfüzyon (PBS)</td></tr> <tr><td>Sodyum azid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002-25G</td><td>nRIMS çözeltisi</td></tr><tr><td>PECAM-CD31 antikoru</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji A.Ş.</td><td>sc-28188</td><td>İmmüno Boyama</td></tr><tr><td>Keçi anti-tavşan-IgG Cy3 floresan konjugat</td>, <td>Jackson ImmunoResearch, Inc.</td><td>111-165-003</td><td>İmmüno Boyama</td></tr><tr><td>%4 Paraformaldehit</td><td>Tech & İnovasyon</td><td>BPP-9004</td><td>Perfüzyon, Polimerizasyon</td></tr><tr><td>20X Fosfat Tamponlu Salin (pH 7.4)</td><td>Tech & Yenilik</td><td>BPB-9121</td><td>Perfüzyon, Tampon</td></tr><tr><td>10 mL stripet</td><td>Coatar</td><td>4488</td><td>Çözelti transferi</td></tr><tr><td>50 mL tüp</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td>Temizleme tüpü</td></tr><tr><td>35 mm Hücre kültürü kabı</td><td>SPL</td><td>20035</td><td>Görüntüleme</td></tr><tr><td>Konfokal çanak</td><td>SPL</td><td>211350</td><td>Görüntüleme</td></tr><tr><td>1 mL şırınga</td><td>Kore aşı Co, Ltd</td><td>26G 1/2</td><td>Anestezi&nbsp;</td></tr><tr><td>50 mL şırınga</td><td>Kore aşısı Co, Ltd</td><td>21G1 1/4</td><td>Perfüzyon</td></tr><tr><td>Akrilamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3553</td><td>Polimerizasyon (A4P0)</td></tr><tr><td>Whatman 3MM kağıt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z270849</td><td>Jel çıkarma için kurutma kağıdı</td></tr><tr><td>Konfokal mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>LSM780</td><td>Görüntüleme</td></tr><tr><td>ZEN lite Yazılımı</td><td>Zeiss</td><td>ZEN 2012</td><td>Görüntüleme</td></tr><tr><td>Peristaltik pompa</td><td>Longerpump</td><td>BT100-1F</td><td>Perfüzyon</td></tr><tr><td>EasyGel</td><td>Lifecanvas Teknolojileri</td><td>EasyGel</td><td>Doku jeli hibridizasyon sistemi</td></tr></tbody></table>

roman pasif optik şeffaflık bütün sinir dokusunda hızlı üretim için yöntemleri temizleme

Novel Passive Clearing Methods for the Rapid Production of Optical Transparency in Whole CNS Tissue

NETLİK geliştirme beri teknik temizleyerek bir bioelectrochemical bu üç boyutlu fenotip eşleme için şeffaf dokularda, roman Temizleme yöntemleri kübik (açık, engelsiz beyin görüntüleme dahil olmak üzere çok sayıda sağlar kokteyller ve sayısal analiz), anahtarı (etkileşim zaman sistemde kontrol) ve kimyasal kinetik, harita (Proteom büyütülmüş analizi) ve PAKTI (pasif netlik tekniği), kurulmuştur için varolan araç daha fazla genişletmek için biyolojik dokuların mikroskopik analiz. Üzerine iyileştirmek ve özgün PAKTI yordamı tüm merkezi sinir sistemi (MSS), böbrek, dalak ve tüm fare embriyo gibi sağlam kemirgen dokuların bir dizi için en iyi duruma getirme mevcut çalışma amaçlamaktadır. PsPACT (işlem-ayrı PAKTI) ve mPACT (değiştirilmiş PAKTI) olarak adlandırdığı, roman bu teknikler hücre devresi haritalama ve olduğu gibi normal ve patolojik dokularda hücre altı yapıları görselleştirme son derece etkili yol sağlar. Aşağıdaki iletişim kuralında, biz onların yapısal bütünlük psPACT ve mPACT üzerinden en az işgali ile maksimal doku izni elde etmek nasıl ayrıntılı, adım adım anahat sağlar.

En iyi duruma getirilmiş pasif Temizleme teknikleri kullanarak tüm CNS şeffaf bir model nesil
Fare ve sıçan bütün CNS dokuların optik geçiş izni hızla çeşitli pasif Temizleme Teknikleri (şekil 1) kullanılarak sağlanır. Zaman içinde takas dokusunun bir şematik şekil 2Agösterilir. Özgün PAKTI yönteminden farklı olarak, % 4 Akrilamid (A4P0) ve % 0.25 VA-04...

Burada, iki roman metodolojisi, psPACT ve mPACT maksimal optik şeffaflık ve doku damarlara sağlam kemirgen sonraki mikroskobik analizi elde etmek için mevcut tüm CNS.

Roman pasif optik şeffaflık bütün sinir dokusunda hızlı üretim için yöntemleri Temizleme

Since the development of CLARITY, a bioelectrochemical clearing technique that allows for three-dimensional phenotype mapping within transparent tissues, ...

Bu psPACT ve mPACT yöntemlerinin genel amacı, elektroforetik doku temizleme sistemine ihtiyaç duymadan tüm CNS dokusunun hızlı bir şekilde temizlenmesidir. Bu yöntem, Alzheimer hastalığı veya yaralanma ve dejenerasyon ve tümör oluşumu gibi insan hastalığı araştırma modeli alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, fare CNS dokusunun elektroforetik doku temizliğinden zarar görmemesi ve modifiye pasif temizleme ile hızlı bir şekilde temizlenmesidir.Bu yöntem için ilk olarak, beyin temizleme için orijinal PACT ve geçmiş yöntemi kullandıktan sonra aklımıza geldi. Bu yöntemin görsel gösterimi kritik öneme sahiptir, çünkü psPACT ve mPACT yönteminin çalıştırılması zordur, çünkü bu yöntemin birden fazla numune hazırlama aşaması vardır. %0.25'lik bir nihai konsantrasyonda %4 PFA ve %4 akrilamid çözeltisine VA-044 tozu ekleyerek PACT kokteyl çözeltisi hazırlayarak başlayın. Dokuları PACT çözeltisi ile perfüze ettikten sonra, tüm beyni ve omuriliği soğutulmuş PACT çözeltisi içeren 50 mililitrelik bir tüpe tamamen daldırın ve 24 saat boyunca dört santigrat derecede saklayın.24 saat sonra, dokuyu taze, soğuk PACT çözeltisi içeren 50 mililitrelik bir tüpe aktarın ve tüp kapağını bir nitrojen tankına bağlı ve 37 santigrat dereceye ayarlanmış bir doku jeli hibridizasyon sistemine bağlayın. Ardından, numuneyi nitrojen gazına gömmek için vakumu ve gazı 10 dakika boyunca açın. Hidrojeli polimerize etmek için, numuneyi içeren tüpü üç saat boyunca veya polimerizasyon tamamlanana kadar 150 rpm ve 37 santigrat dereceye ayarlanmış bir çalkalama inkübatörüne yerleştirin.İnkübasyonun ardından, dokuları çevreleyen kalan polimerize hidrojeli çıkarmak için kurutma kağıdı kullanın. Daha sonra, dokuyu temizleme solüsyonu içeren 50 mililitrelik bir tüpe aktarın. Numuneyi, doku temizlenene kadar 37 santigrat derece ve 150 rpm'ye ayarlanmış çalkalama inkübatörüne yerleştirin.Ortalama olarak, fare CNS'nin tam netliğe ulaşması yaklaşık 20 gün sürer. 24 saat boyunca dört santigrat derecede %4 PFA'da sonradan sabitlenmiş %4 PFA ile perfüze edilmiş bir fareden CNS ile psPACT'a başlayın. Sabit dokuyu 0.1 molar PBS'de bir saat boyunca yıkayın.Yıkadıktan sonra dokuyu A4P0 çözeltisine aktarın ve 24 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, dokuyu PBS'de beş dakika yıkadıktan sonra, dokuyu PBS'de% 0.25 VA-044'e daldırın ve altı ila 24 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Akrilamidin ve müteakip VA-044 adımının ayrılması, dokuyu çevreleyen kalan polimerize edilmemiş hidrojel monomerlerinin çıkarılması ihtiyacını ortadan kaldırır, bu da PACT ile şeffaflık elde edildikten sonra nihai doku bütünlüğünü tehlikeye atabilir.İnkübasyonun ardından dokuları taze, soğuk VA-044 çözeltisine aktarın. Ardından, numuneyi 10 dakika boyunca nitrojen gazına gömün. Dokuyu temizleme çözeltisine aktarın.Ardından, doku temizlenene kadar numuneyi 37 santigrat derece ve 150 rpm'ye ayarlanmış çalkalama inkübatörde inkübe edin. Ortalama olarak, fare CNS'nin tam netliğe ulaşması yaklaşık 17 gün sürer. mPACT için, temizleme çözümü adımına kadar psPACT protokolünü izleyin.Daha sonra, 0.1 molar PBS'de% 8'e ek olarak% 8'e ek olarak, kahverengileşmeyi önleyen bir ajan olan% 0.5 alfa-tiyogliserol içeren doku temizleme solüsyonunu tamamen daldırın. Numuneyi, doku temizlenene kadar 37 santigrat derece ve 150 rpm'ye ayarlanmış çalkalama inkübatörüne yerleştirin. Ortalama olarak, fare CNS'nin mPACT kullanarak tam netlik elde etmesi sadece iki hafta sürer.Bu çalışmada, mPACT protokolü ile tedavi edilen fare beyin örnekleri, PACT ve psPACT protokolleri ile tedavi edilen örneklerden önce, 14 gün sonra optik şeffaflık elde etti. mPACT ile temizlenen sıçan bütün CNS numuneleri, 20 gün içinde maksimum klerens elde etti. Tüm CNS'nin aksine, tek başına yetişkin sıçan beyinleri, sadece beş gün içinde mPACT ile temizlendi.Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, uygun şekilde gerçekleştirilirse, farenin tüm CNS'si ile iki hafta içinde yapılabilir. Geliştirilmesinden sonra bu teknik, sinirbilim ve anatomi alanındaki araştırmacıların, memeli CNS modellerinde doku yaralanması, gelişimsel malformasyonlar, kanser ve nörodejeneratif hastalık gibi patofizyolojik hastalıkları keşfetmelerinin yolunu açtı.

novel-passive-clearing-methods-for-rapid-production-optical

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Burada yarı kalın beyin dilimleri görüntü floresan işaretli hücrelerin hızlı ve basit bir yöntem açıklanmaktadır. Sabitleme, dilimleme, beyin dokusu ve optik temizleme standart epifluorescent veya konfokal görüntüleme, sağlam sinir dokusu içinde bireysel hücreleri ve nöral ağların görselleştirmek için nasıl kullanılabileceğini açıklar.

Yarı Kalın Beyin Slices Yüksek Çözünürlük Floresans Görüntüleme Hızlı Bir Yaklaşım

Optik temizleme teknikleri, dokuların görselleştirilme biçiminde devrim yaratıyor. Bu raporda, daha tutarlı ve daha ucuz sonuçlar veren orijinal Clear Lipid değişimli Akrilamid hibritleştirilmiş Rijit Görüntüleme uyumlu Doku-hYdrogel (CLARITY) protokolünün modifikasyonlarını açıklıyoruz.

Pasif kullanımı Netlik Fare Merkezi Sinir Sistemi Optik Takas

ACT-PRESTO (organlara makromoleküllerin aktif netlik tekniği basınçlı ilgili verimli ve istikrarlı transfer) pasif difüzyon veya basınç destekli teslimat temizlenir dokulara hızlı, verimli, ama ucuz doku takas ve hızlı antikor penetrasyon sağlar. Bu yöntemi kullanarak, dokuların geniş bir yelpazede, temizlenmiş birden antikorlar tarafından immunolabeled ve hacim-görüntülü olabilir.

ACT-PRESTO: Biyolojik Doku Takas ve Hacim Görüntüleme için ile immün Yöntemleri

Antikor etiketleme, optik temizleme ve gelişmiş ışık mikroskobu kombinasyonu, tam yapıların veya organların üç boyutlu analizini sağlar. Burada açıklanan, kalın böbrek dilimleri immünolabeling birleştirmek için basit bir yöntemdir, etil cinnamate ile optik Temizleme, ve üç boyutlu böbrek yapıların görselleştirme ve kantifikasyon sağlayan konfoköz görüntüleme.

Optik temizleme ve Immünolabeled böbrek dokusu görüntüleme

Nöronal dendritik morfoloji genellikle fonksiyon alttan. Gerçekten de, nöronların gelişimini etkileyen birçok hastalık süreci morfolojik bir fenotip ile kendini gösterir. Bu protokol, bozulmamış dendritik çardakları ve ilişkili dikenlerini analiz etmek için basit ve güçlü bir yöntemi açıklar.

CLARITY Doku Temizleme Yoluyla Bozulmamış Nöronal Dendritlerin Görüntülenmesi ve Nicelleştirilmesi

Protokol, bir doku temizleme yöntemi olan ScaleSF kullanılarak beyin diliminde ayrıntılı bir nöronal görüntüleme yöntemi sağlar. Protokol, beyin dokusu hazırlama, doku berraklaştırma, temizlenmiş dilimlerin işlenmesi ve nöronal yapıların mezoskopikten mikroskobik seviyelere kadar konfokal lazer taramalı mikroskopi görüntülemesini içerir.

Mezoskopikten Mikroskobik Ölçeklere Nöronal Görüntüleme için Bir Doku Temizleme Yöntemi

Tümör sferoidleri, tümör hücresi-mikroçevre etkileşimlerini ve tedavi yanıtını değerlendirmek için giderek daha fazla kullanılmaktadır. Mevcut protokol, hızlı optik temizleme kullanarak 3D tümör sferoidlerinin yarı yüksek verimli görüntülenmesi için sağlam ama basit bir yöntemi tanımlamaktadır.

Tümör Sferoidlerinin Yarı Yüksek Verimli Analizi için Hızlı Optik Temizleme

Mevcut protokol, (SWITCH  - H2O2 - Antijen Reterival - 2,2'-tiyodietanol [TDE]) KISA doku transformasyon tekniğini rutin olarak yüksek verimli bir protokolde ışık tabakası floresan  mikroskobu görüntüleme ile birleştirerek onlarca postmortem insan beyni kesitinin hızlı ve eşzamanlı optik temizleme, çok yönlü etiketleme ve 3D hacimsel rekonstrüksiyonu için adım adım bir prosedür sağlar.

Büyük Ölçekli İnsan Beyni Görüntülemede Işık Tabakası Floresan Mikroskobu için Optik Temizleme ve Etiketleme

Bu protokol, tam montajlı retinal organoidlerin tam hacimli konfokal görüntülemesi için optik temizleme ve immün etiketlemeyi birleştirir. 3D yapıyı koruyarak, temel nöronal yolların ayrıntılı görselleştirilmesini sağlar, retina olgunlaşması, mekansal organizasyon ve hastalık modellemesi ve kişiselleştirilmiş tıptaki potansiyel uygulamalarının incelenmesini geliştirir.

Hücresel Çözünürlük ile Tam Montajlı Retinal Organoid Görselleştirme

Emici molekül çözeltileri gibi optik temizleme teknikleri, biyolojik görüntülemeyi geliştirmek için ışık saçılımını geçici olarak azaltır ve derine gömülü organlar için biyouyumlu, geri dönüşümlü in vivo görüntüleme stratejileri sunar. Bu protokol, canlı hayvanlarda gerçek zamanlı dinamikler için yüksek kaliteli, dinamik görüntüleme elde etmek için ayrıntılı deneysel prosedürlerin yanı sıra gelişmiş görüntü işleme sunar.

Ex Vivo ve In Vivo Görüntüleme için Emici Moleküller Kullanarak Geçici Optik Temizleme

Öğrenin fare ve sıçan merkezi sinir sistemi dokusunu psPACT ve mPACT yöntemleriyle hızla şeffaflaştırma tekniklerini. Bu yöntemler Alzheimer hastalığı ve tümör oluşumu gibi nöropatolojik koşulları incelemek için değerli araçlar sunar.

Roman pasif optik şeffaflık bütün sinir dokusunda hızlı üretim için yöntemleri Temizleme

Daha fazla video keşfet