Roman pasif optik şeffaflık bütün sinir dokusunda hızlı üretim için yöntemleri Temizleme
8 Mayıs 2018
Burada, iki roman metodolojisi, psPACT ve mPACT maksimal optik şeffaflık ve doku damarlara sağlam kemirgen sonraki mikroskobik analizi elde etmek için mevcut tüm CNS.
Bu psPACT ve mPACT yöntemlerinin genel amacı, elektroforetik doku temizleme sistemine ihtiyaç duymadan tüm CNS dokusunun hızlı bir şekilde temizlenmesidir. Bu yöntem, Alzheimer hastalığı veya yaralanma ve dejenerasyon ve tümör oluşumu gibi insan hastalığı araştırma modeli alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, fare CNS dokusunun elektroforetik doku temizliğinden zarar görmemesi ve modifiye pasif temizleme ile hızlı bir şekilde temizlenmesidir.
Bu yöntem için ilk olarak, beyin temizleme için orijinal PACT ve geçmiş yöntemi kullandıktan sonra aklımıza geldi. Bu yöntemin görsel gösterimi kritik öneme sahiptir, çünkü psPACT ve mPACT yönteminin çalıştırılması zordur, çünkü bu yöntemin birden fazla numune hazırlama aşaması vardır. %0.25'lik bir nihai konsantrasyonda %4 PFA ve %4 akrilamid çözeltisine VA-044 tozu ekleyerek PACT kokteyl çözeltisi hazırlayarak başlayın. Dokuları PACT çözeltisi ile perfüze ettikten sonra, tüm beyni ve omuriliği soğutulmuş PACT çözeltisi içeren 50 mililitrelik bir tüpe tamamen daldırın ve 24 saat boyunca dört santigrat derecede saklayın.
24 saat sonra, dokuyu taze, soğuk PACT çözeltisi içeren 50 mililitrelik bir tüpe aktarın ve tüp kapağını bir nitrojen tankına bağlı ve 37 santigrat dereceye ayarlanmış bir doku jeli hibridizasyon sistemine bağlayın. Ardından, numuneyi nitrojen gazına gömmek için vakumu ve gazı 10 dakika boyunca açın. Hidrojeli polimerize etmek için, numuneyi içeren tüpü üç saat boyunca veya polimerizasyon tamamlanana kadar 150 rpm ve 37 santigrat dereceye ayarlanmış bir çalkalama inkübatörüne yerleştirin.
İnkübasyonun ardından, dokuları çevreleyen kalan polimerize hidrojeli çıkarmak için kurutma kağıdı kullanın. Daha sonra, dokuyu temizleme solüsyonu içeren 50 mililitrelik bir tüpe aktarın. Numuneyi, doku temizlenene kadar 37 santigrat derece ve 150 rpm'ye ayarlanmış çalkalama inkübatörüne yerleştirin.
Ortalama olarak, fare CNS'nin tam netliğe ulaşması yaklaşık 20 gün sürer. 24 saat boyunca dört santigrat derecede %4 PFA'da sonradan sabitlenmiş %4 PFA ile perfüze edilmiş bir fareden CNS ile psPACT'a başlayın. Sabit dokuyu 0.1 molar PBS'de bir saat boyunca yıkayın.
Yıkadıktan sonra dokuyu A4P0 çözeltisine aktarın ve 24 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, dokuyu PBS'de beş dakika yıkadıktan sonra, dokuyu PBS'de% 0.25 VA-044'e daldırın ve altı ila 24 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Akrilamidin ve müteakip VA-044 adımının ayrılması, dokuyu çevreleyen kalan polimerize edilmemiş hidrojel monomerlerinin çıkarılması ihtiyacını ortadan kaldırır, bu da PACT ile şeffaflık elde edildikten sonra nihai doku bütünlüğünü tehlikeye atabilir.
İnkübasyonun ardından dokuları taze, soğuk VA-044 çözeltisine aktarın. Ardından, numuneyi 10 dakika boyunca nitrojen gazına gömün. Dokuyu temizleme çözeltisine aktarın.
Ardından, doku temizlenene kadar numuneyi 37 santigrat derece ve 150 rpm'ye ayarlanmış çalkalama inkübatörde inkübe edin. Ortalama olarak, fare CNS'nin tam netliğe ulaşması yaklaşık 17 gün sürer. mPACT için, temizleme çözümü adımına kadar psPACT protokolünü izleyin.
Daha sonra, 0.1 molar PBS'de% 8'e ek olarak% 8'e ek olarak, kahverengileşmeyi önleyen bir ajan olan% 0.5 alfa-tiyogliserol içeren doku temizleme solüsyonunu tamamen daldırın. Numuneyi, doku temizlenene kadar 37 santigrat derece ve 150 rpm'ye ayarlanmış çalkalama inkübatörüne yerleştirin. Ortalama olarak, fare CNS'nin mPACT kullanarak tam netlik elde etmesi sadece iki hafta sürer.
Bu çalışmada, mPACT protokolü ile tedavi edilen fare beyin örnekleri, PACT ve psPACT protokolleri ile tedavi edilen örneklerden önce, 14 gün sonra optik şeffaflık elde etti. mPACT ile temizlenen sıçan bütün CNS numuneleri, 20 gün içinde maksimum klerens elde etti. Tüm CNS'nin aksine, tek başına yetişkin sıçan beyinleri, sadece beş gün içinde mPACT ile temizlendi.
Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, uygun şekilde gerçekleştirilirse, farenin tüm CNS'si ile iki hafta içinde yapılabilir. Geliştirilmesinden sonra bu teknik, sinirbilim ve anatomi alanındaki araştırmacıların, memeli CNS modellerinde doku yaralanması, gelişimsel malformasyonlar, kanser ve nörodejeneratif hastalık gibi patofizyolojik hastalıkları keşfetmelerinin yolunu açtı.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, bozulmamış kemirgen merkezi sinir sistemi (CNS) damar ağının optik şeffaflığını artırmak ve mikroskobik analizini kolaylaştırmak için psPACT ve mPACT şeklinde iki yenilikçi metodoloji sunmaktadır. Bu teknikler, bütün CNS dokusuna zarar vermeden hızlıca şeffaflaştırmayı hedefleyerek, Alzheimer hastalığı ve tümörijenez gibi insan hastalık modelleriyle ilgili temel sorulara yanıt vermeyi amaçlamaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Doku şeffaflaştırma teknikleri
- Mikroskobik görüntüleme
Arka Plan
- Çalışma, elektroforetik doku şeffaflaştırmanın sınırlılıklarını vurgulayarak önceki yöntemler üzerine inşa edilmiştir.
- Kemirgen MSS dokusu için hızlı ve etkili şeffaflaştırma süreçlerine olan gereksinim üzerinde durulmaktadır.
- Nörobilimde hem temel araştırmalar hem de klinik etkiler için çözümler sunmaktadır.
Çalışmanın Amacı
- CNS doku şeffaflaştırması için psPACT ve mPACT'yi verimli protokoller olarak geliştirmek ve doğrulamak.
- Nöropatolojik durumları inceleyen araştırmacıların yetkinliklerini genişletmek.
- CNS'deki doku vaskülarizasyonunun daha iyi görselleştirilmesini kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Yöntemler, PACT solüsyonları kullanılarak MSS dokusunun hazırlanması ve berraklaştırılmasına yönelik çok aşamalı bir protokolü içermektedir.
- Temel biyolojik modeller, optik şeffaflığın sağlanmasına odaklanılarak fare ve sıçan MSS örneklerini kapsamaktadır.
- psPACT ile tam berraklığa ulaşmak genellikle yaklaşık 20 gün sürerken, mPACT ile bu süre yaklaşık 14 gündür.
- Polimerizasyon ve berraklaştırma işlemleri için özel solüsyonlar ve inkübasyon ortamları kullanılmaktadır.
Ana Sonuçlar
- mPACT, geleneksel yöntemlere kıyasla doku berraklaştırma süresinde önemli bir azalma sağlar.
- mPACT ile işlem gören örnekler, daha kısa bir sürede optik şeffaflık göstermiş olup, bu durum araştırma uygulamaları için artırılmış verimliliğe işaret etmektedir.
- Tekniklerin, çeşitli nörolojik durumların incelenmesini kolaylaştırmada etkili olduğu kanıtlanmıştır.
Sonuçlar
- Bu çalışma, CNS dokusunun hızlı ve verimli bir şekilde şeffaflaştırılmasını sağlayarak nörobilim alanındaki araştırma kapasitelerini geliştirmektedir.
- Yeni metodolojiler, hastalık mekanizmalarını ve doku hasarını incelemek için değerli araçlar sunmaktadır.
- Geliştirilmiş görüntüleme teknikleri aracılığıyla nörodejeneratif hastalıkların anlaşılması ve patolojik çalışmaların geliştirilmesi konusundaki etkileri oldukça büyüktür.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önemi
psPACT ve mPACT gibi yeni pasif berraklaştırma yöntemleri, tüm MSS dokusunun elektroforetik hasar olmaksızın hızlı ve yüksek sadakatle optik şeffaflığa kavuşmasını sağlayarak nörobilim Ar-Ge'sindeki kritik bir darboğazı gidermektedir. Bu yetenek, hücresel alt yapıları korurken görüntüleme sürelerini hızlandırarak, nörodejeneratif hastalık modellerinde hedef doğrulamasını ve mekanistik risk azaltma süreçlerini destekler. Bu teknikler, nöropatolojik fenotiplerin daha iyi görselleştirilmesi yoluyla Alzheimer, tümör oluşumu ve yaralanma modellerinin preklinik çalışmalarında öngörülebilir güveni artırmaktadır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Hedef etkileşim çalışmaları için hücre altı yapıları ve hücre devrelerini koruyarak, bozulmamış MSS modellerinde terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Elektroforetik berraklaştırma ile ilişkili doku işleme artefaktlarını azaltarak, fenotipik tarama sonuçlarının tekrarlanabilirliğini artırır.
- Öngörücü Değer: Hastalıkla ilgili sistemlerde nörodejeneratif ilerlemenin daha net okumalarını sağlayarak portföy önceliklendirmesini destekler.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Subsellüler biyobelirteçlerin ve yolak modülasyonunun yüksek çözünürlüklü görüntülemesine uygun, standardize ve şeffaf MSS preparatları oluşturur.
- Operasyonel Değer: Özelleşmiş elektroforetik ekipman ihtiyacını ortadan kaldırarak, keşif ekipleri genelinde analiz uygulamasının önündeki engelleri azaltır.
- Ölçeklenebilirlik: mPACT, fare MSS şeffaflığını yaklaşık 14 günde sağlayarak bileşik tarama kampanyaları için öngörülebilir zaman çizelgelerine olanak tanır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Süreklilik: Tümörijenez ve gelişimsel malformasyonların boylamsal çalışmaları için doku bütünlüğünü koruyarak, keşif aşamasından preklinik doğrulamaya sorunsuz geçişi kolaylaştırır.
- Mekanistik Risk Azaltma: Patolojik dokulardaki hücre altı yapıların görselleştirilmesine olanak tanıyarak, hedef mekanizma yorumlamasındaki belirsizliği azaltır.
- Hastalık Modeli Sadakati: Kemirgen türlerinde (fare/sıçan) tutarlı MSS temizleme işlemini destekleyerek, güvenlik farmakolojisi için çalışmalar arası karşılaştırılabilirliği artırır.
İş Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
psPACT ve mPACT, ölçülebilir ve görüntülemeye hazır MSS modelleri sağlayarak hedef doğrulamadan öncü bileşik optimizasyonuna kadar olan süreci destekler ve böylece erken keşif ile preklinik aşamalar arasındaki sürekliliğe uyum sağlar.
- Keşif Biyolojisi: Sağlam dokuda protein ekspresyonunun ve hücre dağılımının 3D haritalaması yoluyla hipotez testine olanak tanıyarak, hastalık modellerindeki yolak etkileşimlerini netleştirir.
- Tarama: Bileşiklerin CNS mimarisi üzerindeki etkilerinin standardize edilmiş değerlendirmesini destekleyen, tekrarlanabilir ve kantitatif doku preparatları sağlar.
- Analitikler: Ekiplerin, iyileştirilmiş sinyal-gürültü oranı ile tedavi koşulları arasındaki yapısal değişiklikleri karşılaştırmalarına olanak tanıyan yüksek çözünürlüklü görüntüleme çıktıları üretir.
- Translasyonel Araştırma: Keşif aşamasından preklinik aşamalara kadar proteomik ve yapısal sürekliliği koruyarak, nörodejenerasyon ve yaralanma modellerinde biyobelirteç uyumluluğunu destekler.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Nöropatoloji üzerine çalışan birden fazla projede uygulanabilen, yeniden kullanılabilir bir CNS berraklaştırma platformu oluşturarak gereksiz yöntem geliştirme süreçlerini azaltır.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Bozulmamış doku görselleştirmesi aracılığıyla mekanistik belirsizliği azaltarak, hedef doğrulamadaki öngörü güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Değişken elektroforetik parametrelerden ve ekipman bağımlılıklarından kaçınarak standardizasyonu ve tekrarlanabilirliği geliştirir.
- Stratejik Değer: MSS hedefli adaylar için preklinik veri üretimini hızlandırarak, devam/dur karar mekanizmasının verimliliğini artırır.
- Portföy Etkisi: Daha hızlı ve net fenotipik okumalar yoluyla, nörodejenerasyon ve onkoloji programlarının riske göre ayarlanmış önceliklendirmesine olanak tanır.
Uygulama Hususları
- Çok aşamalı numune hazırlama sürecini yönetmek için doku histolojisi, hidrojel kimyası ve inkübasyon protokolü uygulaması konularında uzmanlık gerektirir.
- Hidrojel polimerizasyonu ve şeffaflaştırma aşamaları için çalkalamalı inkübatörlere, azot gazı sistemlerine ve sıcaklık kontrollü ortamlara bağımlıdır.
- Laboratuvarlar arası tekrarlanabilirliği sağlamak için çözelti hazırlamanın (örneğin, VA-044, SDS konsantrasyonları) ve zamanlama kontrollerinin ekipler arası standartlaştırılmasına ihtiyaç duyar.
- Kaynak materyalde belirtildiği üzere, CNS dışı dokulara (örneğin, böbrek, dalak) adaptasyon, şeffaflaştırma sürelerinin ve yapısal korunmanın doğrulanmasını gerektirir.
- Pratik sınırlama: Protokolün başarısı, çok sayıda hazırlık aşaması nedeniyle titiz bir uygulamaya bağlıdır; meydana gelebilecek sapmalar, eksik şeffaflaştırma veya doku hasarı riski taşır.
