Suyu Microdilution Vitro tarama: yeni mantar önleyici bileşikler algılamak için kolay ve hızlı bir yöntem

Bu yöntemin genel amacı, klinik laboratuvarlarda kullanılan et suyu mikrodilüsyon duyarlılık testinin bir modifikasyonunu kullanarak potansiyel antifungal bileşiklerin aktivitesini değerlendirmektir. Bu yöntem, mantar önleyici tedavilerin geliştirilmesinde ilk testlerden biri olan doğal veya sentetik bileşiklerin mantar aktivitesini değerlendirmek için kullanılır. Özellikle deneyler otomasyonla gerçekleştiriliyorsa, kısa sürede küçük hacimler kullanan yeni antifungaller için bir başlangıç ekranı için talimatlar sağlıyoruz.

Prosedürü göstermek, laboratuvarımda doktora sonrası araştırmacı olan Daniel Zamith-Miranda olacak. Bu prosedüre, metin protokolünde açıklandığı gibi tahlil için mantar suşlarını büyüterek başlayın. Ertesi gün, konik tüpleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 1200 G'de santrifüjleyerek hücreleri toplayın.

Süpernatanı atın, her tüpe on mililitre PBS ekleyin ve hücreleri yeniden süspanse edin. Oda sıcaklığında beş dakika boyunca 1200 G'de tekrar santrifüjleyin. PBS yıkama ve santrifüjlemeyi iki kez daha tekrarlayın.

Üçüncü yıkamadan sonra, hücreleri beş mililitre çift mukavemetli RPMI 1640 ortamında yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunun bulanıklığına bağlı olarak, bir mikrosantrifüj tüpünde her bir suşun bir mililitresinden 100'e veya bir ila 1000'e kadar seyreltme hazırlayın. Bu seyreltmeden on mikrolitre alın, bir hemositometre odasına yerleştirin ve mikroskop altında dört köşe kadranındaki toplam hücre sayısını sayın.

Her bir hücre süspansiyonunun yoğunluğunu hesapladıktan sonra, stok hücre süspansiyonlarını çift mukavemetli RPMI 1640 ortamında hazırlayın. C. albicans suşları için mililitrede 4.000 hücre ve C.neoformans suşları için mililitrede 20.000 hücre hazırlayın. Lipolize peptitler, eksi 20 santigrat derecede bir kez kullanılmak üzere alikuatlar içinde saklanır ve her deneyden önce sadece deiyonize suda çözülür.

Peptit konsantrasyonu, tahlilde test edilen en yüksek nihai konsantrasyonun iki katı olmalıdır. Referans antifungaller de hazırlanır. Antifungal test, üç kopya ve 96 kuyulu polistiren mikroplakalarda gerçekleştirilir.

Her bir peptidin iki kat seri seyreltilmesi ve antifungalin kontrol edilmesi ve kuyucuk başına 50 mikrolitrelik bir son hacim kullanılması. Protokoldeki en önemli adım seri seyreltmelerdir, bu nedenle tüm analizinizi tehlikeye atacak herhangi bir hatadan kaçınmak için sonraki birkaç adımda çok dikkatli olun. Bir pipet kullanarak, A satırındaki bir ila üç sütunda istenen en yüksek nihai konsantrasyonun çift kuvvet konsantrasyonunda 100 mikrolitre antifungal peptit ekleyin.Çok kanallı bir pipet kullanarak, B ila H sıralarındaki diğer kuyucuklara 50 mikrolitre steril su ekleyin.

Bir sonraki konsantrasyonun karşılık gelen kuyucuklarına aktarın ve birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek homojenize edin. En düşük konsantrasyona sahip kuyucuklara ulaşılana kadar seri seyreltmeyi tekrarlayın ve bu kuyucuklardan 50 mikrolitre atın. A, B ve C satırlarının 11. ve 12. sütunlarını boş denetimler veya negatif büyüme denetimleri için yalnızca su ile bırakın.

RPMI 1640 ortamında 50 mikrolitre çift mukavemetli ayarlı inokulu, bir ila üç sütunun her bir oyuğuna ve ayrıca sütun 11'e ekleyin. C.albicans için nihai konsantrasyon mililitre başına 2.000 hücre olacaktır. C.neoformans için nihai konsantrasyon mililitre başına 10.000 hücre olacaktır.

Antifungal olmadan 50 mikrolitre su ve 50 mikrolitre ayarlanmış inokulumu karıştırarak negatif büyüme kontrolleri hazırlayın. 50 mikrolitre su ve 50 mikrolitre hücresiz ortamı birleştirerek boş kontroller hazırlayın. Kontrolleri uygun kuyulara yükleyin.

Ters çevrilmiş bir optik mikroskop kullanarak tüm kuyucukları gözlemleyin ve ardından plakaları 200 rpm'de çalkalayarak 37 derecede inkübe edin. Kuluçka döneminden sonra, morfolojideki değişiklikleri doğrulamak ve kontaminasyon belirtilerini kontrol etmek için tüm kuyucukları tekrar gözlemleyin. Bir dijital kamera kullanarak her plakanın bir görüntüsünü elde edin.

Bu temsili testte, 100 mikromolar ila nokta yedi sekiz mikromolar arasında değişen konsantrasyonlara sahip üç antimikrobiyal peptit veya AMP, C.neoformans'a karşı antifungal aktivite açısından değerlendirildi. Bir büyüme kontrolü ve bir boşluk dahil edildi. Boş kuyucuklara benzer berrak ortama sahip herhangi bir kuyu pozitif bir sonuç olarak kabul edilirken, negatif büyüme kontrol kuyularına benzer bulanıklığa sahip herhangi bir kuyu negatif olarak kabul edilir.

Minimum inhibitör konsantrasyon veya MIC, inkübasyon süresinin sonunda görünür mantar büyümesini tamamen inhibe eden en düşük antimikrobiyal bileşik konsantrasyonu olarak tanımlandığından, 25 mikromolar AMP1 için MIC olarak kabul edilir. Ve 12 nokta beş mikromolar, AMP2 için MIC. Mantar test edilen tüm konsantrasyonlarda büyüdükçe AMP3'ün yeniden değerlendirilmesi gerekecektir.

Aynı şekilde, C. albicans'a karşı test edilen üç farklı peptit, 50 mikromolar AMP1 için MIC'dir. Altı mikromolar, AMP2 için MIC'dir ve 25 mikromolar, AMP3 için MIC'dir. Muhtemelen seyreltme adımı sırasında yanlış pipetlemeden kaynaklanan kötü bir sonuç örneği, replikalar arasında C. neoformans büyümesindeki farklılıkların mevcut olduğu bu plakadaki C satırının beş ila yedinci sütunlarında gösterilmektedir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik yaklaşık iki saat içinde ve uygun şekilde yapılırsa mantar büyümesi süresi içinde yapılabilir. Test edilen bu moleküllerin fiziksel kimyasal özelliklerinin farkında olmayı unutmayın. Daha sonra, ihtiyaç duyulması durumunda kontrol olarak uygun çözücüler kullanın ve hücreleri her zaman aynı büyüme aşamasında kullanın.

Bu prosedürü takiben, bileşiğin mantar öldürücü veya mantar öldürücü etkiye sahip olup olmadığı gibi ek soruları yanıtlamak için zaman öldürme testi, canlılık boyalarının kullanımı ve ST60 testleri gibi başka yöntemler de gerçekleştirilebilir. Geliştirildikten sonra, bu teknik, tıbbi mikrobiyoloji alanındaki araştırmacıların, antifungal bileşikler arayışında çeşitli doğal veya sentetik bileşik kaynaklarını keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, bir mantar kültürüne nasıl başlanacağını, tahlil için hücrelerin nasıl hazırlanacağını, seri seyreltmelerin nasıl gerçekleştirileceğini ve mantar suşlarını test edilmiş bileşiklerimizle inkübe ettikten sonra sonuçları nasıl okuyacağınızı iyi anlamalısınız.

Mantar patojenleriyle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın. Ve bu prosedür uygulanırken kişisel koruyucu ekipman giymek, biyolojik güvenlik başlığı içinde çalışmak ve uygun güvenlik uygulamalarını kullanmak gibi hazırlıklar yapılmalıdır.