Name: Suyu Microdilution Vitro tarama: yeni mantar önleyici bileşikler algılamak için kolay ve hızlı bir yöntem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Öğrenin, suyu mikrodilüsyon yöntemiyle yeni mantar önleyici bileşikleri hızlı ve kolay bir şekilde nasıl tarayacağınızı. Bu yöntem, Candida ve Cryptococcus türlerine karşı doğal veya sentetik bileşiklerin etkinliğini değerlendirmek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

BURUNLARI-Brezilya, CNPq-Brezilya, FAP/DF mali destek için teşekkür ediyoruz. El yazması gözden geçirilmesi için Dr. Hugo Costa Paes için minnettarız.

1. çözümler ve medya
<ol><li>2 X Roswell Park Memorial Enstitüsü (RPMI) 1640 orta, fosfat tamponlu tuz (PBS), Sabouraud dekstroz suyu ve Sabouraud dekstroz agar Tablo 1göre hazırlayın.</li>
</ol>2. mantar Inoculum büyüme koşulları
<ol><li>İhtiyaç kadar % 35 gliserol-80 ° C'de donmuş hisselerinde olarak tüm mantar suşları depolar.</li>
	<li>Her deneme önce aşağıdaki adımları uygulayın.<ol>
<li>Candida albicans suşları için:<ol>
<li>Bir hisse senedi şişe çözülme ve Sabouraud dekstroz suyu bir kap ve kültür gecede 30 ° C'de ajitasyon (200 devir/dakika) ile bir steril 50 mL polipropilen tüp 10 mL 200 µL aktarmak. Tüp eğim ve kapağı biraz kültür daha iyi havalandırma için açık bırakmak hatırlıyorum.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Cryptococcus neoformans suşları için:<ol>
<li>Hisse senedi bir şişe donmuş yüzeyi kazıyorum. Hücreleri Sabouraud dekstroz agar plakalar üzerine plaka ve 30 ° C'de 48 h için kuluçkaya Sonra görünür büyüme izole kolonileri tabak buzdolabında (4 ° C) ile parafin film 15 gün için kapalı tutun.</li>
			<li>Bir orta ölçekli izole koloni bir steril kürdan veya steril aşı döngü kullanarak plaka toplamak ve Sabouraud dekstroz suyu bir steril 50 mL konik tüp 10 mL aşılamak. Ajitasyon (200 devir/dakika) altında 30 ° C'de yaklaşık 24 h için kuluçkaya.</li>
			<li>24 saat kuluçka fazla olamaz. Tüp eğim ve kapağı biraz daha iyi havalandırma için açık bırakmak hatırlıyorum. Bu Antimikrobiyal direnç etkileyen önemli bir faktör olduğu için önce her test hücreleri büyüme aşamasında standardize etmek her zaman iyidir. Not: Her iki mantarlar bizim deneylerde hızlı yayılma için 30 ° C'de yetiştirilmiştir ancak sıcaklık çalışma, örneğin klinik tedavi (37 ° C) amaçlarını yansıtacak şekilde değiştirilebilir. En önemlisi, bu ilk kuluçka süresi önceden her mantar izole etmek için kurulan ve tekrarlanabilirlik emin olmak için tüm testler muhafaza gerekir.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sonra mantar büyüme, konik tüpler 1200 x g oda sıcaklığında 5 min için de centrifuging tarafından hücreleri toplamak. Süpernatant atın ve PBS 10 mL ekleyin.</li>
	<li>Hücreleri ve santrifüj 1200 x g oda sıcaklığında 5 min için de tekrar resuspend.</li>
	<li>PBS yıkama ve aralıklarla iki kez daha tekrarlayın. Sonra üçüncü yıkama, 2 X RPMI-1640 orta 5 mL (göre Pelet boyutu) hücrelerde resuspend.</li>
	<li>1 mL 1: 100 veya 1:1,000 seyreltme (bağlı olarak hücre süspansiyon bulanıklık) bir microcentrifuge tüp hazırlayın.</li>
	<li>Bu seyreltme aliquot 10 µL hemasitometre odasında yerleştirin ve dört köşe çeyrek dairelerin mikroskop altında hücrelerde toplam sayısını saymak. Konsantrasyonu formülüne göre hesaplamak: (Toplam cep numarası/4) x seyreltme faktörü x 104 (odası seyreltme Sabit).<ol>
<li>% 100 canlılığı canlılığı sayar ve büyüme koşulları sistematik olarak okudu izole etmek için korelasyon düşünün. Not: Arka-kaplama uygun olarak Mayalar10 için antimikrobiyal duyarlılık testi (EUCAST) antifungal Minimum inhibitör konsantrasyonu (MIC) yöntemi Avrupa Komitesi tarafından standardizasyon ve kalite kontrol canlılığı sayıları yapılabilir .</li>
		<li>Büyüme/canlılığı korelasyon altında eğitim izole etmek için kurulmuştur değil, bir hemasitometre phloxine B11, trypan mavi gibi ölü hücreleri seçerek renk boya yardımı ile canlı hücrelerde sayarak mantar canlılığı ölçmek 12, veya Janus yeşil13. Mantar hücreleri yalnızca canlılık bu noktada nüfusunun % 90'ı ise veya yukarıda bu iletişim kuralı için kullan. Not: Ölü/canlı boyalar de seçim mantar ile çalışmayabilir. Lütfen onları kullanmadan önce sınayın. Örneğin, trypan mavi boya de C. neoformansile çalışmaz.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bundan sonra hücre süspansiyonlar 2 X RPMI-1640 ortamda hazırlamak (2 X düzeltilmiş RPMI-1640 orta inoculum). 96-şey plakalar için her plaka için 5 mL hacmi göz önünde bulundurun.<ol>
<li>Tüm C. albicans suşları için 4 x 103 hücre/mL bir hisse senedi hücre süspansiyon hazırlamak. Bu 2 X her iyi (2 x 103 hücre/mL) son hücre konsantrasyon bölgedir.</li>
		<li>C. neoformans suşları için hücreleri 2 x 104 hücre/mL stok kültürünün hazırlayın. Bu iki kez her şey (1 x 104 hücre/mL) son hücre konsantrasyon bölgedir.</li>
		<li>Hangi konsantrasyon kuluçka süresi ile ilgili olarak belirli çalışma için ideal olacak bilinen bir antifungal ile diğer mantarlar için sınayın. Metabolizma ve çoğaltma zaman mantar göz önünde bulundurun.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. peptidler (bilinmeyen Aracısı)
<ol><li>-20 ° C'de lyophilized peptidler depolamak ve onları her deneme önce deiyonize su geçiyoruz. Bir kez suda en fazla saklama süresi her peptid niteliğine bağlıdır.</li>
	<li>İki kez tahlil (2 X) test en son yoğun aliquots hazırlayın. İdeal olarak, aliquots ile yeterli peptid donma-çözülme döngüsü önlemek tek seferlik kullanım için az sayıda hazır olun. Not: Seçtiğiniz toplama bir edebiyat ve peptid özelliklerini dayanmalıdır. Bu seri dilutions peptid, yaklaşık 100 µM ile başlamak ve daha sonra azaltmak veya bağlı olarak elde edilen sonuçları bu konsantrasyon aralığı artırmak için önerilir.</li>
</ol>4. başvuru Antifungaller (pozitif denetimleri)
<ol><li>Bu suda seyreltilmiş için: en yüksek konsantrasyon analizi 2 X çözeltisi hazırlamak (bkz. Bölüm 5: Antifungal tahlil seyreltme adımları için).<ol>
<li>C. albicans suşları için bir çözüm Flukonazol 128 µg/mL veya 128 µg/mL caspofungin hazırlayın. Her ikisi için de plaka konsantrasyon 64 µg/mL olacaktır.</li>
		<li>C. neoformans suşları için bir çözüm olarak 32 µg/mL amfoterisin b (suda çözünen çözelti) hazırlayın. Plaka konsantrasyon 16 µg/mL olacaktır. Not: Bu anti-mantar kötü suda çözünür olduğundan normal Amfoterisin B Dimetil sülfoksit (DMSO), seyreltilmiş. Ancak, piyasada bulunan suda çözünen Amfoterisin B hazırlıklar vardır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Organik bir çözücü içinde seyreltilmiş Antifungaller için: 100 X hisse senedi DMSO çözümde hazırlamak, sonra su kullanmak için 10 X oranında seyreltin. Not: Böylece, kuyuda, DMSO son konsantrasyonu % 1'i geçmeyecektir. Verilen bu bazı mantarlar iyi çözücü bu konsantrasyon tahammül yok nerede mantar %1 DMSO denetimi olarak içeren medya artacak bir de gereklidir. DMSO ışığa duyarlı olduğunu unutmayın, bu yüzden plaka folyo ile kapak veya kuluçka dönemi süresince karanlık bir odaya yerleştirin.</li>
</ol>5. antifungal tahlil
Not: Vitro antifungal deneyleri suyu microdilution duyarlılık testi bazı değişiklikler klinik ve laboratuvar Standartları Enstitüsü (CLSI) M27-A3 kurallarına göre gerçekleştirilir.
<ol><li>İki kat seri seyreltme her peptid, hazırlamak ve antifungal son hacmiyle 50 µL 96-şey polistren Mikroplaka içinde kontrol.<ol>
<li>Bir pipet kullanarak ekleyin antifungal/peptid 2 X konsantrasyon en yüksek 100 µL istediğiniz sütundaki son konsantrasyonu 1-3, içinde satır A.</li>
		<li>Bir çok kanallı pipet kullanarak, steril su 50 µL diğer wells, satırların H. B ekleyin.</li>
		<li>Wells en yüksek konsantrasyon (a satır) ile 50 µL kaldırmak, iyi bir sonraki konsantrasyonu (satır B) diğerine aktarmak ve homojenize.</li>
		<li>Kadar iyi en düşük konsantrasyon ile yukarıdaki adımları tekrarlayın ve bu iyi (satır H) 50 µL atın. Sütunları 11 ve 12 (satır A, B, C) boş denetim veya negatif/büyüme kontrol için sadece su ile bırakın.</li>
		<li>50 µL ayarlanan inoculum X 2 RPMI-1640 ortamda her şey (sütun 1-3 artı sütun 11 (negatif/büyüme denetimi)); ekleyin. C. neoformans suşları 104 hücre/mL olacaktır son konsantrasyonu C. albicans için 2 x 103 hücre/mL ve nihai toplama olacaktır.</li>
		<li>Boş denetimleri hazırlamak (50 µL su + 50 µL 2 X RPMI-1640 orta hücreleri olmadan) ve negatif/büyüme kontrol (50 µL su + 50 µL ayarlanabilir inoculum 2 X RPMI-1640 orta antifungal olmadan) ve yük içine iyi plaka yukarıda açıklandığı gibi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Test edilecek her bileşik için prosedür ve seçilen antifungal denetim (sütunlar 4-10) yineleyin. Not: Seri dilutions dikey olarak aşağıdaki deney olarak veya yatay olarak plaka (dilutions ekstresinin verilen bileşik/test edilmesi gereken sayısı sekiz veya daha fazla iseYani, ) yapılabilir.<ol>
<li>Bileşikler başvurursanız uyuşturucu, ya da herhangi bir bileşen ışığa duyarlı, düşük ışıkta tahlil yapmak, folyo ile kuruyucu veya karanlık bir odaya incubations sırasında yer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aşağıdaki isteğe bağlı önerileri göz önünde bulundurun.<ol>
<li>Bu yardımcı olur buharlaşma azaltmak gibi gaz değişimi, izin veren bir açık kapak plakasını ile plaka mühür.</li>
		<li>Plaka nemli bir odaya yerleştirin; Ayrıca buharlaşma azaltmak yardımcı olacaktır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Plakayı 37 ° C'de 24 saat veya 48 h 48 h ve tüm C. albicans suşları için 200 C. neoformansiçin sallayarak RPM kuluçkaya. Alt son hacim (100 µL) hiçbir yayılma oluştuğunu sağlar. Not: 24 h mikrofon ölçümlere ve C. albicans suşları için 48 h arasında anlamlı bir fark gözlendi. Yine de, okuma, 48 h görselleştirmek kolaydır.</li>
	<li>Morfoloji de bulaşma belirtileri kontrol olarak değişiklikleri doğrulamak için kuluçka dönemi önce ve sonra ters bir optik mikroskobu yardımı ile tüm wells, gözlemlemek. Not: Okuma görsel olarak yapılır ve deneme sonunda fotoğraflandı. Her okumadan önce biraz plaka lunaparkçı. Okur da onun OD 600 ölçerek gerçekleştirilebilir hücre kümeler Eğer nm, ya da filamentation değil görülmektedir.</li>
	<li>Deneyler en az üç kez ayrı tarihlerde gerçekleştirin.</li>
</ol>

<ol><li>Armstrong-James, D., Meintjes, G., Brown, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neglected+epidemic%3A+fungal+infections+in+HIV%2FAIDS%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A neglected epidemic: fungal infections in HIV/AIDS.</a> Trends Microbiol. 22 (3), 120-127 (2014).</li>
<li>Romani, L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21394104">Immunity to fungal infections.</a> Nat Rev Immunol. 11 (4), 275-288 (2011).</li>
<li>Pfaller, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antifungal+drug+resistance%3A+mechanisms%2C+epidemiology%2C+and+consequences+for+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Med%22%5BJournal%5D)">Antifungal drug resistance: mechanisms, epidemiology, and consequences for treatment.</a> Am J Med. 125 (1 Suppl), S3-S13 (2012).</li>
<li>Hancock, R. E., Diamond, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+cationic+antimicrobial+peptides+in+innate+host+defences%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The role of cationic antimicrobial peptides in innate host defences.</a> Trends Microbiol. 8 (9), 402-410 (2000).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Snake+cathelicidin+from+Bungarus+fasciatus+is+a+potent+peptide+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Snake cathelicidin from Bungarus fasciatus is a potent peptide antibiotics.</a> PLoS One. 3 (9), e3217(2008).</li>
<li>Du, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AaeAP1+and+AaeAP2%3A+novel+antimicrobial+peptides+from+the+venom+of+the+scorpion%2C+Androctonus+aeneas%3A+structural+characterisation%2C+molecular+cloning+of+biosynthetic+precursor-encoding+cDNAs+and+engineering+of+analogues+with+enhanced+antimicrobial+and+anticancer+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Toxins+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">AaeAP1 and AaeAP2: novel antimicrobial peptides from the venom of the scorpion, Androctonus aeneas: structural characterisation, molecular cloning of biosynthetic precursor-encoding cDNAs and engineering of analogues with enhanced antimicrobial and anticancer activities.</a> Toxins (Basel). 7 (2), 219-237 (2015).</li>
<li>Benincasa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fungicidal+activity+of+five+cathelicidin+peptides+against+clinically+isolated+yeasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemother%22%5BJournal%5D)">Fungicidal activity of five cathelicidin peptides against clinically isolated yeasts.</a> J Antimicrob Chemother. 58 (5), 950-959 (2006).</li>
<li>CLSI. <a target="_blank" href="https://clsi.org/standards/products/microbiology/documents/m27s/">Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibiliy Testing of Yeasts; Approved Standard -Third Edition. CLSI document M27-A3</a>. , Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2008).</li>
<li>Guilhelmelli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+of+Scorpion+Venom-Derived+Antifungal+Peptides+against+Planktonic+Cells+of+Candida+spp.+and+Cryptococcus+neoformans+and+Candida+albicans+Biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Activity of Scorpion Venom-Derived Antifungal Peptides against Planktonic Cells of Candida spp. and Cryptococcus neoformans and Candida albicans Biofilms.</a> Front Microbiol. 7, 1844(2016).</li>
<li>The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Method for the determination of broth dilution minimum inhibitory concentrations of antifungal agents for yeasts, version, 7.3.1 2017. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST_files/AFST/Files/EUCAST_E_Def_7_3_1_Yeast_testing__definitive.pdf">http://www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST_files/AFST/Files/EUCAST_E_Def_7_3_1_Yeast_testing__definitive.pdf</a> (2017).</li>
<li>Roongruangsree, U. T., Kjerulf-Jensen, C., Olson, L. W., Lange, L. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1439-0434.1988.tb04474.x/full">Viability Tests for Thick Walled Fungal Spores (ex: Oospores of Peronospora manshurica).</a> Journal of Phytopathology. 123 (3), 244-252 (1988).</li>
<li>Boedijn, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypan+blue+as+stain+for+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Stain+Technol%22%5BJournal%5D)">Trypan blue as stain for fungi.</a> Stain Technol. 31 (3), 115-116 (1956).</li>
<li>Goihman-Yahr, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+plating+efficiency+and+estimation+of+viability+of+suspensions+of+Paracoccidioides+brasiliensis+yeast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mycopathologia%22%5BJournal%5D)">Studies on plating efficiency and estimation of viability of suspensions of Paracoccidioides brasiliensis yeast cells.</a> Mycopathologia. 71 (2), 73-83 (1980).</li>
<li>Tati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histatin+5-spermidine+conjugates+have+enhanced+fungicidal+activity+and+efficacy+as+a+topical+therapeutic+for+oral+candidiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Histatin 5-spermidine conjugates have enhanced fungicidal activity and efficacy as a topical therapeutic for oral candidiasis.</a> Antimicrob Agents Chemother. 58 (2), 756-766 (2014).</li>
<li>Petrou, M. A., Shanson, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Susceptibility+of+Cryptococcus+neoformans+by+the+NCCLS+microdilution+and+Etest+methods+using+five+defined+media%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemother%22%5BJournal%5D)">Susceptibility of Cryptococcus neoformans by the NCCLS microdilution and Etest methods using five defined media.</a> J Antimicrob Chemother. 46 (5), 815-818 (2000).</li>
<li>Zaragoza, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Process+analysis+of+variables+for+standardization+of+antifungal+susceptibility+testing+of+nonfermentative+yeasts%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Process analysis of variables for standardization of antifungal susceptibility testing of nonfermentative yeasts.</a> Antimicrob Agents Chemother. 55 (4), 1563-1570 (2011).</li>
<li>Rodriguez-Tudela, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+shaking+on+antifungal+susceptibility+testing+of+Cryptococcus+neoformans%3A+a+comparison+of+the+NCCLS+standard+M27A+medium%2C+buffered+yeast+nitrogen+base%2C+and+RPMI-2%25+glucose%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Influence of shaking on antifungal susceptibility testing of Cryptococcus neoformans: a comparison of the NCCLS standard M27A medium, buffered yeast nitrogen base, and RPMI-2% glucose.</a> Antimicrob Agents Chemother. 44 (2), 400-404 (2000).</li>
<li>Beggs, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+phase+in+relation+to+ketoconazole+and+miconazole+susceptibilities+of+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Growth phase in relation to ketoconazole and miconazole susceptibilities of Candida albicans.</a> Antimicrob Agents Chemother. 25 (3), 316-318 (1984).</li>
<li>Alcouloumre, M. S., Ghannoum, M. A., Ibrahim, A. S., Selsted, M. E., Edwards, J. E. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fungicidal+properties+of+defensin+NP-1+and+activity+against+Cryptococcus+neoformans+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Fungicidal properties of defensin NP-1 and activity against Cryptococcus neoformans in vitro.</a> Antimicrob Agents Chemother. 37 (12), 2628-2632 (1993).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Microdilution testleri bir hedef bahçedeki küçük miktarlarda kullanarak bileşik potansiyel antifungal etkinliğini analiz ve aynı zamanda konsantrasyonları bir dizi test. Buna göre bu iletişim kuralı tarama potansiyel yeni mantar önleyici bileşikler için bir ilk adım olarak önerilir. Burada sunulan Protokolü başlangıçta klinikler, antifungal tedavi seçiminde yardımcı olmak için tasarlanmış M27-A3 Protokolü dayanmaktadır ve yeni mantar önleyici bileşikler çeşitli için adapte edilebilir. Genel olarak, bu iletişim kuralını ö...

Mantar enfeksiyonları haline gelmiştir önemli bir tıbbi endişe son yıllarda önemli ölçüde ana toprak dolay iden bu kanser tedavisi ve HIV/AIDS ile yaşayan geçiyor gibi immün sayisi bir artış artış veya organ1,2nakledilmektedir. Ancak, çok sınırlı bir dizi kullanılabilir antifungal ilaçların ve onlara mantar direnç raporlarda artan sayıda büyük sorunlar sistemik Mikozlar3tedavi ile ilgili katkıda bulunur.
Yeni mantar önleyici bileşikler potansiyel kaynağı antimikrobiyal peptidler (Amper), enfeksiyon4onların doğuştan gelen bağışıklık yanıtı parçası olarak çoğu organizma tarafından üretilen küçük Katyonik peptidler vardır. Yine de, bu bileşiklerin mantar patojenlere karşı test etmek için tarama yöntemi standart değil. Farklı yordamlar aynı modeli mikroorganizma5,6,7bazen amper, antifungal faaliyetten değerlendirmek için kullanılmaktadır. Bu farklılıklar ve ayrıntılı olarak bazı protokoller eksikliği engellemektedir ve bileşikleri tekrarlanabilirlik arasında karşılaştırmalar karıştırmak.
Yeni ilaç adaylarının test standart hale getirmek için bir yol antifungal duyarlılık gibi klinik klinik ayarları tanımlamak için kullanılan kurallar ve laboratuvar Standartları Enstitüsü (CLSI) M27-A3 yönergeleri takip etmektir. Ancak, bu antifungal duyarlılık testleri fazla kısıtlayıcıdır ve onlar sadece birkaç seçim maddeleri için kuruldu gibi metabolizma dikkate varyasyon içine türler arasında yapmayız. Örneğin, onlar sigara fermantasyon Mayalar metabolik ihtiyaçlarını dikkate almayın.
Bu iletişim kuralı değerlendirme faaliyet potansiyel antifungal bileşiklerin sağlar ve burada aramak için antifungal peptidler uygulanır. Suyu microdilution duyarlılık testi yeni bileşikler8,9tarama en iyi duruma getirme değişiklikler CLSI M27-A3 kurallarına dayanmaktadır. Bu değişiklikler sonuçları başvuru Antifungaller denetimleri olarak kullanımı ile standartlaştırılması ise en iyi ön-test büyüme için az miktarda bileşik, sıcaklık veya ilk inoculum ve farklı medya kullanımı için izin verir. Bu yöntemle çok iyi kültür Kaplamalar, kullanımı hızla ve güvenle bileşikler çok sayıda ekran olanak sağlar.
Doğal esnekliği nedeniyle bu protokolü farklı kimyasal sınıflar bileşiklerin ve birkaç uyarlamalar ile diğer mikroorganizmalar karşı kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td><güçlü>Ortam ve Reaktifler</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 l-glutamin içeren ortam, sodyum bikarbonat içermez</td><td>Thermo Fisher</td><td>31800-022</td><td></td></tr><tr><td>3-(N-morfolino) propan sülfonik asit (MOPS) (o que a gente usa tem um s&oacute; dio, completa o nome dele lütfen)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>2X RPMI ortamını tamponlamak için kullanın</td></tr><tr><td>Sodyum klorür (NaCl)</td><td>Din&acirc; mika</td><td>1528-1</td><td>Fosfat tamponlu salin (PBS) için 137 mM)</td></tr><tr><td>Potasyum klorür (KCl)</td><td>J.T.Baker</td><td>3040-01</td><td>Fosfat tamponlu salin (PBS) için 2.7 mM)</td></tr><tr><td>Sodyum fosfat dibazik (Na2HPO4)</td>Fosfat <td>tamponlu salin (PBS) için</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>V000129</td> 10 mM)</tr><tr><td>Potasyum dihidrojen fosfat (KH2PO4)</td>Fosfat tamponlu salin (PBS) için <td>Sigma-Aldrich</td><td>60230</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>BD Difco Sabouraud dekstroz suyu</td><td>BD</td><td>238230</td><td></td></tr><tr><td>BD Difco Sabouraud Dekstroz Agar</td><td>BD</td><td>210950</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V000123</td><td>%35 (solu&ccedil; &atilde; O de estoque? Criopreserva&ccedil; &atilde; o?)</td></tr><tr><td>Steril su</td><td></td><td></td><td>Para dilui&ccedil; &atilde; o das drogas na dilui&ccedil; &atilde; o seriada</td></tr><tr><td><güçlü>Antifungal ilaçlar</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amfoterisin B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>Flukonazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8929</td><td></td></tr><tr><td>Kapofungin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PHR1160</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Plastikler</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL konik tüp</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>Çanak petri</td><td>J.Prolab</td><td>0304-5</td><td></td></tr><tr><td>96 kuyulu plaka</td><td>Corning</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>Steril Çözelti Rezervuarı</td><td>KASVI</td><td>K30-208</td> Çok kanallı pippetEkipman ve diğer malzemeler</güçlü><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optik mikroskop</td><td>Nikon kullanarak çözümleri pippet etmek için kullanın</td><td>E200MV</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Thermo Fisher</td><td>MegaFuge 16R</td><td></td></tr><tr><td>İnkübatör</td><td>Ethik Teknolojisi</td><td>403-3D</td><td>37 & deg'e ayarlandı; C</td></tr><tr><td>Shaker</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>Excella E25</td><td>37&deg'e ayarlandı; C, 200 RPM</td></tr><tr><td>Hücre sayma odası, Neubauer</td><td>BOECO Almanya</td><td>BOE 13</td><td></td></tr><tr><td>Çok kanallı pipet</td><td>HTL</td><td>5123</td><td></td></tr></tbody></table>

suyu microdilution vitro tarama: yeni mantar önleyici bileşikler algılamak için kolay ve hızlı bir yöntem

Broth Microdilution In Vitro Screening: An Easy and Fast Method to Detect New Antifungal Compounds

Mantar enfeksiyonları son yıllarda önemli bir sağlık sorunu haline gelmiştir, ancak kullanılabilir antifungal ilaçlar sayısı sınırlıdır. Bu senaryoda, yeni antifungal ilaçlar için arama gereklidir. Rapor burada protokol ekran peptidler bir yönteme antifungal özellikleri için ayrıntıları. Suyu microdilution duyarlılık testi olarak potansiyel yeni Antifungaller antimikrobiyal peptidler araştırma uygun değişiklikler klinik ve laboratuvar Standartları Enstitüsü (CLSI) M27-A3 kurallarına dayanmaktadır. Bu iletişim kuralı antifungal bileşikler etkinliğini değerlendirmek için işlevsel bir tahlil açıklar ve soruşturma altında moleküllerin belirli herhangi bir sınıf uyacak şekilde kolayca değiştirilebilir. Deneyleri 96-şey levha küçük birimleri kullanarak gerçekleştirilen bu yana, büyük ölçekli bir tarama zaman, kısa bir miktarda Eğer özellikle bir otomasyon ortamda yürütülen tamamlanabilir. Bu yordamı bir standart ve ayarlanabilir klinik protokol Mantar hastalıkları tedavi geliştirmek için yeni moleküller tezgah-iş arayışı nasıl yardımcı gösterilmiştir.

Mikrofon tamamen kuluçka dönemi sonundaki görünür mantar büyümesini engeller en düşük antimikrobiyal bileşik toplama olarak tanımlanır. Amacı bu iletişim kuralı, ekran potansiyel Antifungaller hızlı bir yönteme sahip olduğundan, herhangi bir şey ile bulanıklık negatif/büyüme denetim wells için benzer ise herhangi bir şey ile açık kitle iletişim araçları için boş wells benzer olumlu bir sonuç olarak kabul edilir negatif olarak kabul. Ancak, belirli bir AMP fungistatic veya mantar olduğunu ...

Mantar önleyici bileşikler ve özleri süzmek için bir kolay ve uyarlanabilir suyu microdilution yöntem.

Suyu Microdilution Vitro tarama: yeni mantar önleyici bileşikler algılamak için kolay ve hızlı bir yöntem

Fungal infections have become an important medical condition in the last decades, but the number of available antifungal drugs is limited. In this ...

Bu yöntemin genel amacı, klinik laboratuvarlarda kullanılan et suyu mikrodilüsyon duyarlılık testinin bir modifikasyonunu kullanarak potansiyel antifungal bileşiklerin aktivitesini değerlendirmektir. Bu yöntem, mantar önleyici tedavilerin geliştirilmesinde ilk testlerden biri olan doğal veya sentetik bileşiklerin mantar aktivitesini değerlendirmek için kullanılır. Özellikle deneyler otomasyonla gerçekleştiriliyorsa, kısa sürede küçük hacimler kullanan yeni antifungaller için bir başlangıç ekranı için talimatlar sağlıyoruz.Prosedürü göstermek, laboratuvarımda doktora sonrası araştırmacı olan Daniel Zamith-Miranda olacak. Bu prosedüre, metin protokolünde açıklandığı gibi tahlil için mantar suşlarını büyüterek başlayın. Ertesi gün, konik tüpleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 1200 G'de santrifüjleyerek hücreleri toplayın.Süpernatanı atın, her tüpe on mililitre PBS ekleyin ve hücreleri yeniden süspanse edin. Oda sıcaklığında beş dakika boyunca 1200 G'de tekrar santrifüjleyin. PBS yıkama ve santrifüjlemeyi iki kez daha tekrarlayın.Üçüncü yıkamadan sonra, hücreleri beş mililitre çift mukavemetli RPMI 1640 ortamında yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunun bulanıklığına bağlı olarak, bir mikrosantrifüj tüpünde her bir suşun bir mililitresinden 100'e veya bir ila 1000'e kadar seyreltme hazırlayın. Bu seyreltmeden on mikrolitre alın, bir hemositometre odasına yerleştirin ve mikroskop altında dört köşe kadranındaki toplam hücre sayısını sayın.Her bir hücre süspansiyonunun yoğunluğunu hesapladıktan sonra, stok hücre süspansiyonlarını çift mukavemetli RPMI 1640 ortamında hazırlayın. C. albicans suşları için mililitrede 4.000 hücre ve C.neoformans suşları için mililitrede 20.000 hücre hazırlayın. Lipolize peptitler, eksi 20 santigrat derecede bir kez kullanılmak üzere alikuatlar içinde saklanır ve her deneyden önce sadece deiyonize suda çözülür.Peptit konsantrasyonu, tahlilde test edilen en yüksek nihai konsantrasyonun iki katı olmalıdır. Referans antifungaller de hazırlanır. Antifungal test, üç kopya ve 96 kuyulu polistiren mikroplakalarda gerçekleştirilir.Her bir peptidin iki kat seri seyreltilmesi ve antifungalin kontrol edilmesi ve kuyucuk başına 50 mikrolitrelik bir son hacim kullanılması. Protokoldeki en önemli adım seri seyreltmelerdir, bu nedenle tüm analizinizi tehlikeye atacak herhangi bir hatadan kaçınmak için sonraki birkaç adımda çok dikkatli olun. Bir pipet kullanarak, A satırındaki bir ila üç sütunda istenen en yüksek nihai konsantrasyonun çift kuvvet konsantrasyonunda 100 mikrolitre antifungal peptit ekleyin.Çok kanallı bir pipet kullanarak, B ila H sıralarındaki diğer kuyucuklara 50 mikrolitre steril su ekleyin.Bir sonraki konsantrasyonun karşılık gelen kuyucuklarına aktarın ve birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek homojenize edin. En düşük konsantrasyona sahip kuyucuklara ulaşılana kadar seri seyreltmeyi tekrarlayın ve bu kuyucuklardan 50 mikrolitre atın. A, B ve C satırlarının 11. ve 12. sütunlarını boş denetimler veya negatif büyüme denetimleri için yalnızca su ile bırakın.RPMI 1640 ortamında 50 mikrolitre çift mukavemetli ayarlı inokulu, bir ila üç sütunun her bir oyuğuna ve ayrıca sütun 11'e ekleyin. C.albicans için nihai konsantrasyon mililitre başına 2.000 hücre olacaktır. C.neoformans için nihai konsantrasyon mililitre başına 10.000 hücre olacaktır.Antifungal olmadan 50 mikrolitre su ve 50 mikrolitre ayarlanmış inokulumu karıştırarak negatif büyüme kontrolleri hazırlayın. 50 mikrolitre su ve 50 mikrolitre hücresiz ortamı birleştirerek boş kontroller hazırlayın. Kontrolleri uygun kuyulara yükleyin.Ters çevrilmiş bir optik mikroskop kullanarak tüm kuyucukları gözlemleyin ve ardından plakaları 200 rpm'de çalkalayarak 37 derecede inkübe edin. Kuluçka döneminden sonra, morfolojideki değişiklikleri doğrulamak ve kontaminasyon belirtilerini kontrol etmek için tüm kuyucukları tekrar gözlemleyin. Bir dijital kamera kullanarak her plakanın bir görüntüsünü elde edin.Bu temsili testte, 100 mikromolar ila nokta yedi sekiz mikromolar arasında değişen konsantrasyonlara sahip üç antimikrobiyal peptit veya AMP, C.neoformans'a karşı antifungal aktivite açısından değerlendirildi. Bir büyüme kontrolü ve bir boşluk dahil edildi. Boş kuyucuklara benzer berrak ortama sahip herhangi bir kuyu pozitif bir sonuç olarak kabul edilirken, negatif büyüme kontrol kuyularına benzer bulanıklığa sahip herhangi bir kuyu negatif olarak kabul edilir.Minimum inhibitör konsantrasyon veya MIC, inkübasyon süresinin sonunda görünür mantar büyümesini tamamen inhibe eden en düşük antimikrobiyal bileşik konsantrasyonu olarak tanımlandığından, 25 mikromolar AMP1 için MIC olarak kabul edilir. Ve 12 nokta beş mikromolar, AMP2 için MIC. Mantar test edilen tüm konsantrasyonlarda büyüdükçe AMP3'ün yeniden değerlendirilmesi gerekecektir.Aynı şekilde, C. albicans'a karşı test edilen üç farklı peptit, 50 mikromolar AMP1 için MIC'dir. Altı mikromolar, AMP2 için MIC'dir ve 25 mikromolar, AMP3 için MIC'dir. Muhtemelen seyreltme adımı sırasında yanlış pipetlemeden kaynaklanan kötü bir sonuç örneği, replikalar arasında C. neoformans büyümesindeki farklılıkların mevcut olduğu bu plakadaki C satırının beş ila yedinci sütunlarında gösterilmektedir.Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik yaklaşık iki saat içinde ve uygun şekilde yapılırsa mantar büyümesi süresi içinde yapılabilir. Test edilen bu moleküllerin fiziksel kimyasal özelliklerinin farkında olmayı unutmayın. Daha sonra, ihtiyaç duyulması durumunda kontrol olarak uygun çözücüler kullanın ve hücreleri her zaman aynı büyüme aşamasında kullanın.Bu prosedürü takiben, bileşiğin mantar öldürücü veya mantar öldürücü etkiye sahip olup olmadığı gibi ek soruları yanıtlamak için zaman öldürme testi, canlılık boyalarının kullanımı ve ST60 testleri gibi başka yöntemler de gerçekleştirilebilir. Geliştirildikten sonra, bu teknik, tıbbi mikrobiyoloji alanındaki araştırmacıların, antifungal bileşikler arayışında çeşitli doğal veya sentetik bileşik kaynaklarını keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, bir mantar kültürüne nasıl başlanacağını, tahlil için hücrelerin nasıl hazırlanacağını, seri seyreltmelerin nasıl gerçekleştirileceğini ve mantar suşlarını test edilmiş bileşiklerimizle inkübe ettikten sonra sonuçları nasıl okuyacağınızı iyi anlamalısınız.Mantar patojenleriyle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın. Ve bu prosedür uygulanırken kişisel koruyucu ekipman giymek, biyolojik güvenlik başlığı içinde çalışmak ve uygun güvenlik uygulamalarını kullanmak gibi hazırlıklar yapılmalıdır.

broth-microdilution-vitro-screening-an-easy-fast-method-to-detect-new

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz oluşumu için basit, hızlı ve sağlam bir bir yöntem...

İzleme Oluşumu ve Antifungal Duyarlılık Testi için 96 Şey microtiter Levha tabanlı Yöntemi Candida albicans Biyofilmler

Biz 3D nano-biyofilm oluşan yüksek yoğunluklu mikroarray platformu...

Yüksek verim Antifungal İlaç Tarama Candida albicans Biyofilm Chip (Ca BChip)

Kaynak: Koeth, LM, et. al., Aerobik Olarak Büyüyen Bakterilerin Dalbavancin İn Vitro Duyarlılık Testi için Bir Referans Et Suyu Mikroseyreltme Yöntemi. J. Vis. Uzm. (2015).Bu video, Gram pozitif bakterilere karşı bir lipoglikopeptid antibiyotiğin minimum inhibitör konsantrasyonunu (MIC) belirlemek için et suyu mikroseyreltme yöntemini göstermektedir. Bakteri kolonisi izolasyonu, seyreltme, değişen antibiyotik konsantrasyonları ile mikroplaka kuyularının aşılanması ve kültür saflığının ve hücre...

Gram Pozitif Bakterilerin Antibiyotik Duyarlılık Testi İçin Bir Et Suyu Mikrodilüsyon Yöntemi

Bu video, bir et suyu mikrodilüsyon testi kullanarak antifungal bileşikleri taramak için bir in vitro testi göstermektedir. Test bileşikleri, bir mikrotitre plakasında seri olarak seyreltilir ve bir mantar aşısı ile inkübe edilir. İnkübasyon sonrası, plaka, test bileşiklerinin antifungal potansiyelini ve minimum inhibitör konsantrasyonlarını (MIC) değerlendirmek için görünür mantar büyümesi olmayan kuyucuklar için incelenir.

Antifungal Bileşiklerin Taranması için İn Vitro Et Suyu Mikrodilüsyon Testi

Burada, küçük müdahale eden sentetik RNA (siRNA), kimyasal bileşik ve Mycobacterium tuberculosis mutant kütüphanelerinin Yüksek verimli / Yüksek içerikli ekranları için geçerli olan fenotipik bir test açıklıyoruz. Bu yöntem, otomatik konfokal mikroskopi kullanılarak floresan etiketli konak hücre içinde floresan etiketli Mycobacterium tuberculosis'in tespitine dayanır.

Yüksek Verimli/Yüksek İçerikli Taramaya Uyarlanmış Hücre İçi Mikobakterilerin Nicelleştirilmesi için Mikroskobik Fenotipik Bir Tahlil

Burada, bir et suyu mikrodilüsyon referans metodolojisi kullanarak klinik olarak anlamlı Gram-pozitif bakterilerin dalbavansin duyarlılığının belirlenmesi için bir protokol sunuyoruz.

Dalbavansin için Başvuru sıvı mikrodilüsyon yöntemi<em&gt; İn Vitro</emAerobik Olarak Büyüyen Bakterilerin&gt; Duyarlılık Testi

Burada, antimikrobiyal aktivite için enzimleri hızlı bir şekilde taramak ve karakterize etmek için protokoller sunuyoruz. Mikroslayt difüzyon testi ve boya salım testi, kalitatif ve kantitatif enzimatik aktivite değerlendirmesi için hedef bakteri substratlarını kullanır.

Nitel ve Nicel Saptanması için Tahliller ve Protein Antimikrobiyal karakterizasyonu

(1) hücre içi bakteriyel bir patojeni hedefleyen ökaryotik hücre penetran antimikrobiyalleri aynı anda tanımlamak ve (2) ökaryotik hücre sitotoksisitesini değerlendirmek için yüksek verimli, gerçek zamanlı bir test geliştirilmiştir. Daha sonra aynı teknolojideki bir varyasyon, kolay, yüksek çözünürlüklü, doz yanıtı ve iki ve üç boyutlu sinerji çalışmalarını mümkün kılmak için dijital dağıtım teknolojisi ile birleştirildi.

Yüksek Verimli, gerçek zamanlı, Hücre içi Antimikrobiyal Aktiviteleri Çift okuma Test ve Ökaryotik Hücre Sitotoksisite

Bu hücre içi, Mycobacterium tuberculosis karşısında roman bileşiklerin bulunması hedefleme için ve in suyu memeli konakçı hücreye karşı bakteri hem de sitotoksisite büyüyen modüler yüksek verimli bir tarama sistemini geliştirdik.

Hücre içi Hedefleme İnhibitörleri Etkinliği ve Sitotoksisite Taraması için sistem<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Bitki türevi ürünlerin antifungal etkilerini ölçmek için tasarlanmış modifiye edilmiş bir agar bazlı yöntemi açıklıyoruz. Antifungal aktiviteye hem uçucu hem de uçucu olmayan katkılar bu protokol ile değerlendirilebilir. Ek olarak, mantarlara karşı etkinlik tek bir deneysel kurulumda önemli gelişim aşamalarında ölçülebilir.

Biyokontrol Ürünlerin Uçucu ve Uçucu Olmayan Antifungal Aktivitesinin Ölçülmesi

Antikorların C. tropicalis tarafından oluşturulan biyofilmler üzerindeki etkilerini incelemek için 2,3-bis (2-metoksi-4-nitro-5-sülfofenil)-5-karboksanil-2H-tetrazolyum (XTT) indirgeme testi kullanan 96 kuyucuklu mikrotitrek plaka bazlı bir protokol burada açıklanmıştır. Bu in vitro protokol, potansiyel yeni antifungal bileşiklerin biyofilmlerdeki Candida türü hücrelerinin metabolik aktivitesi üzerindeki etkisini kontrol etmek için kullanılabilir.

Antikorların Candida tropicalis Biyofilmleri Üzerindeki Etkisini Değerlendirmek için Çözünür Tetrazolyum Bazlı İndirgeme Testi

Öğrenin, suyu mikrodilüsyon yöntemiyle yeni mantar önleyici bileşikleri hızlı ve kolay bir şekilde nasıl tarayacağınızı. Bu yöntem, Candida ve Cryptococcus türlerine karşı doğal veya sentetik bileşiklerin etkinliğini değerlendirmek için kullanılır.

Suyu Microdilution Vitro tarama: yeni mantar önleyici bileşikler algılamak için kolay ve hızlı bir yöntem

Daha fazla video keşfet