Name: Mikrosıvısal çip Situ Crystal x-ışını kırınım ve in Situ dinamik ışık saçılma seri kristalografisi için için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: Öğrenin, mikrosıvısal çip kullanarak oda sıcaklığında protein kristalleştirme ve X-ışını kırınım verisi toplama yöntemini. Dinamik ışık saçılması ile kristalleşme sürecini izleyin ve yapısal analiz yapın.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser PIF-2015-46 PIER tohum fonu tarafından desteklenen, 05K16GUA ve 05K12GU3 ve Deutsche 'Hamburg merkezi için Ultrafast düşsel-yapısı, dinamiği ve kontrol maddenin atomik ölçekli' mükemmellik kümesi BMBF verir Forschungsgemeinschaft (DFG). Yazarlar için serbest elektron lazer bilim merkezi ile bağlı iş odaklı program fonları aracılığıyla Helmholtz Derneği tarafından finanse edildi. Sinkrotron MX veriler P14 işletilen beamline PETRA III depolama yüzük (DESY, Hamburg, Almanya) EMBL Hamburg tarafından toplanmıştır.

<ol><li>Rasmussen, B. F., Stock, A. M., Ringe, D., Petsko, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystalline+ribonuclease+A+loses+function+below+the+dynamical+transition+at+220+K%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystalline ribonuclease A loses function below the dynamical transition at 220 K.</a> Nature. 357 (6377), 423-424 (1992).</li>
<li>Tilton, R. F. J. R., Dewan, J. C., Petsko, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+temperature+on+protein+structure+and+dynamics%3A+X-ray+crystallographic+studies+of+the+protein+ribonuclease-A+at+nine+different+temperatures+from+98+to+320+K%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Effects of temperature on protein structure and dynamics: X-ray crystallographic studies of the protein ribonuclease-A at nine different temperatures from 98 to 320 K.</a> Biochemistry. 31 (9), 2469-2481 (1992).</li>
<li>Fraser, J. S., Clarkson, M. W., Degnan, S. C., Erion, R., Kern, D., Alber, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hidden+alternative+structures+of+proline+isomerase+essential+for+catalysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hidden alternative structures of proline isomerase essential for catalysis.</a> Nature. 462 (7273), 669-673 (2009).</li>
<li>Juers, D. H., Matthews, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+solvent+transport+in+cryo-annealing+of+macromolecular+crystals%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+D%22%5BJournal%5D)">The role of solvent transport in cryo-annealing of macromolecular crystals.</a> Acta Crystallogr. D. 60 (Pt 3), 412-421 (2004).</li>
<li>Huang, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+meso+in+situ+serial+X-ray+crystallography+of+soluble+and+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+D%22%5BJournal%5D)">In meso in situ serial X-ray crystallography of soluble and membrane proteins.</a> Acta Crystallogr. D. 71 (Pt 6), 1238-1256 (2015).</li>
<li>Gati, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+structure+of+granulin+determined+from+native+nanocrystalline+granulovirus+using+an+X-ray+free-electron+laser%5BTitle%5D)+AND+%22P.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Atomic structure of granulin determined from native nanocrystalline granulovirus using an X-ray free-electron laser.</a> P. Natl. Acad. Sci. USA. 114 (9), 2247-2252 (2017).</li>
<li>Gati, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+crystallography+on+in+vivo+grown+microcrystals+using+synchrotron+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">Serial crystallography on in vivo grown microcrystals using synchrotron radiation.</a> IUCrJ. 1 (Pt 2), 87-94 (2014).</li>
<li>von Dreele, R. B. <a target="_blank" href="http://scripts.iucr.org/cgi-bin/paper?S0021889806045493">Multipattern Rietveld refinement of protein powder data.</a> J. Appl. Crystallogr. 40 (1), 133-143 (2007).</li>
<li>Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipidic+cubic+phase+technologies+for+membrane+protein+structural+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Lipidic cubic phase technologies for membrane protein structural studies.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 21 (4), 559-566 (2011).</li>
<li>Gati, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGati%2C+C+%22Data+processing+and+analysis+in+serial+crystallography+at+advanced+X-ray+sources%22">Data processing and analysis in serial crystallography at advanced X-ray sources</a>. , Dissertation, Hamburg (2015).</li>
<li>Stellato, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Room-temperature+macromolecular+serial+crystallography+using+synchrotron+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">Room-temperature macromolecular serial crystallography using synchrotron radiation.</a> IUCrJ. 1 (Pt 4), 204-212 (2014).</li>
<li>Botha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Room-temperature+serial+crystallography+at+synchrotron+X-ray+sources+using+slowly+flowing+free-standing+high-viscosity+microstreams%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+D%22%5BJournal%5D)">Room-temperature serial crystallography at synchrotron X-ray sources using slowly flowing free-standing high-viscosity microstreams.</a> Acta Crystallogr. D. 71 (Pt 2), 387-397 (2015).</li>
<li>Nogly, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipidic+cubic+phase+serial+millisecond+crystallography+using+synchrotron+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">Lipidic cubic phase serial millisecond crystallography using synchrotron radiation.</a> IUCrJ. 2 (Pt 2), 168-176 (2015).</li>
<li>Martin-Garcia, J. M., Conrad, C. E., Coe, J., Roy-Chowdhury, S., Fromme, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4909539/">Review: Serial femtosecond crystallography: A revolution in structural biology.</a> Arch. Biochem. Biophys. 602, 32-47 (2016).</li>
<li>White, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://scripts.iucr.org/cgi-bin/paper?db5097">CrystFEL: A software suite for snapshot serial crystallography.</a> J Appl Crystallogr. 45 (2), 335-341 (2012).</li>
<li>Perry, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+approach+for+protein+structure+determination+at+room+temperature+via+on-chip+anomalous+diffraction%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A microfluidic approach for protein structure determination at room temperature via on-chip anomalous diffraction.</a> Lab Chip. 13 (16), 3183-3187 (2013).</li>
<li>Schlichting, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+femtosecond+crystallography%3A+the+first+five+years%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">Serial femtosecond crystallography: the first five years.</a> IUCrJ. 2 (Pt 2), 246-255 (2015).</li>
<li>Sui, S., Perry, S. L. <a target="_blank" href="http://aca.scitation.org/doi/abs/10.1063/1.4979640">Microfluidics: From crystallization to serial time-resolved crystallography.</a> Struct. Dynam.-US. 4 (3), (2017).</li>
<li>Ghazal, A., Lafleur, J. P., Mortensen, K., Kutter, J. P., Arleth, L., Jensen, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+X-ray+compatible+microfluidics+for+applications+in+soft+materials+and+life+sciences%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Recent advances in X-ray compatible microfluidics for applications in soft materials and life sciences.</a> Lab Chip. 16 (22), 4263-4295 (2016).</li>
<li>Heymann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Room-temperature+serial+crystallography+using+a+kinetically+optimized+microfluidic+device+for+protein+crystallization+and+on-chip+X-ray+diffraction%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">Room-temperature serial crystallography using a kinetically optimized microfluidic device for protein crystallization and on-chip X-ray diffraction.</a> IUCrJ. 1 (Pt 5), 349-360 (2014).</li>
<li>Schubert, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multicrystal+diffraction+data-collection+approach+for+studying+structural+dynamics+with+millisecond+temporal+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">A multicrystal diffraction data-collection approach for studying structural dynamics with millisecond temporal resolution.</a> IUCrJ. 3 (Pt 6), 393-401 (2016).</li>
<li>Weierstall, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipidic+cubic+phase+injector+facilitates+membrane+protein+serial+femtosecond+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Lipidic cubic phase injector facilitates membrane protein serial femtosecond crystallography.</a> Nat. Commun. 5, 3309(2014).</li>
<li>Conrad, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+inert+crystal+delivery+medium+for+serial+femtosecond+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">A novel inert crystal delivery medium for serial femtosecond crystallography.</a> IUCrJ. 2 (Pt 4), 421-430 (2015).</li>
<li>Cohen, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Goniometer-based+femtosecond+crystallography+with+X-ray+free+electron+lasers%5BTitle%5D)+AND+%22P.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Goniometer-based femtosecond crystallography with X-ray free electron lasers.</a> P. Natl. Acad. Sci. USA. 111 (48), 17122-17127 (2014).</li>
<li>Erskine, D., YU, P. Y., Freilich, S. C. <a target="_blank" href="http://www.spectralfringe.org/EDI/MyOlderPubs/PolyImide1988.pdf">High-Pressure Visible Spectroscopy of Polyimide Film.</a> J. Polym. Sci. Pol. Lett. 26 (11), 465-468 (1988).</li>
<li>Tsai, C. -L., Yen, H. -J., Chen, W. -C., Liou, G. -S. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2012/jm/c2jm32480f">Novel solution-processable optically isotropic colorless polyimidothioethers-TiO2 hybrids with tunable refractive index.</a> J. Mater. Chem. 22 (33), 17236-17244 (2012).</li>
<li>Destremaut, F., Salmon, J. -B., Qi, L., Chapel, J. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+with+on-line+dynamic+light+scattering+for+size+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidics with on-line dynamic light scattering for size measurements.</a> Lab Chip. 9 (22), 3289-3296 (2009).</li>
<li>Chastek, T. Q., Iida, K., Amis, E. J., Fasolka, M. J., Beers, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+platform+for+integrated+synthesis+and+dynamic+light+scattering+measurement+of+block+copolymer+micelles%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A microfluidic platform for integrated synthesis and dynamic light scattering measurement of block copolymer micelles.</a> Lab Chip. 8 (6), 950-957 (2008).</li>
<li>Heymann, M., Fraden, S., Kim, D. <a target="_blank" href="http://ieeexplore.ieee.org/document/6589983/">Multi-Height Precision Alignment With Selectively Developed Alignment Marks.</a> J. Microelectromech. S. 23 (2), 424-427 (2014).</li>
<li>Schubert, R., et al. <a target="_blank" href="http://scripts.iucr.org/cgi-bin/paper?jo5012">Reliably distinguishing protein nanocrystals from amorphous precipitate by means of depolarized dynamic light scattering.</a> J Appl Crystallogr. 48 (5), 1476-1484 (2015).</li>
<li>Aghvami, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0925400517304318">Rapid prototyping of cyclic olefin copolymer (COC) microfluidic devices.</a> Sensor Actuat. B-Chem. 247, 940-949 (2017).</li>
<li>Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWalker%2C+JM+%22The+Proteomics+Protocols+Handbook%22">The Proteomics Protocols Handbook</a>. , Humana Press Inc. Totowa, NJ. (2005).</li>
<li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2815665/">XDS.</a> Acta Crystallogr D. 66 (Pt 2), 125-132 (2010).</li>
<li>Vagin, A., Teplyakov, A. <a target="_blank" href="http://scripts.iucr.org/cgi-bin/paper?dz5175">Molecular replacement with MOLREP.</a> Acta Crystallogr. D. 66 (Pt 1), 22-25 (2010).</li>
<li>Winn, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+the+CCP4+suite+and+current+developments%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+D%22%5BJournal%5D)">Overview of the CCP4 suite and current developments.</a> Acta Crystallogr. D. 67, 235-242 (2011).</li>
<li>Murshudov, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((REFMAC5+for+the+refinement+of+macromolecular+crystal+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+D%22%5BJournal%5D)">REFMAC5 for the refinement of macromolecular crystal structures.</a> Acta Crystallogr. D. 67 (Pt 4), 355-367 (2011).</li>
<li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+and+development+of+Coot%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+D%22%5BJournal%5D)">Features and development of Coot.</a> Acta Crystallogr. D. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).</li>
<li>Owen, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+fast+detectors+to+enter+a+new+dimension+in+room-temperature+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+D%22%5BJournal%5D)">Exploiting fast detectors to enter a new dimension in room-temperature crystallography.</a> Acta Crystallogr. D. 70 (Pt 5), 1248-1256 (2014).</li>
<li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="http://scripts.iucr.org/cgi-bin/paper?wi0022">Automatic-Indexing of Rotation Diffraction Patterns.</a> J. Appl. Crystallogr. 21, 67-71 (1988).</li>
<li>Zarrine-Afsar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallography+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+D%22%5BJournal%5D)">Crystallography on a chip.</a> Acta Crystallogr. D. 68 (Pt 3), 321-323 (2012).</li>
<li>Boukellal, H., Selimović, S., Jia, Y., Cristobal, G., Fraden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple%2C+robust+storage+of+drops+and+fluids+in+a+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Simple, robust storage of drops and fluids in a microfluidic device.</a> Lab Chip. 9 (2), 331-338 (2009).</li>
<li>Aghvami, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+prototyping+of+cyclic+olefin+copolymer+%28COC%29+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Sens.+Actuator+B+Chem%22%5BJournal%5D)">Rapid prototyping of cyclic olefin copolymer (COC) microfluidic devices.</a> Sens. Actuator B Chem. 247, 940-949 (2017).</li>
<li>Shemesh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stationary+nanoliter+droplet+array+with+a+substrate+of+choice+for+single+adherent%2Fnonadherent+cell+incubation+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Stationary nanoliter droplet array with a substrate of choice for single adherent/nonadherent cell incubation and analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 111 (31), 11293-11298 (2014).</li>
<li>Sun, M., Bithi, S. S., Vanapalli, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+static+droplet+arrays+with+tuneable+gradients+in+material+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic static droplet arrays with tuneable gradients in material composition.</a> Lab Chip. 11 (23), 3949-3952 (2011).</li>
<li>Shim, J. -U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+and+measurement+of+the+phase+behavior+of+aqueous+solutions+using+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Control and measurement of the phase behavior of aqueous solutions using microfluidics.</a> J. Am. Chem. Soc. 129 (28), 8825-8835 (2007).</li>
<li>Schubert, R., Meyer, A., Baitan, D., Dierks, K., Perbandt, M., Betzel, C. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acs.cgd.6b01826">Real-Time Observation of Protein Dense Liquid Cluster Evolution during Nucleation in Protein Crystallization.</a> Cryst. Growth Des. 17 (6), 3579(2017).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Biz mikrosıvısal cihazlar in situ x-ışını kırınımı için epoksi reçine malzeme ve polimid folyo pencere malzemesi olarak doldurma olarak biçimlenme tarafından imal. Bizim yordamı imalat sürecinin çeşitli adımlar önceki x-ışını çip tasarımları16,21en iyi duruma getirilmiş. Biz pencere kalınlığı azaltmak ve böylece aynı zamanda fabrikasyon hareket hızı ise saçılma arka plan olarak daha az işlem adımları gereklidir. situ kristalizasyon açıklanan protokolünü kullanarak önemli faydaları vardır. Oda sıcaklığında kırınım veri toplama sağlar ve dolayısıyla protein yapısı aktarımında tanıtmaktan riski içeren bazı durumlarda cryo koruma ihtiyacı dışarıda tutar. Kristalleri transferi yerli çevreleri önlenebilir çünkü Ayrıca, kristaller fiziksel stres tabi değildir. Bu işlem ile kristaller onların en yüksek kalitesini korumak ve herhangi bir tedavi olmaz.
Deneyim, protokol içinde en önemli adımlar kristalizasyon işlem kontrol etrafında döner. X-ışını uygun kristalleri uygun boyutları ile elde etmek için parametreler ampirik olarak tanımlanması gerekir ve doğrudan buharı difüzyon deneylerden esir olamaz. Protein ve precipitant özdeş konsantrasyonları kullanılması her zaman kristalleri farklı fiş veya zaman zaman aynı çip içinde farklı Wells neden değil. Bu kristal çekirdekleşme ve büyüme etkileyen tüm faktörler dikkatle, anne içki kompozisyon veya kristalizasyon Kinetik (yoluyla buharlaşma yörünge) gibi incelenmesi gereken gösterir. Daha büyük kristaller daha yüksek çözünürlük için diffract gibi uygun büyük kristaller ideal olarak yetiştirilmektedir. Kristal çekirdekleşme ve büyüme sürecinin DLS ölçümleri ile takip edilebilir. ~ 50 µm içinde lazer odak ayarlama ince kristalizasyon bölmeleri çipin zor olabilir ve dikkatli manuel hizalama gerektirebilir. Öyle ki birden çok kuyu otomatik satın alma programları takip edilebilir 100 µm derin kuyu, lazer otomatik hizalama uygulanabilir ve güvenilir, kullanmaktı.
Sadece düşük bir arka plan dayalı polimid X-ray yongaları üretmek ve biz üç modeli proteinler için yapıları çözerek bu cihazlar oyununa x-ışını kırınım veri toplama uygunluğu göstermek. Daha önce elde çözünürlük, önemli ölçüde daha büyük protein kristalleri ve konvansiyonel röntgen veri toplama ile karşılaştırıldığında yongasında elde edilen en iyi çözünürlük farklıydı. Bu çeşitli faktörler nedeniyle olabilir ve daha fazla kristalizasyon koşulu optimizasyonu daha fazla kırınım geliştirmek. Situ kırınım veri uygulanan kristal ile 30 µm daha küçük boyutları 1.8 Å çözünürlüğe kadar toplamak mümkün. Thaumatin Difraksiyon veri ayrıntılı analizini radyasyon hasarı hakkında kavrayışlar sağlanan. Radikaller için ve komşu kristalleri Difüzyon oluşabilir gibi Genişlet radyasyon hasarı sınırlamak için yalnızca bir tek kristal kompartımanda mikrosıvısal aygıt başına maruz. Veri toplama hızını artırmak için bu gelecekte otomatik.
Kristal Morfoloji nedeniyle, bazı durumlarda tercih edilen bir yönünü ortaya çıkabilir. Bu örneğin thioredoxin veri kümesi kristalleri kuvvetle tercih edilen bir yönüne göre çip windows vardı nerede olduğu. Hatta burada, bir tam kırınım veri toplayabilirsiniz. Eğer kristaller çip tercih edilen bir yönde sergi ve karşılık gelen alan grubundaki de düşük bir simetri varsa, özellikle sonra veri kümesi completeness toplama sırasında yeterli kırınım desenleri baston olmak öyle ki takip edilmelidir toplanan.
Işık kullanarak bağlı bir pompa-sonda yaklaşım reaksiyon zaman zaman çözüldü çalışmalar bu fişleri kullanarak doğrudan mümkündür. COC kullanılabilir ya polimid folyo ışık geçirgenliği pompa lazer için aydınlatılmamıştır ve alternatif olarak, optik polimid temizlemek gerekiyor. Geçerli mikrosıvısal geometrileri kristalleri yetiştirilen sonra deneyler karıştırma substrat için izin vermez. Ancak, biz de böyle her iki kez çözüldü x-ışını kırınımı için tasarımlar karıştırma gibi için yaklaşımlar19saçılma uygun olarak açıklanan X-ray çip imalat Protokolü bekliyoruz.

Bir protein 3D yapısını bilmek onun işlevselliğini anlamak önemlidir. Yakınındaki atomik çözünürlükte yapılar defa en sık x-ışını kristalografisi tarafından elde edilir. Bu teknik protein kristalleri X-ray radyasyon ortaya çıkaran ve ortaya çıkan kırınım desen sonra yapı belirlenmesi ve arıtma için analiz edilir. Geleneksel x-ışını kristalografisi içinde kalma Kryojenik sıcaklıklarda bir tek, ideal olarak büyük, tam kırınım veri kümesi kaydedilir. Bu kristaller ancak, büyümek için önemsiz değildir çoğunlukla ve uygun cryo-koruma koşulları tanımlamak için kendi içinde zorlu olmak ve bazen de sapmalar yerli protein yapısı5neden olabilir.
X-ışını serbest elektron lazer (FEL) ve sinkrotron beamlines son teknolojik gelişmeler daha küçük kristaller yapılardan çözmek için izin, mikro odaklanan yeni beamlines olarak artan x-ışını ışınla parlak ve geliştirilmiş x-ışını dedektörleri oldu mevcut6,7. Genellikle, küçük kristaller daha büyük büyümek ve ücretsiz kristalleri8,9sığınmak daha kolaydır. Ancak, x-ışını radyasyon hasarı büyük kristaller daha hızlı küçük kristaller muzdarip. Bu çünkü büyük bir kristal karşılaştırıldığında, daha yüksek bir x-ışını doz için karşılaştırılabilir çözünürlük diffract için küçük bir kristal hacim içine öngörülen gerekir. Bu nedenle, hatta kriyojenik koruma tam kırınım veri kümesinden tek bir microcrystal kaydetmek için yeterli genellikle değildir.
Bu engeli aşmak için seri kristalografisi toplamak ve tam bir dataset elde etmek için birçok rasgele odaklı microcrystals Difraksiyon desenlerini birleştirme için seçtiğiniz yöntemi haline gelmiştir. İndüklenen kristal hasar toplam X-ray doz yayarak en aza radyasyon kullanılan bir protein yapı kristalleri5,10, yüksek bir dizi üzerinden çözmek için. İçinde bir ' diffract önce yok ' FEL deneme, her kristal, yalnızca femto saniyelik X-ray darbeleri kullanarak bir pozlama için kullanılır. Mikro-odak beamlines üçüncü nesil sinkrotron kaynakları, sırayla bir kaç milisaniye kısa X-ray Etkilenmeler11,12,13,ile14seri kristalografisi gerçekleştirebilirsiniz. Bir kristal salınım veya döndürme veri toplama sırasında, ancak, yalnızca kısmi Bragg yansımaları kaydedilebilir ve bu nedenle zaman-in bin veya daha fazla kırınım desenleri yapı belirlenmesi15için genellikle gereklidir. Bugüne kadar çeşitli bir dizi örnek teslim yöntem son zamanlarda gözden geçirilen14,16,17,18,19seri kristalografisi için geliştirilmiştir. O arasında çeşitli sabit hedef örnek teslim böyle önemli ölçüde daha az kırınım desenleri aynı derecede tam veri kümeleri de daha az tüketen süre sağlayabilir stratejileri başarıyla kristal döndürme sırasında x-ışını Etkilenmeler ile kombine edilmiştir dayalı örnek karşılaştırıldığında klasik seri kristalografisi için hareketsiz görüntüler nerede deneyler7,16,20,21,22,23 kaydedildi. , 24.
Biz mikrosıvısal cihazlar düşük X-ray arka plan ile imal etmek bir iletişim kuralı mevcut. Aygıtlar 5-dak epoksi yapıştırıcı kullanarak yumuşak litografi desenli ve oda sıcaklığında ile durum olarak numune hazırlama x-ışını kurulum doğrudan entegre üzerinden yararına in-situ x-ışını kırınım deneyler için uygundur karıştırma kaynaklı Kinetik18,19izleyin zaman çözülmesi çalışmaları. Mikrosıvısal kanalları ile polimer polimid folyo, kombine düşük X-ray arka plan görüntüleme için izin yaklaşık 16 µm kalınlığında röntgen Windows'da sonuçlanan her iki tarafta kapaklı. Tüm kullanılan malzemeler iyi solvent direnci sağlar. Bu üretim nispeten basit ve ucuz bir yöntemdir. SU-8 ana gofret tedarik sonra tüm üretim dışında bir temiz oda tipik araştırma laboratuarı ortamında tamamlanabilir.
Gonyometre sabit hedef seri kristalografisi tabanlı için bir uygulama örnek olarak tarif biz cips. İlk olarak, sulu bir reaksiyon nanoliter boyutlu damlacıkları seçili bir dizi içine bölünmüş microfluidically kılcal valving kullanmak için tasarım ve imalat konuları ele alınmıştır. Bu yükleme mekanizması kanal ölü biriminden örnek kaybı önler ve bölme kolayca el ile pompaları veya diğer donanım için sıvı çalıştırma kullanmadan yapılabilir. Böyle izole nanoliter boyutlu protein çözüm izlenen in situ denetim protein kristal çekirdekleşme ve büyüme için dinamik ışık saçılma (DL) kullanarak damlaları. Daha önce DLS ölçümleri bir cam slayt25,-26bağlı polydimethylsiloxane (PDMS) yapısının oluşan mikrosıvısal cihazlarda gerçekleştirilebilir kanıtlanmıştır. Polimid katman 550 uzun dalga boyları için yüksek bir iletim olduğundan nm, yaklaşım uzatılabilir X-ray şeffaf cips de, ölçümler bir uygun lazer dalga boyu27,28kullanırken. DLS sonuçlarına göre ilk çekirdekleşme görülebilir ve daha fazla damlacık buharlaşma daha az ama daha büyük protein kristalleri elde etmek için durdu.
Yeterli kristalleri yetiştirilen sonra tam x-ışını kırınım veri kümeleri sonra oda sıcaklığında gonyometre dayalı sabit in situ hedef seri x-ışını kristalografisi kullanarak toplanabilir. Kırınım veri kümeleri protein kristal yapısı çözmek için yazılım araçları ve özel komut dosyaları kullanılarak işlenir. Bu teknik genellikle cryo-koruma geleneksel kristalografisi deneylerde kullanılan sırasında indüklenen eserler önler.
Biz hakkında kullanarak çözüldü üç protein hedef yapıları karşılaştırmak 10-20 µm küçük kristaller yongasında daha sonra 2 Å çözünürlük için büyüdü. Crystallizing ve in situ, kauçuk ve dolayısıyla mekanik diffracting bozuklukları kırılgan kristallerinin simge durumuna küçültülmüş. Bu iletişim kuralı hangi diffract protein kristalleri için yüksek çözünürlüklü yanı sıra düşük çözünürlük (1.7 Å 3.0 Å) uygulanabilir. Olarak hemen hemen her kristal kırınımı için kullanılabilir, bu yapım bir çok verimli kristal Teslimat yöntemi küçük örnek harcanıyor.
Bu iletişim kuralı, in situ protein kristalizasyon ve kırınım veri toplama için x-ışını şeffaf mikrosıvısal çip hazırlamak ayrıntılı bir rehber sağlar. Prosedürü dikkatle laboratuarda gelişmiş ekipman gerekmeden mikrosıvısal hassas faydalanmak için tasarlanmıştır. Ayrıca, veri toplama sinkrotron beamline adlı bir özel gonyometre veya nemlendirici sonuçlar üreten kolaylaştırmak için gerek kalmadan sigara-uzmanlar tarafından gerçekleştirilebilir. Sunulan teknik cryo-koruma veya kristal işleyerek seri milisaniyelik kristalografisi veri toplama en az radyasyon hasarı tutarken ve stres için kristalleri büyüme sonra tanıtımı olmadan oda sıcaklığında için uygulanabilir. Bu nedenle, açıklanan yöntemi herhangi bir protein kristalizasyon proje için uygundur.

<table><tbody><tr><td>SU-8 3000 Serisi</td><td>MicroChem Corp.</td><td>SU-8 3000</td><td>Fotorezist</td></tr><tr><td>PGMEA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>484431</td><td>Geliştirici</td></tr><tr><td>İzopropil alkol</td><td></td><td></td><td>Çözücü</td></tr><tr><td>Etanol</td><td></td><td></td><td>Çözücü</td></tr><tr><td>Epoksi yapıştırıcı</td><td>UHU</td><td>Plus Schnellfest 5 dk</td><td>Epoksi yapıştırıcı</td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td>Silikon</td></tr><tr><td>Kapton folyo</td><td>Dupont/ Amerikan Durafilm</td><td>HN sınıfı, ölçü 30 (7.5 &mu; m)</td> <td>poliimid folyo</td></tr><tr><td>APTS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440140</td><td>Kimyasal</td></tr><tr><td>GPTS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440167</td><td>Kimyasal</td></tr><tr><td>Cytop CTX-109AE</td><td>Asahi Glass Co., Ltd</td><td>Cytop CTX-109AE</td><td>Cytop floropolimer kaplama</td></tr><tr><td>CT-Solv 100E</td><td>Asahi Glass Co., Ltd,</td><td>CT-Solv 100E</td><td>Cytop floro-solvent</td></tr><tr><td>HFE-7500</td>, <td>3M</td><td>Novec 7500</td><td>Florlu yağ</td></tr><tr><td>AutoCAD</td><td>, AutoDesk, Inc.</td><td>AutoCAD</td><td>CAD Yazılımı</td></tr><tr><td>Biyopsi Punch</td><td>Harris</td><td>Uni-core 0.75 mm</td><td></td></tr><tr><td>Fotoğraf maskesi</td><td>JD Fotoğraf Verileri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3 inç gofret</td><td>Üniversite Gofret</td><td></td><td>Silikon gofret</td></tr><tr><td>Maske hizalayıcı</td><td>S&Uuml; SS MicroTec</td><td>MJB4</td><td>Maske hizalayıcı</td></tr><tr><td>PDMS karıştırıcı</td><td>Thinky</td><td>ARE-250</td><td></td></tr><tr><td>Plazma makinesi</td><td>Diener elektronik</td><td>Zepto</td><td></td></tr><tr><td>Thaumatin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7638</td><td>Protein</td></tr><tr><td>Glikoz İzomeraz</td><td>Hamton Araştırma</td><td>HR7-102</td><td>Protein</td></tr><tr><td>Bis-Tris</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B9754</td><td>Kimyasal</td></tr><tr><td>Sodyum Tartarat</td><td>Merck</td><td>106664</td><td>Kimyasal</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10812846001</td><td>Kimyasal</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth</td><td>6763.2</td><td></td></tr><tr><td>Kimyasal Magnezyum Klorür</td><td>Sigma Aldrich</td><td>208337</td><td>Kimyasal</td></tr><tr><td>Amonyum Sülfat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4418</td><td>Kimyasal</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>Kimyasal Sodyum Klorür</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1064060250</td><td>Kimyasal</td></tr><tr><td>PEG1500</td><td>Moleküler Boyutlar</td><td>MD2-100-6</td><td>Kimyasal</td></tr><tr><td>SPG tamponu</td><td>Jena Bioscience</td><td>CSS-389</td><td>Kimyasal</td></tr><tr><td>SpectroLight600</td><td>XtalConcepts</td><td></td><td>DLS Enstrümanı</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Termo Bilimsel</td><td></td><td>Spektrofotometre</td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultimaker2</td><td>Ultimaker</td><td></td><td>3D yazıcı</td></tr><tr><td>Form2</td><td>Formlabs</td><td></td><td>3D yazıcı</td></tr><tr><td>Amicon Filter</td><td>Sartorius Stedim</td><td></td><td>0.2 & mikro; m filtre</td></tr><tr><td>Boru</td><td>Adtech Polymer Engineering Ltd</td><td>Bioblock / 05</td><td>PTFE boru 0,3 mm İç Çap x 0,76 mm Dış Çap</td></tr><tr><td>Şırıngalar&nbsp;</td><td>BD</td><td>309628</td><td>1ml Luer-Lock</td></tr><tr><td>Uçlu İğne&nbsp;</td><td>Terumo Agani İğnesi</td><td>AN*2716R1</td><td>27Gx5/8"</td></tr></tbody></table>

mikrosıvısal çip situ crystal x-ışını kırınım ve in situ dinamik ışık saçılma seri kristalografisi için için

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

Bu iletişim kuralı imalatı mikrosıvısal aygıtları sabit hedef seri kristalografisi gonyometre tabanlı için en iyi duruma getirilmiş düşük X-ray arka plan ile açıklar. Aygıtlar epoksi yapıştırıcı kullanarak yumuşak litografi desenli ve in situ x-ışını kırınım deneyler oda sıcaklığında için uygundur. Örnek wells kırınım veri toplama düşük X-ray arka plan ile izin polimer polimid folyo windows ile her iki tarafta kapaklı. Bu uydurma basit ve ucuz bir yöntemdir. SU-8 ana gofret tedarik sonra tüm üretim dışında bir temiz oda tipik araştırma laboratuarı ortamında tamamlanabilir. Yonga tasarım ve üretim protokolü kullanmak valving kapiller microfluidically sulu bir reaksiyon tanımlanmış nanoliter boyutlu damlacıkları içine bölmek için. Bu yükleme mekanizması kanal ölü biriminden örnek kaybı önler ve kolayca el ile pompaları veya diğer donanım için sıvı çalıştırma kullanmadan yapılabilir. Protein çözüm nasıl izole boyutlu nanoliter damla denetim protein kristal çekirdekleşme ve büyüme için dinamik ışık tarafından izlenen situ saçılma açıklar. Uygun kristalleri yetiştirilen sonra tam x-ışını kırınım veri kümeleri gonyometre dayalı sabit in situ hedef seri x-ışını kristalografisi oda sıcaklığında kullanarak toplanabilir. İletişim kuralı çözmek ve protein kristal yapısı rafine bir yazılım araç paketi kullanarak kırınım veri kümelerini işlemek üzere özel komut dosyaları sağlar. Bu yaklaşım muhtemelen cryo-koruma veya el ile kristal geleneksel kristalografisi deneylerde işleme sırasında indüklenen eserler önler. Biz mevcut ve ile boyutlar-in yaklaşık 10-20 µm yongasında yetiştirilen küçük kristalleri kullanarak çözüldü üç protein yapıları karşılaştırabilirsiniz. Crystallizing ve in situ, kauçuk ve dolayısıyla mekanik diffracting bozuklukları kırılgan kristallerinin simge durumuna küçültülmüş. Protokol nasıl bir özel X-ray şeffaf mikrosıvısal çip in situ seri kristalografisi için uygun imal etmek ayrıntılı. Hemen hemen her kristal kırınım veri toplamak için kullanılan bu mikrosıvısal çip çok verimli kristal teslim yöntem şunlardır.

Bu protokolü nasıl imal ve mikrosıvısal cihazlar x-ışını kırınım veri toplama oda sıcaklığında için ayrıntılı olarak anlatılmaktadır. Ayrıca, protein kristalizasyon tarafından dinamik ışık saçılma izlemek açıklar ve nasıl işlemek ve analiz kırınım veri elde.

Mikrosıvısal çip Situ Crystal x-ışını kırınım ve in Situ dinamik ışık saçılma seri kristalografisi için için

This protocol describes fabricating microfluidic devices with low X-ray background optimized for goniometer based fixed target serial crystallography. The ...

Bu prosedürün genel amacı, oda sıcaklığında protein kristalizasyonu X-ışını kırınım verilerinin toplanması için bir mikroakışkan cihaz imal etmek ve çalıştırmaktır. Bu tekniğin ana avantajı, çip içindeki kristalleşmenin protein kristallerinin mekanik bozulmasını en aza indirmesidir. Bu X-ışını şeffaf çiplerin üretilmesi kolaydır, çoğu senkrotron ışın hattının gonyometrelerine doğrudan monte edilebilir ve X-ışını kırınım verilerini toplarken mevcut kristalleri verimli bir şekilde kullanır.İlk olarak, X-ışını çip tasarımının ana kalıbını alüminyum folyo ile kaplı 10 santimetrelik bir Petri kabına yerleştirin. Toplam yaklaşık 30 gram PDMS bazı ve sertleştirici maddeyi 10'a bir oranında karıştırın ve PDMS'yi master'ın üzerine dört milimetre yüksekliğe kadar dökün. PDMS'yi bir vakumlu desikatörde beş dakika boyunca gazdan arındırın ve PDMS yüzeyinde kalan hava kabarcıklarını gidermek için hava üfleyin.PDMS'yi bir saat boyunca 70 santigrat derecede bir fırında kürleyin. Ardından, kürlenmiş PDMS kalıbını master'dan nazikçe soyun. Fazla PDMS'yi kesmek için bir neşter kullanın.X-ışını çip imalatından önce, çalışma alanının epoksi kalıp dökümü sırasında gerekli tüm ekipman ve bileşenlere kolay erişim sağlayacak şekilde düzenlendiğinden emin olun. Çip imalatına başlamak için, iki bileşenli bir epoksi reçinenin öncülerini etanol ile ağırlıkça %40'lık bir nihai etanol kütle konsantrasyonuna seyreltin. Bir girdap karıştırıcı kullanarak epoksi reçine ve etanolü karıştırın.PDMS'nin daha sonra epoksi reçinesinden küçük hava kabarcıklarını emmesini sağlamak için PDMS kalıbını bir vakumlu desikatörde 30 dakika boyunca gazdan arındırın. 70 milimetreye 70 milimetrelik bir parça 7,5 mikron kalınlığında poliimid folyo kesin ve folyoyu 75 milimetreye 50 milimetrelik bir cam slaytın etrafına sarın. Düz, sert bir poliimid yüzey oluşturmak için folyonun kenarlarını sürgünün arkasına bantlayın.Sürgülü arkalıklı poliimid folyoya 20 saniye boyunca oksijen plazması uygulayın. Ardından, folyoyu 20 santigrat derecede beş dakika boyunca APTS veya GPTS'nin hacimce% 1'lik sulu çözeltisinde inkübe edin. Silanizasyon sırasında, epoksi reçine öncü çözeltilerini küçük bir spatula ile iyice karıştırın.Gazdan arındırılmış PDMS kalıbını vakumlu desikatörden düz bir yüzeye aktarın. Silinize poliimid folyoyu basınçlı hava veya nitrojen gazı ile kurutun. Kalıp üzerindeki her bir mikro yapıya hızlı bir şekilde reçine karışımından bir damla uygulayın.Sürgülü arkalıklı poliimid folyoyu yüzü aşağı bakacak şekilde epoksi reçinenin üzerine yerleştirin ve slayta sıkıca bastırın. Düzeneği plastik bir folyo ve bir metal levha ile örtün. Düzeneğe santimetre kare başına 1,4 Newton'a kadar bir basınç uygulamak için metal levhanın üzerine ağırlıklar yerleştirin.15 dakika sonra, cam sürgüyü epoksi desenli poliimid folyodan nazikçe ayırın ve poliimid folyoyu kuruyana kadar silin. Plastik folyoyu, metal levhayı ve ağırlıkları tekrar üstüne yerleştirin. Epoksinin oda sıcaklığında bir saat kürlenmesine izin verin.Daha sonra ağırlıkları, metal levhayı ve plastik folyoyu çıkarın. Desenli poliimid folyoyu PDMS kalıbından nazikçe soyun. Plazma, desenli folyoyu 20 saniye boyunca işlemden geçirin ve desenli folyoyu daha önce açıklandığı gibi APTS veya GPTS ile silanize edin.Bozulmamış bir poliimid folyoyu aynı koşullar altında diğer silan çözeltisi ile silamin. Her iki folyoyu da basınçlı hava ile kurulayın. Ardından, temiz, kuru ve düz bir yüzeye bir damla deiyonize su uygulayın.Poliimid folyo üzerinde tek tek talaş yapılarını kesin ve desenli poliimid folyoyu epoksi tarafı yukarı bakacak şekilde su damlasının üzerine yerleştirin ve folyoyu tamamen düz olana kadar dikkatlice düzeltin. İkinci poliimid folyoyu, silanize yüzü aşağı bakacak şekilde desenli folyo üzerine yerleştirin. Hava kabarcıklarını dışarı atmak ve poliimid tabakaları birbirine yapıştırmak için ikinci folyoyu köşeden karşı köşeye nazikçe düzleştirin.Erişim portlarını üretmeye başlamak için, kürlenmiş, dört milimetrelik bir PDMS levhasından, kristalizasyon bölmesini kapatmadan poliimid X-ışını çipindeki tüm portları kaplayacak kadar yeterli boyutta bir blok kesin. Plazma, poliimid çipini ve PDMS bloğunu işlemden geçirin, silanize edin ve kurutun. İşlem görmüş bloğu bağlantı noktalarının üzerinden çip üzerine bastırın.Çipi plastik bir folyo, temiz bir cam slayt ve bir metal levha ile örtün. Bir saat boyunca santimetre kare başına 1.4 Newton basınç uygulayın. Ardından, çip tasarımında işaretlenen yerlerde giriş ve çıkış deliklerini delmek için 0,75 milimetrelik bir biyopsi zımbası kullanın.Çipin arkasını poliimid film elektrik yalıtım bandı ile kapatın. Ardından, ağırlıkça %9'luk bir şeffaf floropolimer kaplama malzemesi stok çözeltisini florlu bir çözücü ile ağırlıkça %0.45'e seyreltin. Şırıngaya 27 gauge, 5/8 inçlik bir iğne bağlayın.İğnenin ucuna politetrafloroetilen boruyu yerleştirin. Floropolimer çözeltisini bir mililitrelik Luer kilit şırıngasına yükleyin. Borunun diğer ucunu X-ray çip çıkışına bağlayın.Floropolimer solüsyonunu tüm kanallar dolana kadar çipe enjekte edin ve hava ile dolu bir şırınga kullanarak fazla floropolimer solüsyonunu çıkarın. Doldurulmuş çipi düz tarafı aşağı bakacak şekilde 190 santigrat derecede bir ocak gözüne yerleştirin. Çözücüyü buharlaştırmak için çipi beş dakika ısıtın, böylece kanalları floropolimer ile kaplayın.Kristalizasyon prosedüründen önce, seçilen protein çözeltisini 0.2 mikronluk bir filtre ile filtreleyin. Çözeltiyi 16, 100 kez g ve 20 santigrat derecede 15 dakika santrifüjleyin ve kristalizasyon deneyleri için süpernatanı geri kazanın. Kristalizasyon prosedürüne başlamak için, eşit hacimlerde bir protein çözeltisini ve çökelticisini birleştirin.Bu karışımın yaklaşık 20 mikrolitresini bir şırıngaya çekin. Şırıngayı X-ışını çipinin girişine bağlamak için 27 gauge, 5/8 inçlik bir iğne ve PTFE boru kullanın. Prize aynı şekilde bir florlu yağ şırıngası bağlayın.Çipi mikroskop altında izlerken, kristalizasyon çözeltisini girişten paralel düzende çipe doldurun. Çipteki kristalleşme bölmelerini ayırmak için yeterli florlu yağ enjekte edin. Ardından, hem giriş hem de çıkış portlarını ataç veya diğer dar tapalarla kapatın.Çipi uygun kristalleşme koşulları altında saklayın. Kristal oluşumu artık mikroskop altında veya dinamik ışık saçılımı ölçümleriyle gözlemlenebilir. Veri toplamaya hazır olduğunuzda, X-ışını çipini plaka gonyometresi için 3D baskılı bir adaptöre sabitlemek için çift taraflı bant kullanın.Çip adaptörünü senkrotron ışın hattındaki plaka gonyometresine monte edin. Kırınım verilerini toplayın ve analiz edin. Poliimid folyo çipinin kristalizasyon odalarından suyun buharlaşma hızını ölçmek için parlak alan mikroskobu kullanıldı.Dinamik ışık saçılımı, eşdeğer geometriye sahip bir cam slayt üzerindeki bir PDMS çipindeki taumatin kristallerinin ilk çekirdeklenmesini tespit ederek kristalleşme koşullarının optimize edilmesini sağlayabilir. Her çerçeve sırasında bir derecelik bir dönüşe sahip bir poliimid çip içinde büyütülen 83 taumatin kristalinin her birinden 10 kırınım modeli toplandı. Veri seti, kareye göre beş alt veri kümesine bölündü ve daha sonra normalleştirilmiş kırınım gücünün zaman içindeki yoğunluk azalması değerlendirildi.Dördüncü veri setinde, kırınım gücü %50'nin altına düşmüştüAlt veri kümelerinin ölçüm R faktörü değerleri zamanla artmıştı, bu da kristallerin veri toplama sırasında radyasyon hasarına maruz kaldığını gösteriyor. Bu, X-ışınına maruz kalma sırasında üretilen ve aynı bölmedeki komşu kristalleri bozan serbest radikallere bağlandı. Bipiramidal taumatin kristalleri, X-ışını çipinde geniş bir oryantasyon dağılımına sahipti.Ortorhombic glukoz izomeraz kristalleri de aynı şekilde bir poliimid çip içinde büyütüldüğünde geniş bir yönelim dağılımı gösterdi. Bununla birlikte, tioredoksin kristalleri, potansiyel olarak uzun şekilleri nedeniyle, ağırlıklı olarak xy, xz ve yz düzlemlerinde yönelimlere sahipti. Genel olarak, bu çipler çok sağlamdır ve düşük bir X-ışını arka planına sahiptir.Bu, bu üretim yöntemini küçük açılı X-ışını saçılımı gibi diğer X-ışını görüntüleme teknikleri için uygun hale getirir. Bu prosedür, deneysel ihtiyaçlarınıza uyacak şekilde kolayca uyarlanabilir. Örneğin, çip tasarımı, tek tek bölmelerin boyutları veya çip başına toplam bölme sayısı ayarlanarak değiştirilebilir.Bizim için özel bir odak noktası, özel aletler veya mikroakışkan pompalar gibi yüksek maliyetli ekipman gerektirmeyen bir iş akışı tasarlamaktı. Bu videoyu izledikten ve makaleyi okuduktan sonra, çipte nasıl kristalleştirileceğini, kristalleşme sürecini izlemeyi ve çip yaklaşımını kullanarak kırınım verilerini kaydetmeyi ve analiz etmeyi iyi anlamış olmalısınız. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, özel bir temiz oda gerektirmeden yaklaşık üç saat içinde bir PDMS master'dan mikroakışkan çiplerin toplu üretimini sağlar.

microfluidic-chips-for-situ-crystal-x-ray-diffraction-situ-dynamic

Research

JoVE Journal

Chemistry

Kimya

III-V/Si heteroekspitaksiyel ince filmlerdeki kusurları karakterize etmek için taramalı elektron mikroskobunda elektron kanallı kontrast görüntülemenin kullanımı açıklanmıştır. Bu yöntem, plan görünümlü transmisyon elektron mikroskobuna benzer sonuçlar verir, ancak gerekli numune hazırlığının olmaması nedeniyle önemli ölçüde daha kısa sürede verir.

Rapid III-V Heteroepitaxial Karakterizasyonu için Elektron Channeling Kontrast Görüntüleme

Biz dışarı hızlı iki boyutlu x-ışını floresans ve x-ışını microdiffraction eşleme örnekleri Laue (renkliden radyasyon) ya da (tek renkli radyasyon) toz difraksiyon kullanarak tek kristal veya toz taşımak istedim beamline kurulumunu açıklayan. Elde edilen haritalar zorlanma, yönlendirme, faz dağıtım ve plastik deformasyon hakkında bilgi vermek.

Sinkrotron x-ışını Microdiffraction ve Mineral ve kaya örneklerini floresans görüntüleme

Bu makalede, diyaliz yöntemi ve yerinde X-ışını kırınım deneyleri ile çip üzerinde protein kristalizasyonu için geliştirilen mikroakışkan çiplerin imalat protokolü ayrıntılı olarak açıklenmektedir. Mikrofabrikasyon işlemi, yarı geçirilebilir yenilenmiş selüloz diyaliz membranın, çipin iki katmanı arasında herhangi bir moleküler ağırlık kesme ile entegre olmasını mümkün kılar.

In Situ X-ışını Kırınım Çalışmaları için Mikrodiyaliz ile Çip Üzerindeki Proteinlerin Kristalizasyonu

Karşı difüzyon yöntemini kullanarak bir enzimin kristalleşmesini, ıslatarak kristallere bir substratın girmesini ve oda sıcaklığında çipin içindeki kristallerin seri analizi ile enzim:substrat kompleksinin 3D yapısının belirlenmesini sağlayan çok yönlü bir mikroakışkan cihaz tarif edilir.

Çok Yönlü Bir Mikroakışkan Çipte Seri Kristalografi ile Bir Enzim:Substrat Kompleksinin Kristalizasyonu ve Yapısal Belirlenmesi

Burada sunulan protokol, sıvı kriyojende vitrifikasyondan önce en az 90 ms karıştırılan kendi kendine fitillenen nanotel ızgaraya iki ilgi örneği sunmak için yeni bir robotik sistem olan Spotiton'un kullanımını açıklamaktadır.

Yeni Bir Robotik Sistem Kullanarak Zaman Çözümlenen Çalışmalar için Kriyo-Elektron Mikroskobik Izgara Hazırlığı, Spotiton

Verilerin sinyal-gürültü oranı, mikrokristallerden X-ışını kırınım ölçümlerinin yapılmasında en önemli hususlardan biridir. VMXm kiriş çizgisi, bu tür deneyler için düşük gürültülü bir ortam ve mikrobülans sağlar. Burada, VMXm ve diğer mikro odak makromoleküler kristalografi kiriş hatları için mikrokristallerin montajı ve soğutulmasından dolayı örnek hazırlama yöntemlerini açıklıyoruz.

VMXm Beamline'da Mikrokristaller için Örnek Hazırlama Boru Hattı

Burada, mikrokristal elektron kırınımı (MicroED) deneyleri için küçük moleküllü kristallerin tozlarının hazırlanması için laboratuvarımızda geliştirilen prosedürleri açıklıyoruz.

Küçük Moleküllerin Mikrokristal Elektron Kırınımı

Burada, EMBL Grenoble'daki HTX Laboratuvarı'nda KristalDirekt teknolojisine dayalı proteinden yapıya, hızlı ligand-protein kompleksi analizi ve büyük ölçekli parça taraması için otomatik makromoleküler kristalografi boru hatlarının nasıl kullanılacağını açıklıyoruz.

Grenoble'daki EMBL HTX Tesisinde Otomatik Kristalografi Boru Hatları

Bu katkı, kristal üzerinde kristal cihazlarda protein kristalizasyonunun nasıl kurulacağını ve çip üzerinde kristalizasyon platformunu kullanarak oda sıcaklığında otomatik seri veri toplamanın nasıl gerçekleştirileceğini açıklamaktadır.

Oda Sıcaklığında Çip Üzerinde Kristalizasyon ve Büyük Ölçekli Seri Kırınım

Burada, transmisyon elektron mikroskobu kullanılarak nano ölçekte sıvı-EM ve kriyo-EM analizi için uygun virüs düzenekleri hazırlamak için protokoller açıklanmaktadır.

Sıvı ve Buzdaki Virüs Düzeneklerinin Yüksek Çözünürlüklü Görüntülenmesinin İlerlemesi

Öğrenin, mikrosıvısal çip kullanarak oda sıcaklığında protein kristalleştirme ve X-ışını kırınım verisi toplama yöntemini. Dinamik ışık saçılması ile kristalleşme sürecini izleyin ve yapısal analiz yapın.

Mikrosıvısal çip Situ Crystal x-ışını kırınım ve in Situ dinamik ışık saçılma seri kristalografisi için için

Daha fazla video keşfet