Endoreduplication izole yumru önceki Akış Sitometresi tarafından ölçme

Bu deneyin genel amacı, patates yumruları içindeki endoreduplikasyon seviyelerini değerlendirmektir. Bu yöntem, yumru dokularının endoreduplicatiasyona uğradığı gelişim aşaması gibi patates yumru morfolojisi ile ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, tipik akış sitometrisi preparatlarına kıyasla çok daha net sonuçlar vermesidir.

Prosedürü gösteren Parker Laimbeer olacak. Laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi. Metin protokolüne göre çözeltiler ve tamponlar hazırladıktan sonra, patates yumrularını en az beş dakika boyunca% 71 etanole batırarak yüzey sterilize edin.

Bitki materyallerini etanolden çıkarın ve kurumaya bırakın. Her numune için steril 50 mililitrelik konik tüpler hazırlayın ve etiketleyin ve her birine 15 mililitre filtre sterilize edilmiş plazmoliz inkübasyon solüsyonu veya PIS'i ekleyin. Sterilize edilmiş bir neşter veya bir mantar kullanarak, dokuyu sterilize etme arzusunun yaklaşık bir santimetreküpü olan bir numune alın.

Dokuyu yaklaşık üç milimetreküp parçaya kabaca doğramak için sterilize neşteri kullanın. Ve dokuyu PIS içeren konik bir tüpe aktarın. Daha sonra dokuyu gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.

Patates protoplastları üretmek için, 0.71 molar mannitol, üç milimolar kalsiyum klorür, bir milimolar monopotasyum fosfat ile uygun miktarda enzim çözeltisi veya ES hazırlayıp filtreleyerek başlayın. Bir milimolar magnezyum klorür,% 4 Onozuka R-10 selülaz,% 0.8 Makerozim R-10,% 1 hemi selülaz ve% 10 milimolar MES tamponu, pH 5.8. Serolojik bir pipet kullanarak, tüplerdeki numunelerden PIS'i aspire edin.

Her numuneye 10 mililitre ES ekleyin ve tüpleri iki ila üç kez ters çevirin. Daha sonra numuneleri gece boyunca %29 Santigrat ve 180 RPM'de inkübe edin. Üçüncü günde, protoplastları hasat etmek ve yıkamak için numuneleri çalkalayıcıdan çıkarın ve yaklaşık 10 dakika dinlenmelerine izin verin.

Serolojik bir pipetle, sindirilmiş dokudan kaçınmaya özen göstererek mümkün olduğunca çok ES solüsyonunu aspire edin. Daha sonra bir mikro pipet kullanarak ve tüpü belirli bir açıyla tutarken, sindirilmiş dokudan kaçınarak kalan ES solüsyonunu tekrar çıkarın. Çekirdeğe zarar vermemek için protoplast yıkama solüsyonunun mümkün olduğunca fazlasını çıkarmak çok önemlidir.

Tüpü belirli bir açıyla tutmak, protoplastlardan ayrılırken çözeltinin çıkarılmasına yardımcı olabilir. Her numuneye 15 mililitre PWS ekleyin. Ve tüpü iki ila üç kez nazikçe ters çevirin.

Protoplastların 10 dakika oturmasına izin verin. Ardından PWS'yi çıkarmak için serolojik bir pipet kullanın. Ve kalan sıvıyı çıkarmak için bir mikro pipet.

Numuneleri buz üzerinde tutarken, her tüpe 1,5 mililitre buz gibi soğuk FCB ekleyin. Topalanmış dokuyu parçalamak için her bir numuneyi kısaca sallayın veya girdaplayın. FCB'nin hücrelere tam olarak nüfuz edebilmesi ve çekirdekleri serbest bırakabilmesi için yumru dokusu kümelerini parçalamak önemlidir.

Bu adımdan başlayarak bir kontrol eklenecekse, 1,5 mililitre buz gibi soğuk FCB'de küçük bir yaprağı ince ince doğramak için bir tıraş bıçağı kullanın. Kontrol numuneleri, deney numuneleri ile aynı kalitede, tercihen aynı genotipte olmalıdır. 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünü, ucu kesilmiş ve 106 mikrometre metal ağ dibe kadar eritilmiş olarak iki mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne yerleştirin.

Daha sonra FCB doku süspansiyonunun bir mililitresini filtreden geçirin. Her numuneye 250 mikrolitre RNA çözeltisi ekleyin. Daha sonra tüpleri ters çevirin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.

Her numuneye 125 mikrolitre önceden hazırlanmış propidyum iyodür veya PI çözeltisi ekleyin. Tüpleri ters çevirin ve 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Numuneleri mümkün olan en kısa sürede kullanın ve iki saat içinde bozulmayı önleyin.

İleri saçılmaya karşı yan dağılım ve PI'ye karşı yan saçılmanın logaritmik ölçeğini kullanarak iki nokta grafiği oluşturun. Ayrıca x ekseninde PI ile bir histogram oluşturun. Çekirdekler floresan açısından büyük farklılıklar gösterebileceğinden, tüm olayların ölçek dahilinde olduğundan emin olmak için logaritmik ölçek gereklidir.

Bir numune genotipinden in vitro yaprak dokusu gibi bilinen bir kontrol numunesinin bir tüpünü yükleyin. Ve voltajı, tüm olaylar ölçekte olacak şekilde ayarlayın. Kontrol örneğindeki 2C tepe noktasının kanalını not edin.

Deney numunelerinin 2C tepe noktaları aynı yere düşmelidir. Deneysel bir yumru örneği yükleyin ve tüm olayların ölçekli olduğundan emin olun. Ayarlamalar gerekiyorsa, 2C tepe noktalarının kanalını belirlemek için kontrol örneğinin voltaj ayarını tekrarlayın.

Yan saçılmaya karşı PI grafiğini kullanarak protoplast çekirdeklerini manuel olarak kapılayın. Ardından PI histogramını yalnızca kapılı protoplast çekirdek bölgesini gösterecek şekilde ayarlayın. Her örnekten istenen sayıda olay toplayın.

Sıklıkla araştırmacılar akış sitometrisi için 10.000 kapılı olay kullanır. Bununla birlikte, daha fazla numuneyi ve düşük konsantrasyonlu numuneleri barındırmak için burada yumru protoplast numuneleri için 2000 olay kullanılmaktadır. Patates yumrularından tekrarlanabilir akış sitometrisi sonuçları elde etmek için protoplastların üretilmesi gereklidir.

Genel morfolojisi burada gösterilmektedir. Öz ve perimedüller parankim arasındaki ayrım siyah çizgilerle gösterilmiştir. Parankimi korteksten ayıran vasküler halka siyah bir okla gösterilir.

İzole edilmiş protoplastlar, plazma zarı sağlam olacak şekilde küresel ve simetrik olmalıdır. Yaprak ve yumru protoplastları arasındaki boyut farkının yanı sıra, farklı endoreduplikasyon seviyelerini gösterebilecek bir doku içindeki boyut farklılıklarına dikkat edin. Bu şekil, hem akış sitometrisi dağılım grafiklerinde hem de histogramlarda karşılaşılabilecek sonuçlardaki varyasyonu gösterir.

Sağlam çekirdekler, hücrelerin nispi bolluğunu ölçmek için tepeler arasında temiz bir ayrım gösterirken, tepelere entegre örnekler, kaymış geniş ve örtüşen bazları gösterir. Karşılık gelen dağılım grafiklerinde, kara kutular histogramlar için nükleer olay kapısını gösterir ve olayların kümelenmesi, histogram tepe noktalarının genişliğinde yansıtılır. Endoreduplicatiasyon seviyelerini veya EI'yi analiz eden bu deney, öz dokusunun korteks dokusundan daha yüksek EI sergilediğine dair önceki sonuçları doğrulamaktadır.

Şaşırtıcı bir şekilde, parankim dokusunun profili kortekse benziyordu ve aynı zamanda öz dokusundan da önemli ölçüde farklıydı. Bu prosedürü denerken, ilk iki inkübasyon için numune sterilitesini korumayı ve protoplastlar parçalandıktan sonra numuneleri mümkün olduğunca buz üzerinde tutmayı unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, hangi genlerin tuber endoredupullikasyon seviyelerini etkilediği gibi ek soruları cevaplamak için genetik manipülasyon gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir.

Bu videoyu izledikten sonra, patates yumrularından protoplastların nasıl çıkarılacağını ve endoreduplikasyon seviyelerini araştırmak için bunları akış sitometrisine nasıl hazırlayacağınızı iyi anlamalısınız. Promidyum iyodür ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman uygun KKD gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.