Name: Kantitatif analiz Drosophila nöronal dendritik Arborization karmaşıklığı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Öğrenin Drosophila nöronal dendritik arborizasyon karmaşıklığının kantitatif analizini. Bu yöntem, SOX5 geninin nöronal gelişim üzerindeki etkisini inceleyerek nörodejeneratif hastalık mekanizmalarını anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

William A. Eimer görüntüleme teknik yardım için teşekkür etmek istiyorum. Bu eser tedavisi Alzheimer Fonu'na [R.E.T], tarafından desteklenen Ulusal Enstitüsü Sağlık [R01AG014713 ve R01MH60009 için R.E.T; R03AR063271 ve Al R15EB019704] ve Ulusal Bilim Vakfı [NSF1455613 için al].

1. deneysel hazırlık
<ol><li>Aşağıdaki reaktifler hazırlamak: Dulbecco'nın fosfat tamponlu tuz (PBS); Triton X-100; %0,2 PBST (PBS + % 0,2 Triton X-100); % 32 paraformaldehyde (PFA), %4 kullanmadan önce içine seyreltilmiş; silikon elastomer Bankası ve kür Ajan; antifade montaj Orta (Örneğin, uzatmak altın); ve tırnak Lehçe.</li>
	<li>Aşağıdaki donanımları hazırlamak: diseksiyon mikroskop, iki keskin forseps ve makas mikrodiseksiyon, pins mikrodiseksiyon, diseksiyon çanak, mikroskop slaytlar ve coverslips, confocal mikroskop yapmak için bir petri için bir dizi için ve bir Fiji ImageJ yazılımı yüklü bilgisayar.</li>
</ol>2. larvalar koleksiyonu
<ol><li>UAS-Sox102F-RNAi sinekler UAS GFP, ppk-GAL4 veya W1118 vahşi türü sinekler, sırasıyla dostum. 25 ° C'de standart koşullar sinekli kültür</li>
	<li>~ 5-6 gün içinde UAS-Sox102F-RNAi üçüncü INSTAR larvaları toplamak / ppk-GAL4, UAS GFP veya UAS GFP ve ppk-GAL4 / + diseksiyon için forseps ile dikkatli bir şekilde kontrol.</li>
</ol>3. larvalar diseksiyon
Not: Bu bölümdeki tüm yordamlar mikrodiseksiyon mikroskop altında çalışır. Büyütme oranını müfettişler kadar var. En iyi görüş görüntülemek için ayarlamak deneyin. ~ 4-6 X büyütme tavsiye edilir.
<ol><li>Bir larva silikon elastomer temel yapılan bir diseksiyon yemek ve doku kültürü Petri kabına yerleştirin.</li>
	<li>Dorsal yan yüzleri yukarıya için izin vermek için larva ağız kanca pin ve larva kuyruk pin. Dorsal tarafta ortada açık-up işaret olacak midline ortaya çıkarmak mümkün olduğu kadar yerleştirin.</li>
	<li>PBS 200 µL vücut nemi korumak için larva ekleyin.</li>
	<li>Kaudal rostral için gelen iki tracheas arasında dorsal orta çizgi boyunca makas ile bir kesim yapmak. Her larva vücut dört bir yanına küçük bir kesim yapmak.</li>
	<li>Bir PIN her vücut dört köşesine de vücudu düz yatıyor yerleştirin.</li>
	<li>Larva vücut duvar %4 oranında tamir PFA oda sıcaklığında 25 dk için.</li>
	<li>PBST içinde 5 dk. tekrar iki kez daha fazla yıkamak.</li>
	<li>Dokudan çıkarın. O zaman doku transferi bir cam slayt antifade montaj orta ile kapak ve montaj kapak notu ile. 1s için kurutma ve tırnak Lehçe kenarları mühür.</li>
</ol>4. görüntü işleme
Not: Bir ters confocal mikroskop sistemi kullanarak görüntüleri alındı. Kullanıcı bir 20 X amaç (önerilen) kullanarak örnek fotoğraf.
<ol><li>Z-serisi çekim. Confocal mikroskop yazılımında "Z-serisi çekim" iletişim kutusunu açın. Z serisi görüntüleri yakalamak için aralığı belirleyin.<ol>
<li>"İlk ve son" düğmesini tıklatın. Alt ve üst pozisyon ve giriş için değerleri belirlemek "alt:" ve "üst:" kutuları. "Adım" 0.5 µm "Z-Serisi yakalamak" iletişim kutusunda ayarlayın. Z-serisi görüntüleri için "Şimdi Çalıştır" düğmesini tıklatın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Elde edilen görüntüler *.tiff veya *.nd2 dosyası olarak kaydedin.</li>
	<li>Slaytları 4 ° C'de karanlık bir tutucu görüntüleme sonra depolama.</li>
</ol>5. dendrite değerlendirme
Not: Co-UAS-GFP içinde overexpressed GFP protein ve ppk-GAL4 da nöronların GFP floresans analiz görüntüleme için uçar. Uzunluk, dallanma ve üçüncü INSTAR larvaları da nöronların yapısını sayısal. Analiz parametrelerini uzunluğu dendrites (µm), yüzey alanı (µm2), dalları ve dallanma yapısı (%) toplam sayısını içerir. Şekil 1 ayrıntılı olarak analiz parametrelerini gösterir.
<ol><li>
Dendrites uzunluğu Not: Tüm dendrites izleyici eklenti etiketli toplamı dendrites uzunluğudur.<ol>
<li>Kurulum ve Fiji ImageJ (https://fiji.sc/)20 yazılımı çalıştırın. Görüntülerin çeşitli kanallar varsa görüntüleri ayrı kanal içine bölünmüş. Not: Bu protokol görüntüde yalnızca GFP bir kanal vardır.</li>
		<li>Koşmak "görüntü | Yığınlar | Z Projesi"Z projeksiyon; almak için Yeni pencere-ecek gözükmek adıyla 'Z-projeksiyon.' "En fazla yoğunluk" projeksiyon türü için'i tıklatın ve başlangıç dilim ile stop dilim bağlı olarak arasındaki sayıları organize bireysel tercihleri üzerine. "Tamam" ı tıklayın. Bir Z-projeksiyon görüntü dendrite projeksiyon açıkça sunma görünür.</li>
		<li>Neurites takip et.<ol>
<li>Seçin "eklentileri | Segmentasyon | Basit Neurites dendrites izlemek için izleme"penceresinde. Nöron soma bulun ve sonra hücre gövdesi ve bu dendrite başka bir nokta uç başlayan bir dendrite bir noktada tıklatın. Not: Program iki nokta mavi çizgi ile bağlanır.</li>
			<li>Basın "Y" eklentisi penceresinde yol boşsa; dendrite yolu görünür görüntüleri seçilen yolun bitiş noktaları kadar izini sürdüm. "Tam yolu" aynı eklenti penceresini tıklatın; segment tamamladı (Şekil 2). Not: Bazı dendrites yolu daha küçük parçalara bölündü başlangıç noktaları uzak sona erdi. Segmentleri izleyici için tam bir yol sağlamak için kombine edilmiştir.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Bir yol tamamlandıktan sonra yeni bir noktasına nerede dallar dön. Yeni yol inşa; "Bütün yollar" pencere kutusu tüm yolları (Şekil 3) uzunluğu değerini gösterir. İzleme dosyasını kaydedin ve Şekil 2' de gösterildiği gibi yarım kalmış izleri ile devam.</li>
		<li>Birini tıklatarak, dendrite uzunluğu veri verme "dosya | *.CVS 'Eklenti' penceresinde vermek". Kadar tüm yol uzunlukları toplamı ve verileri bir veri analizi/elektronik tablo yazılımı için verin. (Şekil 3).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Da nöronların yüzey alanı
	<ol>
<li>Serbest çizim aracı 'Fiji ImageJ' penceresinde seçin. Yolu izlemek ve bitiş noktaları bağlayın. 'Analiz et' menüde "Set ölçümleri | Alanı." "Ölçü" 'Analiz et' menüsünden'ı tıklatın. Sonuç seçili alanı (Şekil 4) için değer ile yeni bir kutu görünür. Veri analiz yazılımı için kopyalayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Toplam şube sayısı ve dallanma yapısı da nöronların
	<ol>
<li>"Analiz" açarak toplam şube sayısını hesaplamak ve sonra "Render | Skeletonized yolları eklentisi penceresinde (Şekil 5) izleme analiz". Not: Arbor yapısını dalları düzeyde toplamıdır. Yolun hücre vücut ve dendrite ipuçları arasında tanımlanmış olan ve birincil arbors nöron hücre vücuttan dendrites gibi bir yol birden çok dalları, içerebilir. İkincil arbors birincil ve benzeri Tersiyer, Kuvaterner ve beşli arbors ile gelen dallar. Dendrite dallanma yapısı dalları düzeylerine bağlı olarak ayrılır. Örneğin, birincil % dalları dallanma toplam numarasına göre bölünmüş ve vb. sayısıdır.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Wassle, H., Boycott, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+architecture+of+the+mammalian+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Functional architecture of the mammalian retina.</a> Physiol Rev. 71 (2), 447-480 (1991).</li>
<li>MacNeil, M. A., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extreme+diversity+among+amacrine+cells%3A+implications+for+function%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Extreme diversity among amacrine cells: implications for function.</a> Neuron. 20 (5), 971-982 (1998).</li>
<li>Losonczy, A., Makara, J. K., Magee, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalized+dendritic+plasticity+and+input+feature+storage+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Compartmentalized dendritic plasticity and input feature storage in neurons.</a> Nature. 452 (7186), 436-441 (2008).</li>
<li>Spruston, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyramidal+neurons%3A+dendritic+structure+and+synaptic+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pyramidal neurons: dendritic structure and synaptic integration.</a> Nat Rev Neurosci. 9 (3), 206-221 (2008).</li>
<li>Jaworski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+microtubules+regulate+dendritic+spine+morphology+and+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Dynamic microtubules regulate dendritic spine morphology and synaptic plasticity.</a> Neuron. 61 (1), 85-100 (2009).</li>
<li>Kweon, J. H., Kim, S., Lee, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+basis+of+dendrite+pathology+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22BMB+Rep%22%5BJournal%5D)">The cellular basis of dendrite pathology in neurodegenerative diseases.</a> BMB Rep. 50 (1), 5-11 (2016).</li>
<li>Baloyannis, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+pathology+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Sci%22%5BJournal%5D)">Dendritic pathology in Alzheimer's disease.</a> J Neurol Sci. 283 (1-2), 153-157 (2009).</li>
<li>Masliah, E., Terry, R. D., Alford, M., DeTeresa, R., Hansen, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+and+subcortical+patterns+of+synaptophysinlike+immunoreactivity+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Cortical and subcortical patterns of synaptophysinlike immunoreactivity in Alzheimer's disease.</a> Am J Pathol. 138 (1), 235-246 (1991).</li>
<li>Wayman, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+dendritic+arborization+mediated+by+CaM-kinase+I+activation+and+enhanced+CREB-dependent+transcription+of+Wnt-2%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent dendritic arborization mediated by CaM-kinase I activation and enhanced CREB-dependent transcription of Wnt-2.</a> Neuron. 50 (6), 897-909 (2006).</li>
<li>Rosso, S. B., Sussman, D., Wynshaw-Boris, A., Salinas, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling+through+Dishevelled%2C+Rac+and+JNK+regulates+dendritic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling through Dishevelled, Rac and JNK regulates dendritic development.</a> Nat Neurosci. 8 (1), 34-42 (2005).</li>
<li>Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+levels+of+the+homeodomain+protein+cut+regulate+distinct+dendrite+branching+patterns+of+Drosophila+multidendritic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Different levels of the homeodomain protein cut regulate distinct dendrite branching patterns of Drosophila multidendritic neurons.</a> Cell. 112 (6), 805-818 (2003).</li>
<li>Sugimura, K., Satoh, D., Estes, P., Crews, S., Uemura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+morphological+diversity+of+dendrites+in+Drosophila+by+the+BTB-zinc+finger+protein+abrupt%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Development of morphological diversity of dendrites in Drosophila by the BTB-zinc finger protein abrupt.</a> Neuron. 43 (6), 809-822 (2004).</li>
<li>Jan, Y. N., Jan, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Branching+out%3A+mechanisms+of+dendritic+arborization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Branching out: mechanisms of dendritic arborization.</a> Nat Rev Neurosci. 11 (5), 316-328 (2010).</li>
<li>Sears, J. C., Broihier, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxO+regulates+microtubule+dynamics+and+polarity+to+promote+dendrite+branching+in+Drosophila+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">FoxO regulates microtubule dynamics and polarity to promote dendrite branching in Drosophila sensory neurons.</a> Dev Biol. 418 (1), 40-54 (2016).</li>
<li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+of+the+Drosophila+ortholog+of+SOX5+leads+to+abnormal+neuronal+development+and+behavioral+impairment%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Silencing of the Drosophila ortholog of SOX5 leads to abnormal neuronal development and behavioral impairment.</a> Hum Mol Genet. 26 (8), 1472-1482 (2017).</li>
<li>Misra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Genome-Wide+Screen+for+Dendritically+Localized+RNAs+Identifies+Genes+Required+for+Dendrite+Morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22G3+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">A Genome-Wide Screen for Dendritically Localized RNAs Identifies Genes Required for Dendrite Morphogenesis.</a> G3 (Bethesda). 6 (8), 2397-2405 (2016).</li>
<li>Emoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+dendritic+branching+and+tiling+by+the+Tricornered-kinase%2FFurry+signaling+pathway+in+Drosophila+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Control of dendritic branching and tiling by the Tricornered-kinase/Furry signaling pathway in Drosophila sensory neurons.</a> Cell. 119 (2), 245-256 (2004).</li>
<li>Olesnicky, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+use+of+RNA-binding+proteins+in+Drosophila+sensory+neuron+dendrite+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22G3+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">Extensive use of RNA-binding proteins in Drosophila sensory neuron dendrite morphogenesis.</a> G3 (Bethesda). 4 (2), 297-306 (2014).</li>
<li>Parrish, J. Z., Xu, P., Kim, C. C., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microRNA+bantam+functions+in+epithelial+cells+to+regulate+scaling+growth+of+dendrite+arbors+in+drosophila+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The microRNA bantam functions in epithelial cells to regulate scaling growth of dendrite arbors in drosophila sensory neurons.</a> Neuron. 63 (6), 788-802 (2009).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecules+and+mechanisms+of+dendrite+development+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila.</a> Development. 136 (7), 1049-1061 (2009).</li>
<li>Jinushi-Nakao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knot%2FCollier+and+cut+control+different+aspects+of+dendrite+cytoskeleton+and+synergize+to+define+final+arbor+shape%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Knot/Collier and cut control different aspects of dendrite cytoskeleton and synergize to define final arbor shape.</a> Neuron. 56 (6), 963-978 (2007).</li>
<li>Crozatier, M., Vincent, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+multidendritic+neuron+differentiation+in+Drosophila%3A+the+role+of+Collier%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Control of multidendritic neuron differentiation in Drosophila: the role of Collier.</a> Dev Biol. 315 (1), 232-242 (2008).</li>
<li>Copf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+gene+dosage+in+controlling+dendritic+arbor+formation+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Importance of gene dosage in controlling dendritic arbor formation during development.</a> Eur J Neurosci. 42 (6), 2234-2249 (2015).</li>
<li>Rosso, S. B., Inestrosa, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WNT+signaling+in+neuronal+maturation+and+synaptogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">WNT signaling in neuronal maturation and synaptogenesis.</a> Front Cell Neurosci. 7, 103(2013).</li>
<li>Engel, T., Hernandez, F., Avila, J., Lucas, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full+reversal+of+Alzheimer%27s+disease-like+phenotype+in+a+mouse+model+with+conditional+overexpression+of+glycogen+synthase+kinase-3%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Full reversal of Alzheimer's disease-like phenotype in a mouse model with conditional overexpression of glycogen synthase kinase-3.</a> J Neurosci. 26 (19), 5083-5090 (2006).</li>
<li>Longair, M. H., Baker, D. A., Armstrong, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+Neurite+Tracer%3A+open+source+software+for+reconstruction%2C+visualization+and+analysis+of+neuronal+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Simple Neurite Tracer: open source software for reconstruction, visualization and analysis of neuronal processes.</a> Bioinformatics. 27 (17), 2453-2454 (2011).</li>
<li>Pool, M., Thiemann, J., Bar-Or, A., Fournier, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NeuriteTracer%3A+a+novel+ImageJ+plugin+for+automated+quantification+of+neurite+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">NeuriteTracer: a novel ImageJ plugin for automated quantification of neurite outgrowth.</a> J Neurosci Methods. 168 (1), 134-139 (2008).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Epidermis innervate dendrites nöronların giriş bölgeleridir ve onların türleri morfoloji nasıl bilgi alınır ve bireysel nöronlar tarafından işlenen belirler. Geliştirme dendrite morfoloji gen modülasyon dendrite organizasyon yansıtır. Drosophila larva da nöron periferik sinir sisteminin dendrite geliştirme eğitimi için önemli bir model olduğunu: 1) memeliler11,12ile; fonksiyonel benzerlik 2) dört sınıf ayrımlar dendrite yapısı11<s...

Dendrites, bir nöron dallı projeksiyonlar olan nöron'ın duyusal ve sinaptik girişleri diğer neurons1,2kapsar alan kapak. Dendrites sinaps oluşumu önemli bir bileşenidir ve sinaptik girişleri entegre yanı sıra bir nöron elektrokimyasal stimülasyon yayılıyor kritik bir rol oynamaktadır. Dendritik arborization (da) hangi nöronlar yeni dendritik ağaçlar ve dalları yeni sinapslar oluşturmak için formu bir süreçtir. Geliştirme ve morfoloji da şube yoğunluğu ve gruplandırma desenleri, gibi çok adımlı biyolojik süreçlerden neden ve son derece için nöronal fonksiyonu ilişkili. Bu iletişim kuralının amacı nöronal dendritric arborization karmaşıklık içinde Nicel analiz için bir yöntem sağlamaktır Drosophila.
Dendrites karmaşıklığını ortak neurons girdileri, bağlantı ve sinaptik türünü belirler. Dendrites yoğunluğu ve dallanma desenleri dendritik alanı3,4yakınsama sinyal işleme içinde söz konusu. Dendrites geliştirme ayarı için esnekliğe sahip olursunuz. Örneğin, sinaptik sinyal gelişim aşamasında somatosensor nöron ve olgun sinir sistemi5dendrite organizasyon üzerinde bir etkisi yoktur. Nöronal bağlantısı kurulması morfogenez ve olgunlaşma dendrites dayanmaktadır. Dendrites malformasyon Engelli nöronal fonksiyon ile ilişkilidir. Çalışmalar da nöron morfogenez anormallik Alzheimer hastalığı (Ah), Parkinson hastalığı (PD), Huntington hastalığı (HD), dahil olmak üzere birden çok nörodejeneratif hastalıklar ve Lou Gehrig hastalığı etiologies katkıda göstermiştir / Amyotrofik lateral skleroz (ALS)6,7,8. Sinaptik değişiklikler reklam, erken dönemde gerileme ve nöron işlev7,8bozulma ile uyum içinde görünür. Ancak, nasıl bu nörodejeneratif hastalıkların patogenezinde dendrite patoloji katkıda özelliklerini zor kalır.
Dendrites gelişimini düzenleyiciler, proteinler9,10, transkripsiyon faktörleri ve hücre yüzey reseptörlerinin11,12 ligandlar Wnt aile gibi karmaşık bir ağ kodlamak genler tarafından düzenlenmiştir . Hangi Sınıf IV da nöronların en karmaşık dallanma desenleri var ve daha iyi anlama morfogenez13için güçlü bir deneysel sistem olarak istihdam edilmiştir (sınıf ı, II III, IV) dört sınıf, Drosophila da nöronların oluşur, 14. Sırasında erken morfogenez, overexpression ve/veya Sınıf IV da nöronların genlerin RNAi susturmak dallanma desen ve dendrite budama13değiştirilmesine neden. Nöronal dendritik arborization kantitatif analiz için pratik bir yöntem geliştirmek önemlidir.
Biz daha önce SOX5 Drosophila ortholog susturmak, Sox102F, daha kısa dendrites da nöronların ve Sınıf IV da nöronların15Azaltılan karmaşıklık neden olduğunu göstermiştir. Burada, kantitatif analiz (NDAC) nöronal dendritik arborization karmaşıklığı için yordam Drosophilaiçinde mevcut. Bu iletişim kuralı, önceki açıklanan yöntemi adapte da duyusal sinir hücreleri gelişimi tahlil için kısa bir yöntem sağlar. Sağlam resim etiketleme ve üçüncü INSTAR larva vücut duvar16,17,18,'19da nöron gösterilmektedir. NDAC ve gelişimsel farklılıkları vivo içindearaştırmak isteyen araştırmacılar için değerli bir protokoldür.

<table><tbody><tr><td>Fosfat tamponlu salin (PBS)</td> <td>Gibco Yaşam Bilimleri</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit (PFA)</td> <td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>15714-S</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 silikon elastomer baz ve kürleme maddesi</td><td>Dow Corning Corportation</td><td>3097366-0516; 3097358-1004</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Altın Antifade Mountant</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>Tırnak cilası&nbsp;</td><td>CVS</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>Stereo mikroskop</td><td>Nikon</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>Konfokal mikroskop</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti-E</td><td></td></tr><tr><td>Petri kabı</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>Forseps</td><td>Dumont</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>Makas&nbsp;</td><td>Roboz Cerrahi Alet Co</td><td>RS-5611</td><td></td></tr><tr><td>Böcek İğneleri&nbsp;</td><td>Roboz Cerrahi Alet Co</td><td>RS-6082-25</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop slaytları ve lamel</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-188-52</td><td></td></tr></tbody></table>

kantitatif analiz drosophila nöronal dendritik arborization karmaşıklığı

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

Dendrites bir nöron dallı projeksiyonları vardır ve sinir sisteminin gelişimi sırasında sinaptik kuruluşunda dendritik morfoloji yansıtır. Drosophila larva nöronal dendritik arborization (da) morfogenez sinir dendrites ve gen fonksiyon sinir sisteminin gelişiminde eğitim için ideal bir modeldir. Da nöronların dört sınıflardır. Sınıf IV en neredeyse larva beden Duvarı'nın tüm alanı kaplamaktadır dallanma desenli karmaşıktır. Daha önce SOX5 Drosophila ortholog Sınıf IV nöronal dendritik arborization karmaşıklık (NDAC) dört parametre kullanarak susturmak etkisini nitelendirmiştir: dendrites uzunluğu, dendrite kapsama, yüzey alanı Şube ve dallanma yapısı toplam sayısı. Bu iletişim kuralı NDAC kantitatif analiz, larva diseksiyon, confocal mikroskobu ve görüntü analiz prosedürleri ImageJ yazılımını kullanarak iş akışı sunar. Da nöronal gelişim ve onun temel mekanizmaları içine daha fazla fikir nöronal fonksiyon anlayış geliştirmek ve nörolojik temel nedenleri hakkında ipuçları sağlayabilir ve nörogelişimsel bozukluklar.

Dendrites da nöronların co-overexpressing GFP (UAS GFP; ppk-GAL4) tarafından da sinirsel soma ve dendritik arbors GFP floresans analiz görüntüleme için etiketli. Da nöron dendrites morfoloji bir ters confocal mikroskobu (Şekil 2) tarafından görüntüsü.
Dendrites da nöronların Fiji ImageJ yazılımını kullanarak takip edildi. Dosyayı dendrite uzunluğu (Şekil 3) tahmin etmek...

Bu iletişim kuralı dendritik morfogenez çalışmaları için kullanılan Drosophila, nöronal dendritik arborization karmaşıklık (NDAC) kantitatif analiz üzerinde duruluyor.

Kantitatif analiz Drosophila nöronal dendritik Arborization karmaşıklığı

Dendrites are the branched projections of a neuron, and dendritic morphology reflects synaptic organization during the development of the nervous system. ...

Bu işlemin genel amacı Drosophila nöronal gelişim sırasında dendritik arborization nöronların karmaşıklığı Üzerinde SOX5 geninin etkisini gözlemlemektir. Bu yöntem nörodejeneratif hastalık genlerini daha iyi anlamak için nöro-dendritlerin morfogenezinin ve sinir sisteminin gelişimindeki gen fonksiyonunun incelenmesine yardımcı olabilir. Sonuçta bu teknik nöro-dendritler birçok farklı tipte kullanılabilir dendritler karmaşıklığı, bir nicel analiz sağlar.Mutasyon gen fonksiyonunu anlamak için anahtar tutar, çünkü bu tekniğin etkileri nöro-dejeneratif hastalığın genetik mekanizması doğru uzanır. UAS-GFP'nin kurulum çaprazları;ppk-GAL4 ile UAS-Sox102F-RNAi suşu sinekleri veya W118 kontrolleri. Kültür 25 santigrat derecede standart koşullar altında uçar.Yaklaşık beş ila altı gün içinde, dikkatle diseksiyon için üçüncü instar larvaları toplamak için forseps kullanın. Silikon elastomer tabanından yapılmış bir diseksiyon kabına ve doku kültürü Petri kabına bir larva yerleştirin. Sonra diseksiyon mikroskobu altında çanak yerleştirin.Şimdi orta hattı ortaya çıkarmak için larva kuyruğunu sabitle. Sonra larva ağız kancaları pin böylece larvanın dorsal tarafı kadar. Şimdi larva çözeltisi batırmak için çanak PBS 200 mikrolitre ekleyin.Sonra, küçük kesiler ile larva kuyruk ve ağız kesti. Sonra dorsal orta hat boyunca ve iki trakea arasında larva açık kesip, rostral için kaudal gidiyor. Sonra vücudun dört köşesinin her birine bir iğne yerleştirin, böylece vücut düz yatıyor.Şimdi oda sıcaklığında 25 dakika boyunca% dört PFA larva vücut duvarı düzeltmek. Daha sonra larvayı PBS ile üç kez yıkayın ve yıkama başına beş dakika yıkayın. Yıkar sonra, pimleri çıkarın ve bir cam slayt üzerine doku aktarın.Daha sonra dokuyu antifade montaj ortamına batırın ve bir kapak fişi ile monte edin. Kulak lığı üzerine tırnak cilası ile sızdırmazlık yapmadan önce monte edilen dokunun bir saat boyunca kurumasını bekleyin. Bu slaytları karanlıkta dört santigrat derecede saklayın.20X hedefi kullanarak bir konfokal mikroskop ile z-serisi görüntüleri yakalayın. İlk olarak, larva vücut duvarında DA nöronların tüm içerecek şekilde z-adımlar aralığı ayarlayın, ve yarım mikrometre için adım boyutunu ayarlayın. Ardından görüntüleri işlemek için TIF veya ND2 dosyaları olarak saklayın.Daha sonra, DA nöronlar üzerinde dendritlerin sayısı ve morfolojisi değerlendirmek. Uzunluklarını değerlendirmekle başla. İlk olarak, Fiji ImageJ'de, gerekirse görüntüleri ayrı kanallara bölün.Sadece GFP kanalının değerlendirilmesi gerekir. Sonra, bir z-projeksiyon yapmak. Yeni pencerede, projeksiyon türü için maksimum yoğunluğu seçin ve dilimleri başlat ve durdur'u seçin.Ardından, net dendrite projeksiyonları içeren bir z-projeksiyon görüntüsü oluşturmak için Tamam'ı tıklatın. Şimdi eklenti aracını kullanarak nöritlerin izini sür. İlk olarak, ilgi nöron soma gidin ve bir dendrite hücre vücudundan ortaya çıktığı yere tıklayın.Sonra bu dendrite ucunda tıklayın. İki noktayı birbirine bağlayan mavi çizgi neuritin uzunluğunu çalıştırıyorsa, evet için Y tuşuna basın. Daha sonra bu satır neurite tam yol uyuyorsa, tam yol tıklatın.Çizgi yola uymuyorsa, yolu neuritin uzunluğuna uyacak birden çok satır segmentine bükmek için bu neurite boyunca daha ilerideki noktalara tıklayın. Sonra, tam yol tıklatın ve bir sonraki neurite için yol işaretleme ile devam edin. Tüm izleme yollarını tamamladıktan sonra, yolları bir CSV dosyasına aktarmak için Çözümleme, Yolları Ölçüle seçeneğini seçin.Çözümleme için yol uzunluklarının ortalama değerini hesaplamak ve ortalama değeri için bu verileri kullanın. Sonra, nöronun yüzey alanını hesaplayın. İlk olarak, Fiji ImageJ penceresinden ücretsiz el çizim aracını seçin.Sonra, ilgi nöronun bitiş noktaları bağlayın. Ardından, Çözümle penceresinden Ölçüle seçeneğini belirleyin. Sonuç, seçilen alanın değerine sahip yeni bir kutuda görünür.Bu değeri veri çözümleme yazılımına kopyalayın. Son olarak, İskeletize Yolları Çözümle eklentisini kullanarak toplam dal sayısını hesaplayın. DA nöronların dendritleri, GFP floresangörüntüleme analizi için soma ve dendrit arbors'larında gfp'yi aşırı eksprese ederek etiketlendi.Dendritlerin morfolojisi ters konfokal mikroskop kullanılarak görüntülendi. DA nöronların dendritleri tarif edildiği gibi izlendi. Dosya dendrite uzunluğunu tahmin etmek için kullanıldı.Üçüncü instar larvasında DA nöronlarında Sox102F'nin susturulması, dal uzunluğunun yaklaşık yarısı ve daha basit bir yapıya sahip dendritlerin toplam sayısında önemli bir azalmaya yol açmış ve dal sayısının sadece yarısını göstermiştir. Mantıksal olarak, bu arbor yüzey alanında azalmaya yol açtı. Bu protokol DA duyusal nöronların gelişimini değerlendirmek için hızlı bir yöntem sağlar.Bu yordamı çalışırken, iyi bir kapsama almak için DA nöronlar her grup görüntüleri bol sayıda almak için emin olun. Bu prosedürü takiben dendrite gelişimi ile ilgili ek soruları cevaplamak için dendrite analizi gibi diğer yöntemler de uygulanmaktadır. Bu gelişme beri, bu teknik nörolojik alanında araştırmacılar Alzheimer model sistemleri kullanarak gibi nörodejeneratif hastalık içine çıkarımlar yapmak yardımcı oldu.

quantitative-analysis-neuronal-dendritic-arborization-complexity

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Çok sayıda yeni çalışmalar sinaptik proteinlerin beyin patolojileri ile ilişkili mutasyonlar belirledik. Primer kültür kortikal nöronların dendritik omurga morfoloji ve motilite bu hastalıkla ilişkili proteinlerin etkilerini inceleyen büyük esneklik sunar.

Kültür MSS Nöronlar Dendritik Omurga Morfoloji Analizi

Morfolojik analiz Drosophila</emGenetik Mozaikler> Larvaların Periferik Duyusal Nöron Dendritler ve Aksonlar

Kaynak: Ting, C., et al., Sütunlarda ve Katmanlarda Dendritik Morfolojiyi Analiz Etme. J. Vis. Uzm. (2017)Bu video, bir Drosophila beyni hazırlama, konfokal bir mikroskop altında GFP etiketli medulla dendritlerinin yatay ve önden görüntü yığınlarını yakalama ve katmanlar ve sütunlar arasındaki morfolojilerini analiz etmek için bir 3D rekonstrüksiyon oluşturma prosedürünü göstermektedir.

Drosophila Medulla Katmanları ve Sütunları Boyunca Dendritik Morfolojinin Analizi

Fare modellerinin hipokampusunda dendritik arborizasyonun görselleştirilmesi ve ölçülmesi için iki yöntem açıklıyoruz: gerçek zamanlı ve genişletilmiş alan derinliği görüntüleme. İlk yöntem, karmaşık topografik izlemeye ve dallanma derecesinin ölçülmesine izin verirken, ikincisi dendritik ağacın hızlı bir şekilde görselleştirilmesine izin verir.

Farelerde Hipokampal Bölgesi Dentate Gyrus dendritik arborization Değerlendirilmesi

Drosophila larva dendritik arborization (da) nöronları kullanarak nöronal morfolojilerinden Çalışmaları Immünofloresan nöronal ve epidermal proteinlerin in situ görselleştirme yarar. Larva vücut duvarı kas dokusu kaldırarak da nöronlar ve çevresindeki epidermal hücrelerin immünoflüoresans analizi artıran bir prosedür açıklanmaktadır.

Kaldırılması<em&gt; Drosophila</emDuyu Nöronlar ve Epidermal Hücre İmmünofloresan Analizi Larvaların Fileto dan&gt; Kas Dokusu

Burada sayı ve Drosophila melanogaster fotoreseptör sinaptik aktif bölgelerin mekansal dağılımını ölçmek için nasıl göstermek, genetik olarak kodlanmış moleküler işaretleyici ile vurgulanır ve ışığa uzun süreli maruz kalma sonrasında kendi modülasyonu.

Synaptic Modülasyon Analizi<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Uzun süreli ışığa maruz kaldıktan sonra Fotoreseptörler

İki görüntü analiz algoritmaları, "Drosophila NMJ Morfometri" ve "Drosophila NMJ Bouton Morfometri" otomatik Drosophila nöromüsküler kavşakta (NMJ) dokuz morfolojik özelliklerini ölçmek için, yaratıldı.

Yüksek throughput ve Çok parametrik Nicelik için iki Algoritmalar<em&gt; Drosophila</em&gt; Nöromusküler Junction Morfoloji

Burada, sütunlar ve katmanlar halinde Drosophila medulla nöronların dendritik yönlendirmesini nasıl analiz edileceğini göstermektir. iş akışı, izleme referans sütun dizisine dendritik milleri tescili için ve 3 boyutlu uzayda dendritik yapıların analizi için görüntü kalitesi ve hesaplama araçlarını geliştirmek için bir çift görünümü görüntüleme tekniği içerir.

Sütunlar ve Katmanlar dendritik Morfoloji Analizi

Burada ayrıntılı bir Golgi-Cox protokolünü sunuyoruz. Bu güvenilir doku lekesi metodu, minimal sorun giderme ile hipokampustaki ve tüm beyindeki sitolojik mimarinin yüksek kaliteli bir değerlendirmesini sağlar.

Yaşlı Bir Farede Hipokampal Dendritik Karmaşıklığın Golgi-Cox Yöntemi ile Değerlendirilmesi

Burada, Drosophila larva beyninin canlı bir hazırlığında son derece hareketli dendritik filopodia'yı görüntülemek için uyguladığımız yöntemi ve dendritin kantitatif değerlendirmeleri için hızlandırılmış 3D görüntüleme veri kümelerini ölçmek için geliştirdiğimiz protokolü anlatıyoruz. nöronlar gelişmekte dinamikleri.

Drosophila Nöronlarının Geliştirilmesinde Hızlı Dendritik Dal Dinamiğinin Hızlandırılmış Canlı Görüntüleme ve Nicelleştirilmesi

Öğrenin Drosophila nöronal dendritik arborizasyon karmaşıklığının kantitatif analizini. Bu yöntem, SOX5 geninin nöronal gelişim üzerindeki etkisini inceleyerek nörodejeneratif hastalık mekanizmalarını anlamaya yardımcı olur.

Kantitatif analiz Drosophila nöronal dendritik Arborization karmaşıklığı

Daha fazla video keşfet