Hibridizasyon uyarlaması yakalama kromatin ilişkili proteinlerin proteomik memeli hücreleri için

Bu yöntem, kodlamayan bölgelerdeki hastalıkla ilişkili dizi varyantlarının, protein bağlanmasını değiştirerek gen ekspresyonunu ve düzenlemeyi nasıl etkilediği gibi, genom düzenlemesi anlayışımızdaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir ve bu proteinlerin tanımlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, hücrelerin veya dokuların veya antikorların herhangi bir genetik manipülasyonunu gerektirmemesi ve o lokusta DNA ile etkileşime girebilecek DNA bağlayıcı proteinler hakkında önceden bilgi sahibi olmamasıdır. Bu prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir teknisyen olan Danu Perumalla olacak.

Metin protokolüne göre oligonükleotidler tasarlandıktan sonra, 6 mililitre RPMI 1640 ortamındaki bir T25 şişesinde 2 ila 5 kez 5. lenfoblastoid hücrelere veya diğer hücre hatlarına 2 ila 5 kez plaka koyun, %1 Pen Strep, 2 mil veya daha fazla L-glutamin ve %5 FBS ile desteklenmiştir. Hücreleri 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Hücre yoğunluğunu ölçmek için bir hemositometre veya otomatik bir hücre sayacı kullanın.

Hücreler mililitre başına 1 çarpı 10 ila 6 hücreye ulaşmadan önce, beş dakika boyunca 100 kez G'de döndürün ve bu videoda daha önce hazırlanan 25 mililitre RPMI 1640 ortamı içeren bir T75 şişesine aktarın. Hücreleri, mililitre başına 1 çarpı 10 ila 6 hücre yoğunluğuna ulaşana kadar büyütün, daha sonra hücreleri aynı ortamın 38 mililitresinde bir T150 şişesine aktarın ve iki gün daha büyütün. Daha sonra, hücreleri beş dakika boyunca 100 kez G'de döndürün ve 10 mililitre RPMI 1640 ortamında yeniden süspanse edin.

Daha sonra süspansiyonu 500 mililitre ortam içeren 1850 santimetre karelik bir silindir şişeye dökün ve hücreleri, sabit rotasyon dışında, daha önce olduğu gibi aynı koşullar altında inkübe edin. İstenilen hücre sayısına ulaşıldığında, kültürü beş dakika boyunca 100 kez G'de döndürün ve hücreleri 36 mililitre RPMI 1640 ortamında yeniden süspanse edin. Daha sonra hücre süspansiyonunu 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve hücre sayımı ve DNA ekstraksiyonu için küçük alikotları çıkarın.

Hücreleri çapraz bağlamak için,% 1'lik bir nihai konsantrasyona ulaşmak için 1 mililitre% 37 formaldehit ekleyin,% 1 Daha sonra hücreleri oda sıcaklığında 10 ila 30 RPM'de 10 dakika inkübe edin. 125 milimolar nihai konsantrasyon için 2 mililitre 2.5 molar glisin çözeltisi ekleyerek çapraz bağlama reaksiyonunu söndürün. Daha sonra hücreleri beş dakika boyunca rotasyonla inkübe edin.

Hücreleri santrifüjleme ile peletledikten sonra, hücreleri iki kez yıkamak için buz gibi 1X PBS kullanın. Hücrelerin parçalanması ve sarılması ile devam edin veya peleti 5 mililitre hücre lizis tamponunda yeniden süspanse edin ve süspansiyonu sıvı nitrojen içinde damla damla dondurun. Ardından numuneleri eksi 80 santigrat derecede saklayın.

Lizis ve sheering yapmak için, peleti 20 mililitre hücre lizis tamponunda yeniden süspanse edin. Hücreleri 400 kez G'de, 4 santigrat derecede beş dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve hücreleri proteaz inhibitörleri ile 6 mililitre çekirdek lizis tamponunda yeniden süspanse edin.

Sonikasyon için hazırlanırken, numuneyi eşit olarak altı ila sekiz Mikrofuj tüpüne bölün. Numuneleri buza veya soğuk bir rafa yerleştirin ve süspansiyonun darbeler arasında en az 40 saniye soğumasına izin vererek, beş adet 20 saniyelik sabit patlama ile% 65 genlikte sonikasyon yapmak için mikro uçlu bir sonikatör kullanın. Hücreleri 10 dakika boyunca 12.000 kez G ve 4 santigrat derecede santrifüjleyin, ardından süpernatanı yeni bir tüpe aktarın ve peletleri atın.

Florometri kullanarak toplam geri kazanımı tahmin ettikten sonra, numuneleri dondurun. Metin protokolüne göre hibridizasyon ve yıkama tamponlarının hazırlanmasını takiben, 600 mikrolitre boncuğu üç kez yıkamak için 1.200 mikrolitre 1X hibridizasyon tamponu kullanın. Daha sonra boncukları yeniden süspanse etmek için 1.200 mikrolitre 2X hibridizasyon tamponu kullanın.

1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerine, 600 mikrolitre numune, 2X hibridizasyon tamponunda süspanse edilmiş 120 mikrolitre yıkanmış boncuk ve 480 mikrolitre 2X hibridizasyon tamponu ekleyin. Tüpleri 31 santigrat derecede ve 10 dakika boyunca 30 ila 60 RPM'de inkübe edin. Daha sonra tüpleri boncuklar hareketsiz hale gelene kadar bir mıknatıs üzerine yerleştirin ve boncukları atmadan önce numuneleri yeni tüplere aktarın.

Yakalama oligonükleotidlerini mikrolitre başına 10 pikomollük bir çalışma çözeltisine yeniden süspanse edin ve her tüpe bu çözeltiden 4 mikrolitre ekleyin. Tüpleri 42 santigrat derecede 30 ila 60 RPM'de 40 dakika inkübe edin. Kuluçka sırasında, gerekli boncukları bir kenara koyun, boncukları daha önce olduğu gibi üç kez yıkayın, ancak bu sefer yeniden süspanse etmek için 1X hibridizasyon tamponu kullanın.

Yıkanmış boncukları tüplere ekleyin ve numuneleri oda sıcaklığında 30 ila 60 RPM'de 30 dakika inkübe edin. Tüpleri mıknatısın üzerine yerleştirin ve boncuklar hareketsiz hale getirildikten sonra süpernatanı çıkarın. Boncukları yıkadıktan sonra, 40 mikrolitre moleküler dereceli su ekleyerek numuneyi elüte edin ve tüpleri 94 santigrat derecede beş dakika inkübe edin.

Tüpleri mıknatısın üzerine yerleştirin ve çözelti temizlenene kadar birkaç dakika bekleyin, ardından süpernatanı yeni bir tüpe aktarın ve boncukları atın. Numuneyi eksi 80 santigrat derecede saklayın veya metin protokolüne göre proteomik analize devam edin. Yakalama verimini değerlendirmek için, elüatın bir ila on tanesini seyreltmek için moleküler dereceli su kullanın.

Videoda daha önce çekilen bir alikottan DNA'yı çıkardıktan sonra, beş seri bir ila on seyreltme ile standart bir eğri hazırlamak için DNA örneğini ve moleküler dereceli suyu kullanın. Primerler ve problar ekleyerek bir qPCR ana karışımı hazırlayın ve reaksiyonun her bir oyuğuna uygun miktarı dağıtın. Her bir oyuka, şablon kontrolü olarak hizmet etmek için seyreltilmiş numuneden, standart eğriden veya moleküler dereceli sudan 5 mikrolitre ekleyin.

Plakayı kapatın ve bir dakika boyunca 100 kez G'de döndürün. Ardından, metin protokolünde bulunan parametreleri kullanarak örnekleri bir qPCR sisteminde çalıştırın. Son olarak, verimleri değerlendirmek için standart eğriyi ve yakalama özgüllüğünü değerlendirmek için şifreli yakalamayı kullanın.

Burada, oligonükleotidlerin titrasyonu kullanılarak yapılan hibridizasyon yakalamaları gösterilmiştir. Oligonükleotidlerin sayısı kademeli olarak artarken, toplam konsantrasyon sabit tutulur. Bu deney, optimum hibridizasyon verimliliğine ulaşmak için kaç farklı oligonükleotidin gerekli olduğunu belirlemeye yardımcı olur.

Aynı zamanda, belirli bir oligonükleotid seti arasındaki herhangi bir belirgin zararlı hibridizasyon etkileşimini ve zayıf özgüllüğe sahip herhangi bir oligo olup olmadığını, yüksek arka plana neden olduğunu ortaya çıkarır. Çapraz bağlı kromatindeki fragmanların büyük bir kısmı, hibridizasyon yakalaması için uygun olmayacaktır. Hibridizasyon yakalaması başarılı bir şekilde çalıştırılırsa, aynı kromatin malzemesinin farklı bir yakalama oligonükleotid seti kullanılarak yapılan bir sonraki yakalama deneyi, taze kromatin kullanıldığında olduğu gibi karşılaştırılabilir verimlerle sonuçlanacaktır.

Bununla birlikte, orijinal oligoları ve ilk deneyden kalan kromatini kullanan ikinci bir yakalama deneyinde, hibridizasyona uygun malzemenin çoğu ilk deneyde yakalanmışsa, verim yaklaşık% 90 azalacaktır. Bu şekil, farklı kromozomal hedef bölgelerin hibridizasyon yakalamasını gösterir ve her bölge diğeri için negatif bir kontrol görevi görür. Şifreli bir dizi aynı zamanda gerçek bir negatif kontrol görevi görür.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa iki gün içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, istenen bölgenin hibridizasyon yakalamaya uygun olduğundan emin olmak için önce yakalama oligonükleotidlerini test etmeyi unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, kromatin immünopresipitasyonu gibi diğer yöntemler, tanımlanan DNA etkileşen proteinlerin genomun başka neresine bağlandığı gibi ek soruları yanıtlamak için gerçekleştirilebilir.

Bu videoyu izledikten sonra, yerel protein etkileşimlerinin de novo tanımlanması amacıyla genomik ilgi alanlarını zenginleştirmek için HyCCAPP'ın nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız.