Name: DNA ile bir siyanür boya olabilir olmak sindirilmiş enzimleri ile lekeli belirleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-02T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 58 s
Description: Öğrenin, floresan boyalı DNA moleküllerini metilasyon duyarlı restriksiyon enzimleriyle sindirme yöntemini. Bu teknik, DNA bütünlüğünü değerlendirmek ve genomik araştırmalarda sindirim oranını belirlemek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu araştırma için genel tıbbi bilim (NIGMS) (5605100122001), bir bileşeni Nebraska Üniversitesi Kearney (UNK) yaz öğrenci araştırma programı (SSRP) ve UNK yanı sıra ulusal kurumları Sağlık (NIH) Ulusal Enstitüsü tarafından finanse edildi Lisans araştırma bursu (URF).

1. hazırlanması boyalar, tamponlar ve özel jel
<ol><li>
Aşağıdaki çözümleri DNA veya lekeli DNA hazım boyama için hazırlayın.
	<ol>
<li>1 x TE (Tris-HCl ve ethylenediaminetetraacetic asit; hazırlamak EDTA) arabelleği 10 mM Tris-HCl ve 1 mM EDTA mezun silindir veya volumetric flask kullanarak. (18-25 ° C) oda sıcaklığında saklayın.</li>
		<li>Her boya aliquots olun: TOTO-1, YOYO-1, POPO-1, BOBO-1, TOTO-3, YOYO-3, POPO-3, BOBO-3 (tablo 1). 1 mM boya koyu amber içine 4 µL pipet veya 1,5 mL tüp siyah ve 1 x TE 36 µL eklemek, pipet kullanarak karıştırın; Bu konsantrasyon 100 µM boya çözüm (40 µL toplam) yapar. Her boya için bu adımı tamamlayın. 4 ° C'de mağaza Not: photobleaching veya boya bozulma önlemek için ışık boya kullanılmasını önlemek.</li>
		<li>Arabellek 1 10 mM Bis-Tris-propan-HCl, 10 mM MgCl2ve 100 µg/mL sığır serum albumin (BSA) kullanarak hazırlayın. Arabellek 2-50 mM NaCl, kullanımı hazırlamak 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2ve 100 µg/mL BSA. Tampon 3 50 mM potasyum asetat, 20 mM Tris-asetat, 10 mM magnezyum asetat ve 100 µg/mL BSA kullanarak hazırlayın. Her enzim çalışması için belirli bu arabellekleri birini gerektirir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Aşağıdaki çözümleri Jel Elektroforez için hazırlayın.
	<ol>
<li>6 yükleme x boya %0.25 bromophenol birleştirerek mavi, olun % 0.25 Ksilen cyanol, % 15 Ficoll dH2O. mağaza oda sıcaklığında.</li>
		<li>Jel, dışarı yüksek jelleşme sıcaklık (HGT) özel bir Erlenmeyer flask 0,07 g tartmak % 0.7 özel yapmak için 1 x TAE arabellek 100 mL ekleyin ve ters bir kabı balonun üstüne yerleştirin.<ol>
<li>Çözüm sıcak tabakta ısı kadar şişesi ve üst için kayan nokta alt formda kabarcıklar başlayacak.</li>
			<li>Çözüm sıcak plaka kaldırmak için balonun ile çıplak bir el dokundu ve jel kuyuları oluşturmak için jel tarak ile 24.5 cm x 21,8 cm jel kalıp içine dökün kadar çözüm soğumaya bırakın.</li>
			<li>Pipet ucu ile haşhaş tarafından baloncuklar tarak ya da jel yüzeyi kaldırmak ve en az 15 dakika boyunca katılaşmaya jel izin. Bu jel veya kirlenme kurutma önlemek 1 hafta için plastik wrap sarılı bir buzdolabı (4 ° C) depolanabilir. Nasıl çalıştırılacağı hakkında daha fazla bilgi için bir jel başvurmak için Lee vd. 33 . Not: 30 bireysel wells ile jel tarak kullanın. Her şey 4.5 mm 2 mm derinliğe ile geniş olmalıdır. Kuyu yüksekliğini jel kutusu dökülür, miktarına bağlı olacaktır.</li>
		</ol>
</li>
		<li>1 x TAE (Tris - asetat - EDTA) arabelleği 40 mM Tris-HCl, 20 mM Asetik asit ve 1 mM EDTA kullanarak hazırlayın. (18-25 ° C) oda sıcaklığında saklayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. lekeli DNA hazırlanması
<ol><li>
Lambda DNA (300-800 ng) boyalar farklı aliquots kullanarak leke. Her boya (tablo 1) test, restriksiyon enzimi başına 48 reaksiyonlar olmak üzere toplam altı farklı konsantrasyonlarda olacaktır. Aşağıdaki işlem için 1 tepki (şekil 1) bir küme özetliyor.
	<ol>
<li>1 x TE 100 kullanarak lambda DNA seyreltik ng / µL. mağaza 4 ° c ' Bir çözüm 300 µL hacmi ile olun.</li>
		<li>Bazlar lambda DNA leke. "Denemeler" den beklenen her grup için 75-100 ng/bant tahmin ediyoruz. Boya konsantrasyonları 1.9 µM, 3.8 µM, 19.4 µM, 32.2 µM, 48,3 µM, 63,5 µM üretmek için uygun miktarda ekleyebilirsiniz / 100 ng DNA'ın.</li>
		<li>Gecede kuluçkaya (15 h - 18 h) 4 ° C'de</li>
		<li>Denetim25hareket günahı bir tepki bırak. Not: bazlar DNA sindirim tepki için kullanın. Metilasyon duyarlı enzimler DNA metillenmiş bölgelerde kesemezsin ve eksik bir sindirim bir görünüm verecektir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. restriksiyon enzimi tahlil hazırlanması
<ol><li>
Özet Bu enzim prestained DNA (şekil 1) sindirmek olabilir belirlemek için bir restriksiyon enzimi ile DNA lekeli.
	<ol>
<li>Ertesi gün 20 U restriksiyon enzimi, 3 µL uygun arabellek (Tablo 2) ve toplam 30 µL distile, autoclaved ve süzülmüş su ekleyin. Her enzim reaksiyon için arabellek üreticinin Web sitesinde bulunabilir en yüksek kesme verimliliği ile seçin.</li>
		<li>Maschmann ve arkiçinde kullanılan 6 enzimler için Tablo 2'de listelenen en iyi enzim aktivitesinin sıcaklığında su banyosu tepkiler yer., 2-4 h (Tablo 2)25.</li>
		<li>Reaksiyon 0,5 M EDTA pH 8.0 2 µL ekleyerek durdurmak.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. bir özel jel DNA'da lekeli Electroeluting
<ol><li>Taraf (Adım 1.2.2) 24.5 cm x 21,8 cm jel kalıptan çıkarın ve jel Jel Elektroforez kutusuna yerleştirin. 1 x TAE arabelleği 2.5 L kutusu dökün. Dikkatli bir şekilde böylece kuyu erişilebilir33jel tarak jel çıkarın.</li>
	<li>Restriksiyon enzimi tepkiler üzerine bir plastik film pipette ve her reaksiyon boya yükleme x 6 ile birleştirir. Her reaksiyon çözüm için boya başına 5-6 µL DNA çözüm (1 x) yükleme x 6 1 µL ekleyin. Öyleyse karşılıklar pipette (yükleme boya içeren < 18 µL) kuyu içine.</li>
	<li>1 kb merdivenin 1 µL, 1 x TE 9 µL ve boya yükleme x 6 2 µL karıştırın. Çözüm başka çözümler kanattan kuyu yükleyin.</li>
	<li>Koyu mavi veya siyah kağıt veya kumaş ile jel kutu örtmek. Jel kutusu 30 V güç kaynağı ayarlayın ve gecede çalıştırın bir güç kaynağı için (15-20 h) bağlayın. Jel, photocleavage etiketli DNA'ın önlemek için çalışırken ışıkları kapatın.</li>
	<li>Ertesi sabah güç kaynağını kapatmak. Tepsi kullanarak jel al ve bir konteyner ile 45 µL etidyum bromür ve 1 L 1 x TAE arabelleği aktarmak. Karanlık oda sıcaklığında veya kapak konteyner folyo ışığa maruz kalma önlemek için saklayın. Leke, oda sıcaklığında en az 45 dakika için jel izin. Dikkat: etidyum bromür kullanım ile eldiven ve koruyucu gözlük giymek. Konteynerin etidyum bromür solüsyon içeren ve jel atmadan temizlerken, kullanılan etidyum bromür ile başa çıkmak konusunda bilgi almak senin Birleşik elden çıkarma yönergelere başvurun; Ayrıca, diğer lekeleri etidyum bromür yerine yararlı.</li>
</ol>5. özel jel görüntüleme
<ol><li>Jel 400-500 nm arasında en fazla ışık verimi yayar mavi bir ışık transilluminator üstüne yerleştirin. Merkeze bağlı kamera ile fotoğraf çekmek. Dikkat: kapak ışığı için kullanın ve ışık kaynağında dönüm önce koruyucu gözlük koymak emin olun. Not: Bu adımı da herhangi bir UV ışık kaynağı veya standart jel tarayıcı kullanılarak tamamlanabilir.</li>
	<li>Dosyayı ImageJ durum çubuğuna sürükleyerek ImageJ içinde resimleri görüntüleme ve görüntü çıkacaktır.</li>
	<li>Sindirim oranı deneme için beklenen silico jel desen jöleye bands karşılaştırarak belirle. Sindirim oranı belirlemek için deneysel grup dizi DNA bantları24,25beklenen numarasına göre bölünür. Deneysel sindirilir DNA bant deseni beklenen desen varsa, sindirim oranı 1'dir. Desen beklenenden daha fazla parçaları varsa, sindirim 1'den büyük oranıdır. Desen beklenenden daha az parçaları varsa, sindirim birden oranıdır.</li>
</ol>

<ol><li>Teague, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+human+genome+structure+by+single-molecule+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">High-resolution human genome structure by single-molecule analysis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (24), 10848-10853 (2010).</li>
<li>Ananiev, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+mapping+discerns+genome+wide+DNA+methylation+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Optical mapping discerns genome wide DNA methylation profiles.</a> BMC Mol Biol. 9, 68(2008).</li>
<li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+rice+genome+sequence+by+optical+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Validation of rice genome sequence by optical mapping.</a> BMC Genomics. 8, 278(2007).</li>
<li>Reslewic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-genome+shotgun+optical+mapping+of+Rhodospirillum+rubrum%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Whole-genome shotgun optical mapping of Rhodospirillum rubrum.</a> Appl Environ Microbiol. 71 (9), 5511-5522 (2005).</li>
<li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-genome+shotgun+optical+mapping+of+Rhodobacter+sphaeroides+strain+2.4.1+and+its+use+for+whole-genome+shotgun+sequence+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Whole-genome shotgun optical mapping of Rhodobacter sphaeroides strain 2.4.1 and its use for whole-genome shotgun sequence assembly.</a> Genome Res. 13 (9), 2142-2151 (2003).</li>
<li>Gupta, A., Kounovsky-Shafer, K. L., Ravindran, P., Schwartz, D. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s10404-015-1685-y">Optical mapping and nanocoding approaches to whole-genome analysis.</a> Microfluidics and Nanofluidics. 20 (44), 1-14 (2016).</li>
<li>Kounovsky-Shafer, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presentation+of+large+DNA+molecules+for+analysis+as+nanoconfined+dumbbells%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Presentation of large DNA molecules for analysis as nanoconfined dumbbells.</a> Macromolecules. 46 (20), 8356-8368 (2013).</li>
<li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanochannel+confinement%3A+DNA+stretch+approaching+full+contour+length%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Nanochannel confinement: DNA stretch approaching full contour length.</a> Lab Chip. 11 (10), 1721-1729 (2011).</li>
<li>Yu, H., Jo, K., Kounovsky, K. L., de Pablo, J. J., Schwartz, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+propulsion%3A+chemical+sensing+and+chemotaxis+of+DNA+driven+by+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Molecular propulsion: chemical sensing and chemotaxis of DNA driven by RNA polymerase.</a> J Am Chem Soc. 131 (16), 5722-5723 (2009).</li>
<li>Lam, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+mapping+on+nanochannel+arrays+for+structural+variation+analysis+and+sequence+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Genome mapping on nanochannel arrays for structural variation analysis and sequence assembly.</a> Nat Biotechnol. 30 (8), 771-776 (2012).</li>
<li>Cao, H., Tegenfeldt, J. O., Austin, R. H., Chou, S. Y. <a target="_blank" href="https://austingroup.princeton.edu/publications/gradient-nanostructures-interfacing-microfluidics-and-nanofluidics">Gradient nanostructures for interfacing microfluidics and nanofluidics.</a> Applied Physics Letters. 81 (16), 3058-3060 (2002).</li>
<li>Gupta, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+analysis+reveals+widespread+structural+variation+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Single-molecule analysis reveals widespread structural variation in multiple myeloma.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (25), 7689-7694 (2015).</li>
<li>Wu, C. W., Schramm, T. M., Zhou, S., Schwartz, D. C., Talaat, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+mapping+of+the+Mycobacterium+avium+subspecies+paratuberculosis+genome%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Optical mapping of the Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis genome.</a> BMC Genomics. 10, 25(2009).</li>
<li>Jo, K., Schramm, T. M., Schwartz, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-molecule+barcoding+system+using+nanoslits+for+DNA+analysis+%3A+nanocoding%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A single-molecule barcoding system using nanoslits for DNA analysis : nanocoding.</a> Methods Mol Biol. 544, 29-42 (2009).</li>
<li>Jo, K., Chen, Y. L., de Pablo, J. J., Schwartz, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elongation+and+migration+of+single+DNA+molecules+in+microchannels+using+oscillatory+shear+flows%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Elongation and migration of single DNA molecules in microchannels using oscillatory shear flows.</a> Lab Chip. 9 (16), 2348-2355 (2009).</li>
<li>Jo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-molecule+barcoding+system+using+nanoslits+for+DNA+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A single-molecule barcoding system using nanoslits for DNA analysis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (8), 2673-2678 (2007).</li>
<li>Reccius, C. H., Mannion, J. T., Cross, J. D., Craighead, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compression+and+free+expansion+of+single+DNA+molecules+in+nanochannels%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+Lett%22%5BJournal%5D)">Compression and free expansion of single DNA molecules in nanochannels.</a> Phys Rev Lett. 95 (26), 268101(2005).</li>
<li>Staerk, D., Hamed, A. A., Pedersen, E. B., Jacobsen, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bisintercalation+of+homodimeric+thiazole+orange+dyes+in+DNA%3A+effect+of+modifying+the+linker%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug+Chem%22%5BJournal%5D)">Bisintercalation of homodimeric thiazole orange dyes in DNA: effect of modifying the linker.</a> Bioconjug Chem. 8 (6), 869-877 (1997).</li>
<li>Spielmann, H. P., Wemmer, D. E., Jacobsen, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solution+structure+of+a+DNA+complex+with+the+fluorescent+bis-intercalator+TOTO+determined+by+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Solution structure of a DNA complex with the fluorescent bis-intercalator TOTO determined by NMR spectroscopy.</a> Biochemistry. 34, 8542-8553 (1995).</li>
<li>Carlsson, C., Jonsson, M., Akerman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+bands+in+DNA+gel+electrophoresis+caused+by+bis-intercalating+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Double bands in DNA gel electrophoresis caused by bis-intercalating dyes.</a> Nucleic Acids Res. 23 (13), 2413-2420 (1995).</li>
<li>Kundukad, B., Yan, J., Doyle, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+YOYO-1+on+the+mechanical+properties+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Effect of YOYO-1 on the mechanical properties of DNA.</a> Soft Matter. 10 (48), 9721-9728 (2014).</li>
<li>Technologies, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTechnologies%2C+L+%22The+Molecular+Probes+Handbook%3A+A+guide+to+Fluorescent+Probes+and+Labeling+Technologies%22">The Molecular Probes Handbook: A guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies</a>. , 11th, (2010).</li>
<li>Riehn, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restriction+mapping+in+nanofluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Restriction mapping in nanofluidic devices.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (29), 10012-10016 (2005).</li>
<li>Meng, X., Cai, W., Schwartz, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+restriction+endonuclease+activity+by+DNA+binding+fluorochromes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Struct+Dyn%22%5BJournal%5D)">Inhibition of restriction endonuclease activity by DNA binding fluorochromes.</a> J Biomol Struct Dyn. 13 (6), 945-951 (1996).</li>
<li>Maschmann, A., Kounovsky-Shafer, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+restriction+enzyme+activity+when+cutting+DNA+labeled+with+the+TOTO+Dye+family%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleosides+Nucleotides+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Determination of restriction enzyme activity when cutting DNA labeled with the TOTO Dye family.</a> Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. , 1-12 (2017).</li>
<li>Biebricker, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+DNA+intercalators+on+DNA+and+DNA-processing+enzymes+elucidated+through+force-dependent+binding+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The impact of DNA intercalators on DNA and DNA-processing enzymes elucidated through force-dependent binding kinetics.</a> Nature Communications. 6, 7304(2015).</li>
<li>Gunther, K., Mertig, M., Seidel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+and+structural+properties+of+YOYO-1+complexed+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Mechanical and structural properties of YOYO-1 complexed DNA.</a> Nucleic Acids Res. 38 (19), 6526-6532 (2010).</li>
<li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clone-free%2C+single+molecule+map+of+the+domestic+cow+%28Bos+taurus%29+genome%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">A clone-free, single molecule map of the domestic cow (Bos taurus) genome.</a> BMC Genomics. 16, 644(2015).</li>
<li>Ray, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+structural+alterations+in+solid+tumor+oligodendroglioma+by+single+molecule+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Discovery of structural alterations in solid tumor oligodendroglioma by single molecule analysis.</a> BMC Genomics. 14, 505(2013).</li>
<li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+sequence+of+the+model+medicinal+mushroom+Ganoderma+lucidum%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Genome sequence of the model medicinal mushroom Ganoderma lucidum.</a> Nat Commun. 3, 913(2012).</li>
<li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+molecule+scaffold+for+the+maize+genome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">A single molecule scaffold for the maize genome.</a> PLoS Genet. 5 (11), e1000711(2009).</li>
<li>Sischka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+and+kinetics+between+DNA+and+DNA+binding+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms and kinetics between DNA and DNA binding ligands.</a> Biophys J. 88 (1), 404-411 (2005).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J Vis Exp. (62), (2012).</li>
<li>Zipper, H., Brunner, H., Bernhagen, J., Vitzthum, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigations+on+DNA+intercalation+and+surface+binding+by+SYBR+Green+I%2C+its+structure+determination+and+methodological+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Investigations on DNA intercalation and surface binding by SYBR Green I, its structure determination and methodological implications.</a> Nucleic Acids Res. 32 (12), e103(2004).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Fluorescently etiketli DNA (şekil 1)sindirmek amacıyla bir dizi adım gereklidir. İlk olarak, DNA ile bir fluorochrome gecede lekeli. DNA daha kısa bir süre için siyanür dimer ile inkübe; Ancak, Carlsson vd. DNA çift kişilik gruplar her DNA boyutu nedeniyle eksik boyama20için oluşturulan bulundu. Bu sorunu gidermek için DNA çift kişilik grup oluşmasını önlemek için gece Boyanabilen. Bu protokol kritik bir adımdır. Boya için yeterince uzun bir ...

TOTO serisi (TOTO-1, YOYO-1, POPO-1, BOBO-1, TOTO-3, YOYO-3, POPO-3 ve BOBO-3; Tablo 1) çeşitli deneyler DNA görselleştirme gerekli1,2,3,4,5,6,7, nerede olarak kullanılmaktadır 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17. siyanür dimer aile onların kuantum verimi, ışık hassasiyeti ve DNA molekülleri18,19,20için yüksek ilgi nedeniyle yaygın olarak kullanılır. Siyanür dimer boyalar Floresans21100-1000 kat artış var büyük seçicilik çift iplikçikli DNA için ve ne zaman ara var. Pyridinium boya maddeler, araçlar (YOYO-1, TOTO-1, YOYO-3 ve TOTO-3) onların quinolium boya daha karşılıkları (Tablo 1)22(BOBO-1, POPO-1, BOBO-3 ve POPO-3) bir daha kısa emisyon dalga boyu var. Aynı zamanda, DNA'ya ara siyanür dimer kuantum verimi yüksektir (0.2 - 0,6)22. Ancak, bir enzim bir DNA molekülü2 metilasyonu profili belirleme veya23 zaten ile floresan boya lekeli bir DNA molekülünün germek için kullanmak ne enzimler lekeli DNA sindirmek belirlemek için bir metod gerekir. DNA'ya intercalates boya herhangi bir tür veya DNA substrat discernable örnek verir herhangi bir enzim için bu yöntemi kullanabilirsiniz.
Meng vd. ilk prestained DNA yoluyla farklı boya24çeşitli kullanarak Jel Elektroforez sindirim oranı belirlenir. Maschmann ve ark. delved derin boyalar TOTO aileye bakmak için. Her ikisi de belirli bir boya ile lekeli DNA restriksiyon enzimi25ile sindirmek Eğer görmek için lekeli DNA sindirim oranı belirlenir. Diğer yöntemler optik cımbız26 veya NMR27kullanarak DNA ile ara boya etkileri bağlama çalışma. Her iki yöntem özel ekipman gerektirir; ise bu yöntem çoğu moleküler biyoloji laboratuarları bir boya olup olmadığını belirlemek zorunda ekipman sağlar, restriksiyon enzimi sindirim ile etkilemektedir.
Ayrıca, belirli bir molekül uzunluğunu ölçmek için diğer yöntemleri, optik eşleme günahı DNA molekülleri bir yüzey üzerinde uzamış ve streç ve parçaları boyutunu belirlemek için DNA sindirilir. Boya enterkalasyon kontur uzunluğu fluorescently lekeli DNA moleküllerinin ve bağlı olarak kullanılan boya artırmak için gösterilmiştir, kontur uzunlukları farklı21. Bu yöntem genleri1,3,4,6,13,28,29,30, çeşitli kullanıldığında vardır 31. molekülleri, boya ve enzim bağlı olarak önceden lekeli olsaydı, ancak, enzim DNA ile belirli bir boya lekeli kesmek mümkün olmayabilir. Bu nedenle, bu yöntem ile belirli bir boya lekeli DNA bir enzim ile sindirilmiş Eğer belirler. Ayrıca, boya ve boya DNA hareketliliğini kullanıldığında, konsantrasyon bağlı olarak bir jel bantlarında daha yavaş boya baz çifti32 arasında eklemek yer açmak için yerel DNA kısmi DNA omurgası gevşemek nedeniyle göç edecek .
Ancak, bazen bu boyalar olabilir kısmen veya tamamen belirli enzimleri7,24eylem inhibe. Bu enzim, belirli sıra tanımasını engelleyebilir floresan boyalar ve eki neden olduğu DNA yapısal bir değişiklik nedeniyle düşünülmektedir. Bu boyalar enzimleri etkilemesi anlamak metilasyonu profil veya uzatma lekeli DNA'ın gerekli olduğu deneylerde yardımcı olabilir.
Bizim yöntem, DNA faiz fluorochrome ile lekeli ve restriksiyon enzimi ile sindirilir. O zaman DNA görüntüsü, bir jel üzerinde electrophoresed ve restriksiyon enzimi sindirim oranı ölçüldü. Enzimleri dayalı bir jel üzerinde kesme desen olarak seçilmiştir. Çok fazla grup örtüşme DNA gruplarından neden ve çok az bantları DNA molekülünün tam bir resim vermek değil. Profil sindirilir DNA molekülünün belirlemek için tatlı bir nokta var; Bu nedenle, kullanılan DNA ve enzim bağlı olacaktır. Bu yöntemin bir avantajı basitliğidir; Sadece bir kısıtlama sindirim ve Jel Elektroforez cihazları gerektirir.

<table><tbody><tr><td>Metillenmemiş lambda DNA'sı</td><td>NEB</td><td>N3013S</td><td></td></tr><tr><td>YOYO-1</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Y3601</td><td></td></tr><tr><td>TOTO-1</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T3600</td><td></td></tr><tr><td>POPO-1</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P3580</td><td></td></tr><tr><td>BOBO-1</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>B3582</td><td></td></tr><tr><td>YOYO-3</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Y3606</td><td></td></tr><tr><td>TOTO-3</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T3604</td><td></td></tr><tr><td>POPO-3</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P3584</td><td></td></tr><tr><td>BamHI</td><td>NEB</td><td>R0136S</td><td></td></tr><tr><td>PmlI</td><td>NEB</td><td>R0532S</td><td></td></tr><tr><td>ScaI</td><td>NEB</td><td>R3122S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI ve nbsp;</td><td>NEB</td><td>R0101S</td><td></td></tr><tr><td>HindIII</td><td>NEB</td><td>R0104S</td><td></td></tr><tr><td>SmaI</td><td>NEB</td><td>R0141S</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher</td><td>BP152-1</td><td>Tahriş Edici</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>S316-212</td><td>Toksik</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Fisher</td><td>S25358</td><td>Aşındırıcı ve tahriş</td></tr><tr><td>edici Tampon 1</td><td>NEB</td><td>B7201S</td><td>NEB 1.1</td></tr><tr><td>Tampon 2</td><td>NEB</td><td>B7202S</td><td>NEB 2.1</td></tr><tr><td>Tampon 3</td><td>NEB</td><td>B7204S</td><td>NEB Cutsmart</td></tr><tr><td>Yüksek jelleşme sıcaklığı agaroz jel</td><td>Lonza</td><td>50041</td><td></td></tr><tr><td>Asetik Asit</td><td>Fisher</td><td>S25118</td><td>Tehlikeli</td></tr><tr><td>Mavi ışık aydınlatıcı</td><td>Dark Reader</td><td>DR196</td><td>Doğru gözlük takın&nbsp;</td></tr><tr><td>Etidyum bromür</td><td>Fisher</td><td>15585011</td><td>Kanserojen; diğer alternatifler Nancy 520, Jel kırmızısı, vb.</td></tr><tr><td>Cannon EOS Rebel T3I kamera</td><td>Cannon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Apogee Model H4</td><td>Biorad</td><td>1704510</td><td></td></tr><tr><td>Power Pac Temel Güç Kaynağı</td><td>Biorad</td><td>1645050&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP525-25</td><td></td></tr><tr><td>Bromofenol mavisi</td><td>Fisher Scientific</td><td>B-392</td><td></td></tr><tr><td>Ksilen Siyanol</td><td>Eastmen</td><td>T1579</td><td></td></tr></tbody></table>

dna ile bir siyanür boya olabilir olmak sindirilmiş enzimleri ile lekeli belirleme

Determining if DNA Stained with a Cyanine Dye Can Be Digested with Restriction Enzymes

DNA'ın görselleştirme floresan mikroskopi için boyalar siyanür boyalar gibi çeşitli kullanır. Bu boyalar onların yüksek benzeşme ve duyarlılık nedeniyle DNA için kullanılmaktadır. DNA molekülleri deney tamamlandıktan sonra tam uzunlukta olup olmadığını belirlemek için bir yöntem enzimleri ile DNA sindirerek tarafından lekeli molekülleri tam uzunlukta olup olmadığını belirlemek için gereklidir. Bir yöntem için fluorochrome ihtiyacım ne enzimler DNA lekeli belirlemek için gerekli değildir ancak, lekeli DNA enzimleri inhibe. Bu yöntemde, DNA boya ve DNA equilibrate izin veren bir siyanür boya ile bir gecede lekeli. Sonraki, lekeli DNA restriksiyon enzimi ile sindirilmiş, bir jel yüklenen ve electrophoresed. Deneysel DNA Özet bantları restriksiyon enzimi etkinliğini belirlemek için bir silico sindirimi karşılaştırılır. Beklendiği gibi grup aynı dizi Eğer reaksiyon tamamlandıktan. Kısmi sindirim belirtmek beklenenden daha fazla grup ve daha az bantları eksik sindirim gösterir. Bu yöntemin avantajı basitliğidir ve bir bilim adamı için bir restriksiyon enzimi gerekir ekipman kullanır tahlil ve Elektroforez jel. Bu yöntemin bir sınırlama enzimler için çoğu bilim adamı mevcut piyasada bulunan enzimler vardır; Ancak, herhangi bir enzimleri kullanılabilir.

İntercalating bir boya sindirerek DNA restriksiyon enzimi etkilerse, adımları doğru sırada olmalıdır belirlemek için (şekil 1) takip. Bir kez DNA lekeli ve belirli bir enzim ile sindirilmiş, jel resmini parçaları ve büyüklükleri (Şekil 2) sayısını belirlemek için alınabilir. Enzim verimlilik, beklenen görünür bant görünür grup numarasına göre bölünmüş toplam sayısı belirlemek için. Enzim verimliliği egale etti birlik, eğer bant s...

DNA molekülleri floresan mikroskopi için boyama bir deney sırasında görüntüleyebilmesi için bir bilim adamı sağlar. Burada sunulan yönteminde DNA molekülleri ile floresan boyalar önceden lekeli ve metilasyonu ve sigara metilasyonu hassas enzimleri ile sindirilir.

DNA ile bir siyanür boya olabilir olmak sindirilmiş enzimleri ile lekeli belirleme

Visualization of DNA for fluorescence microscopy utilizes a variety of dyes such as cyanine dyes. These dyes are utilized due to their high affinity and ...

Bu deneyin genel amacı, floresan olarak işaretlenmiş DNA moleküllerini metilasyon ve metilasyona duyarlı olmayan kısıtlama enzimleri ile sindirmek ve deneyin sindirim hızını belirlemektir. Bu yöntem, genomik gibi kimya veya biyoloji alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntemin avantajı, bir bilim adamının, farklı bir deneyin tamamlanmasından sonra DNA'nın tam uzunlukta olup olmadığını belirlemek için önceden boyanmış DNA'yı bir enzimle sindirebilmesidir.Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir lisans öğrencisi olan Drew Thompson olacak. % 0.7'lik bir agaroz jeli yapmak için, bir Erlenmeyer şişesinde 1.4 gram yüksek jelleşme sıcaklığındaki agarozu tartın. Ardından 200 mililitre 1x TAE tamponu ekleyin ve şişenin üzerine ters çevrilmiş bir beher yerleştirin.Şişenin dibinde kabarcıklar oluşmaya başlayana ve üste doğru yüzene kadar çözeltiyi sıcak bir plaka üzerinde ısıtın. Solüsyonu sıcak plakadan çıkarın ve şişeye çıplak elle dokunulana kadar soğumaya bırakın. Daha sonra jeli, kuyucuklar oluşturmak için bir jel tarağı ile 24,5 santimetre x 21,8 santimetrelik bir jel kalıba dökün.Baloncukları tarağın yanında veya jelin yüzeyinde patlatmak için bir pipet

determining-if-dna-stained-with-cyanine-dye-can-be-digested-with

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Bu yayın Agilent Balık Türleri Tanımlama Sistemi, DNA ayıklanması ve, PCR ve RFLP analizi yapan bir balık türü tanımlamak için nasıl kullanılacağı açıklanmıştır.

DNA tabanlı Balık Türleri Tanımlama Protokolü

Fotostabil siyanin boyaları, enerji transferi ile hibridizasyonun izlenmesi için oligonükleotidlere bağlanır.

Işığa siyanin boyası kullanarak Dalgaboyu değiştiren DNA Hibridizasyon Sondalar Sentezi

Genlerin ve onların düzenleyici elemanlarının arasındaki fiziksel etkileşimleri tanımlaması zordur ama kromozom conformation yakalama yöntemleri tarafından kolaylaştırdı. Bu değişiklik 4C-seq protokolü için PCR önyargı yanında en aza indirgemek PCR şablonları aşırı amplifikasyon azaltır ve bir ek Restriksiyon enzimi Özet adım dahil ederek okur mappability en üst düzeye çıkarır.

Gen düzenleyici dizileri dairesel kromozom Conformation yeni nesil sıralama kullanarak yüksek üretilen iş tanımlaması yakalama (4C-seq)

Burada, DNA tespiti Jel Elektroforez deneylerde tiyazol turuncu kullanılacak iletişim kuralı mevcut. Etidyum bromür ortadan kaldırılması tiyazol turuncu kullanılmasına ve floresan algılama UV ya da mavi ışık ile elde edilebilir.

DNA Elektroforez tiyazol turuncu etidyum bromür veya alternatif boya yerine kullanma

Genom, nükleer uzayda kromozom konformasyon yakalama teknolojileri ile ortaya sunulabilen farklı yapılara düzenlenmiştir. Çekirdek içi Hi-C yöntemi, Drosophila hücre hatlarında, kısıtlama parçası düzeyinde megabase çözünürlükte keşfedilebilen temas haritaları üreten, genom çapında bir kromatin etkileşimi koleksiyonu sağlar.

Drosophila Hücrelerinde Çekirdek içi Hi-C

Kuantum nokta etiketli DNA ve toplam iç yansıma floresan mikroskobu kullanarak, etiketlenmemiş protein kullanırken kısıtlama endonükleazlarının reaksiyon mekanizmasını araştırabiliriz. Bu tek moleküllü teknik, bireysel protein-DNA etkileşimlerinin büyük ölçüde çoğullanmış gözlemine izin verir ve veriler, iyi doldurulmuş bekleme süresi dağılımları oluşturmak için bir araya getirilebilir.

Restriksiyon endonükleaz aracılı DNA bölünmesinin tek moleküllü bekleme süresi analizi

Burada, kromozom konformasyon yakalama (3C) tekniğinin lisans katılımı ve öğrenimine vurgu yaparak ayrıntılı olarak bir adaptasyonunu sunuyoruz.

3C'lerle A Almak: Lisans Öğrencileri için Kromozom Konformasyon Yakalama

Bu protokol, CMG sarmal ile çözülen DNA'nın canlı görselleştirilmesi için tek moleküllü bir testin gerçekleştirilmesini gösterir. (1) bir DNA substratının hazırlanmasını, (2) floresan etiketli Drosophila melanogaster CMG helikazının saflaştırılmasını, (3) toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskobu için bir mikroakışkan akış hücresinin hazırlanmasını ve (4) tek moleküllü DNA çözme tahlilini açıklar.

CMG Helikaz ile DNA Çözmenin Tek Moleküllü Gerçek Zamanlı Görselleştirilmesi

Bir sheathless gözenekli ucu arayüz tasarımı kullanılarak kapiler elektroforez-kütle spektrometrisi ile biyolojik numunelerin metabolik profil için bir protokol verilmektedir.

Biyolojik Numune metabolik profil için Sheathless Kapiler Elektroforez-Kütle Spektrometre

Amiloid birikimi farklı hastalıklar özelliğidir ve birçok farklı organları afflicts. Bu kağıt Işıksaçan konjuge oligothiophene floresan Floresans mikroskobu teknikleri ile birlikte boyama uygulaması açıklanır. Bu boyama yöntemi algılama ve klinik ve bilimsel kurulumları protein toplamları keşfi için güçlü bir araç temsil eder.

Amiloid doku Imaging ile Işıksaçan konjuge Oligothiophenes Hyperspectral tarafından Confocal mikroskobu ve floresan ömür boyu görüntüleme lekeli

Öğrenin, floresan boyalı DNA moleküllerini metilasyon duyarlı restriksiyon enzimleriyle sindirme yöntemini. Bu teknik, DNA bütünlüğünü değerlendirmek ve genomik araştırmalarda sindirim oranını belirlemek için kullanılır.

DNA ile bir siyanür boya olabilir olmak sindirilmiş enzimleri ile lekeli belirleme

Daha fazla video keşfet