DNA ile bir siyanür boya olabilir olmak sindirilmiş enzimleri ile lekeli belirleme

Bu deneyin genel amacı, floresan olarak işaretlenmiş DNA moleküllerini metilasyon ve metilasyona duyarlı olmayan kısıtlama enzimleri ile sindirmek ve deneyin sindirim hızını belirlemektir. Bu yöntem, genomik gibi kimya veya biyoloji alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntemin avantajı, bir bilim adamının, farklı bir deneyin tamamlanmasından sonra DNA'nın tam uzunlukta olup olmadığını belirlemek için önceden boyanmış DNA'yı bir enzimle sindirebilmesidir.

Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir lisans öğrencisi olan Drew Thompson olacak. % 0.7'lik bir agaroz jeli yapmak için, bir Erlenmeyer şişesinde 1.4 gram yüksek jelleşme sıcaklığındaki agarozu tartın. Ardından 200 mililitre 1x TAE tamponu ekleyin ve şişenin üzerine ters çevrilmiş bir beher yerleştirin.

Şişenin dibinde kabarcıklar oluşmaya başlayana ve üste doğru yüzene kadar çözeltiyi sıcak bir plaka üzerinde ısıtın. Solüsyonu sıcak plakadan çıkarın ve şişeye çıplak elle dokunulana kadar soğumaya bırakın. Daha sonra jeli, kuyucuklar oluşturmak için bir jel tarağı ile 24,5 santimetre x 21,8 santimetrelik bir jel kalıba dökün.

Baloncukları tarağın yanında veya jelin yüzeyinde patlatmak için bir pipet ucu kullanın ve jelin en az 15 dakika katılaşmasına izin verin. Lambda DNA'sını altı farklı boya konsantrasyonunda boyamak için, mikrolitre lambda DNA'sı başına 300 mikrolitre 100 nanogram hazırlamak için 1x TE kullanarak başlayın. Çözeltiyi dört santigrat derecede saklayın.

Bir kısıtlama sindiriminde beklenen her bant için aşağıdaki boya konsantrasyonlarının her biri için bir numune hazırlarken, 75 ila 100 nanogram metillenmemiş lambda DNA'sını boyayın. Numuneleri gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, bir kısıtlama enziminin lekelenmiş DNA'yı sindirip sindiremeyeceğini belirlemek için, 20 birim kısıtlama enzimi, en yüksek kesme verimliliğine sahip uygun tampondan üç mikrolitre ve 30 mikrolitrelik bir reaksiyon için damıtılmış otoklavlanmış ve filtrelenmiş su ekleyin.

Reaksiyonları en uygun enzimatik aktivitede bir su banyosuna yerleştirin ve iki ila dört saat inkübe edin. Daha sonra iki mikrolitre 0.5 molar EDTA pH 8.0 ekleyerek reaksiyonları durdurun. Önceden hazırlanmış jel kalıbının kenarlarını çıkarın ve jeli jel elektroforez kutusuna yerleştirin.

Kutuya 2,5 litre 1x TAE tamponu dökün. Ardından, kuyucuklara erişilebilmesi için jel tarağını jelden dikkatlice çıkarın. Restriksiyon enzimi reaksiyonlarını plastik bir film üzerine pipetleyin ve her reaksiyon çözeltisi için, beş ila altı mikrolitre DNA çözeltisi başına bir mikrolitre 6x yükleme boyası ekleyin.

Daha sonra reaksiyonları kuyucuklara pipetleyin. Bir mikrolitre bir kilobaz merdiveni, dokuz mikrolitre 1x TE ve iki mikrolitre 6x yükleme boyasını karıştırın. Ardından çözeltiyi diğer çözeltileri çevreleyen kuyucuklara yükleyin.

Jel kutusunu lacivert veya siyah bir kağıt veya kumaşla örtün, ardından jel kutusunu bir güç kaynağına bağlayın. Güç kaynağını 30 volta ayarlayın ve gece boyunca çalıştırın. Etiketli DNA'nın fotoklevasyonunu önlemek için jel çalışırken ışıkları kapatın.

Ertesi sabah, tepsideki jeli 45 mikrolitre etidyum bromür ve bir litre 1x TAE tamponu içeren bir kaba aktarın. Kabı oda sıcaklığında karanlıkta saklayın veya ışığa maruz kalmasını önlemek için folyo ile örtün. Jeli oda sıcaklığında en az 45 dakika bekletin.

Jeli görüntülemek için jeli, 400 ila 500 nanometre arasında maksimum ışık çıkışı yayan mavi ışıklı bir transilluminatörün üzerine yerleştirin. İstasyona bağlı bir kamera ile fotoğraf çekin. Metin protokolüne göre deney için sindirim oranını belirleyin.

Enzim verimliliği, beklenen toplam bant sayısının görünür bant sayısına bölünmesiyle belirlenir. Ek olarak, bantların yaklaşık boyutunu belirlemek için, lekeli DNA'ya kıyasla doğal DNA moleküllerinin nerede beklendiğini bilmek için bir kontrol gereklidir. Üçüncü ve dördüncü şeritlerdeki bantların hareketliliği azalmış ve bu da bantların kuyulara daha yakın kaymasına neden olmuştur.

Bu şeritlerde, boya miktarı hareketliliği belirgin bir şekilde etkilemez, bu nedenle bantlar kontrolle eşleşir. Beşinci ve altıncı şeritler, kontrolden daha fazla bant gösterir, bu da kısmi sindirimi gösterir, bu da boyaların tanıma bölgelerinde bölünmeyi etkilediğini düşündürür. Bu deneyde, tüm boya konsantrasyonları için beklenen tüm bantlar görüldü, bu nedenle zarlar DNA'nın sindirimine müdahale etmedi.

YOYO-1 boyasının konsantrasyonu arttıkça hareketliliğin nasıl değiştiğini görmek için, her bandın yanına renkli yıldızlar yerleştirildi. Örneğin, 3,5 kilobaz bantlarının her YOYO-1 konsantrasyonunda yanlarında kırmızı yıldız işaretleri vardır. Beşinci ve altıncı şeritlerdeki beklenmedik şeritlerin yanında yıldız işareti yoktur.

Bu prosedürü denerken, jeli koyu renkli bir kağıt parçasıyla kapatmayı ve jelin çalışmasını karanlık bir odada tamamlamayı unutmamak önemlidir. Ayrıca, reaksiyonlarınız için koyu renkli tüpler kullandığınızdan emin olun. Bu videoyu izledikten sonra, floresan lekeli DNA moleküllerinin restriksiyon enzimleri ile nasıl sindirileceğini ve reaksiyonun sindirim hızının nasıl belirleneceğini iyi anlamış olmalısınız.

Etidyum bromür ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın, bu nedenle prosedürü gerçekleştirirken eldiven ve koruyucu gözlük takmak gibi önlemler alınmalıdır. Ayrıca, bir transilluminatör kullanırken uygun koruyucu gözlük taktığınızdan emin olun.