Zebra balığı bir Vivo içinde Model sistemi olarak kullanarak DNA çoğaltma zamanlaması profil oluşturma
30 Nisan 2018
Zebra balığı son kullanılan bir vivo içinde modeli sistemi olarak DNA çoğaltma zamanlaması geliştirme sırasında çalışmaya. İşte Zebra balığı embriyo profili çoğaltma zamanlaması için kullanarak iletişim kurallarını ayrıntılı. Bu iletişim kuralı kolayca çoğaltma zamanlaması mutantlar, tek hücre türleri, hastalık modelleri ve diğer türler çalışmaya adapte edilebilir.
Bu prosedürün genel amacı, gelişimin farklı aşamalarındaki zebra balığı embriyolarından tüm genom DNA replikasyon zamanlama haritaları oluşturmaktır. Bu yöntem, embriyonik gelişim sırasında meydana gelen kromatin değişikliklerinin DNA replikasyon çatallarının başlatılmasını nasıl etkileyebileceği gibi hücre döngüsü ve kromatin biyolojisi alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, embriyonik gelişimin tanımlanmış aşamalarında in vivo olarak meydana gelen replikasyon değişikliklerini haritalamasıdır.
Bu yöntem, zebra balığı gelişimi sırasında DNA replikasyonunun nasıl değiştiğine dair fikir verebilse de, tunikler, kurbağalar ve sinekler gibi diğer sistemlere veya model organizmalara da uygulanabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan insanlar mücadele edebilir çünkü zebra balığı embriyolarından tek hücreli süspansiyonlar oluşturmak biraz pratik gerektirir. Embriyoların toplanmasından önceki gece, düzinelerce üreyen yetişkini, yaklaşık olarak eşit sayıda erkek ve dişi kullanarak üreme tanklarına yerleştirin.
Deneye bağlı olarak, aşağıdaki yetiştirme stratejilerinden birini kullanın. İlk üreme stratejisi için, birkaç erkek ve dişi zebra balığını ayrı üreme tanklarına yerleştirin ve erkekleri dişilerden ayırmak için bir bölücü kullanın. Bu yaklaşım kullanılırsa, biyolojik değişkenliğin popülasyonu temsil etmesini sağlamak için birçok farklı üreme tankı kurun ve her birinden embriyoları bir araya getirin.
İkinci üreme stratejisi için, düzinelerce erkek ve dişi zebra balığını büyük bir üreme tankında birleştirin. Yeterince fazla sayıda embriyo olduğu sürece bu stratejiyi kullanın. Çeşitli kuruculardan geldiklerini ve bu nedenle genetik olarak popülasyonu temsil ettiklerini varsaymak mantıklıdır.
Zamanlanmış çiftleşmeleri gerçekleştirmek için, sabahları ışık döngüleri başlar başlamaz başlayın. Balıkların 10 dakikalık bir süre boyunca sığ suda üremesine izin verin ve embriyoların kaçması için sahte bir dip var. 10 dakika sonra, embriyoları bir süzgeçten geçirerek ve 10 santimetrelik bir plakaya durulamak için bir yıkama şişesi kullanarak toplayın.
Aynı zaman noktasında toplanan tüm embriyoları bir araya getirin, toplama zamanı ile işaretleyin ve hemen 28.5 santigrat derecede bir inkübatöre yerleştirin. Eşzamanlı olarak gelişen embriyoların toplanmasını sağlamak için, her 10 dakikada bir embriyo partilerinin toplanması çok önemlidir. Bu özellikle embriyonik gelişimin en erken aşamalarında önemlidir.
Bir günde tek bir çiftleşme çiftinden yüzlerce embriyo beklenebilir. Elde edilen embriyo sayısı 20'den az olana kadar yetişkinlerin 10 dakikalık döngülerde üremesine izin verin. Toplandıktan yaklaşık bir ila 1.5 saat sonra, embriyoları sıralamak, inkübatörden çıkarmak, diseksiyon mikroskobu altında gözlemlemek ve ölü ve döllenmemiş yumurtaları çıkarmak için sıralamak için.
Embriyoları sayın ve 10 santimetrelik plaka başına 100 embriyo yoğunluğuna yerleştirin. Taze E3 ortamı ekleyin ve embriyoları 28.5 santigrat derece inkübatöre geri koyun. Embriyolar istenen gelişim aşamasına ulaştığında, Zebra Balığının Embriyonik Gelişim Aşamalarına göre ışık mikroskobu altında aşamayı morfolojik olarak doğrulayın.
Embriyolar 48 hpf veya daha gençse, 1500'e kadar aşamalı embriyoyu 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve birkaç kez yıkamak için E3 kullanın. Her 100 embriyo için bir mililitre E3 ve 20 mikrolitre Pronase çözeltisi ekleyin ve hafifçe döndürün. 15 mililitre E3 ile tek bir tüpte 1500'e kadar embriyo dekoryona edilebilir. Tüpü yan yatırın ve maksimum yüzey-hacim oranını sağlamak için embriyoları düz bir tabaka halinde düzenleyin.
Tüm koryonlar embriyolardan düşene kadar tüpü her iki ila üç dakikada bir hafifçe çalkalayın. Toplam dekoryonasyon süresi Pronase aktivitesine bağlı olarak değişecektir. Süpernatanı çıkarın ve 10 mililitre E3 ile embriyoları üç kez nazikçe durulayın.
Embriyoları buza yerleştirdikten ve kalan E3'ü çıkardıktan sonra, numuneyi yıkamak için her 500 embriyo için bir mililitre taze hazırlanmış, buz gibi soğuk yumurta sarısı giderme tamponu kullanın. Daha sonra, bir P1000 kullanarak, yumurta sarısı torbasını bozmak için embriyoları beş ila 10 kez yukarı ve aşağı nazikçe pipetleyin. Daha sonra, bir mililitreyi 1.5 mililitrelik bir mikrofüj tüpüne aktarın ve numuneyi beş dakika boyunca dört santigrat derecede ve 500 kez yerçekiminde santrifüjleyin.
Numuneler, hücreleri parçalamadan tek hücreli bir süspansiyon oluşturmak için yeterince kuvvetli bir şekilde pipetlenmelidir. Bu adım biraz pratik gerektirecektir. Süpernatanı çıkarın ve Ringer solüsyonunu çıkarmak için peleti yıkamak için bir mililitre buz gibi soğuk 1x PBS kullanın.
Ardından numuneyi tekrar santrifüj edin. Süpernatanı dikkatlice çıkarın ve hücreleri bir mililitre 1x PBS'de yeniden süspanse edin. Ardından tüpü buzun üzerine yerleştirin.
15 mililitrelik konik bir tüpe üç mililitre buz gibi etanol ekleyin ve EtOH tüpünü düşük bir ayarda hafifçe girdaplayın. Bir P1000 kullanarak, girdaba devam ederken zebra balığı embriyo hücresi süspansiyonunu EtOH'ye yavaşça damlatın. % 75 EtOH'lik bir son fiksasyon çözeltisi için toplam bir mililitre embriyo hücresi süspansiyonu ekleyin.
Bir mililitre hücre süspansiyonu eklendikten sonra, tüpü karıştırmak için hafifçe döndürün ve en az bir saat boyunca eksi 20 santigrat derecede yan yatırın veya süspansiyonu iki ila üç hafta boyunca dondurucuda saklayın. Embriyonik DNA'yı boyamak için, EtOH ile sabitlenmiş embriyo hücrelerini negatif 20 santigrat dereceden çıkardıktan sonra, tüpü beş dakika boyunca yerçekiminin 1500 katı ve dört santigrat derecede santrifüjleyin. Tüpü buzun üzerine yerleştirin ve süpernatanı dikkatlice çıkarın.
Ardından, bir P1000 kullanarak, hücreleri bir mililitre taze hazırlanmış, soğuk PBS-BSA'da nazikçe yeniden süspanse edin. Hücreleri beş dakika boyunca yerçekiminin 1500 katı ve dört santigrat derecede santrifüjleyin ve numuneyi buzun üzerine yerleştirin. Daha sonra, süpernatanı çıkarın ve her 1.000 embriyo için 200 mikrolitre propidyum iyodür boyama çözeltisi ekleyin ve hücreleri yeniden süspanse edin.
Hücrelerin PI çözeltisinde buz üzerinde 30 dakika inkübe etmesine izin verin ve her beş dakikada bir hafifçe karıştırın. Buz üzerinde 50 mililitrelik konik bir tüpe 40 mikrometrelik bir naylon hücre süzgeci yerleştirin. Ardından, hücre çözeltisini ağ boyunca karıştırmak ve süzmek için hücreleri nazikçe pipetleyin.
Bir şırınga pistonunun düz, iç ucunu kullanarak, ağ üzerinde kalan hücre kümelerini nazikçe parçalayın. Her 1.000 embriyo için, hücreleri filtreden durulamak için 500 mikrolitre soğuk PBS-BSA kullanın. Buz üzerine 15 mililitrelik konik bir tüpün üzerine 40 mikrometrelik bir ağ yerleştirin ve hücre süspansiyonunu 50 mililitrelik konik tüpten ikinci kez 15 mililitrelik tüpe süzün.
Son olarak, uygun bir hücre sıralama cihazı kullanarak, propidyum iyodürü tespit etmek için lazer uyarımını 561 nanometreye ve emisyon algılamasını 20 üzerinden 610'a ayarlayın. Hücreleri sıralayın ve metin protokolüne göre ek analizler yapın. Okuma eşleme kalitesini belirlemek için, dizileme verilerinin önce mapQ değerlerinin istatistikleri kullanılarak genomla hizalanması gerekir.
Ek olarak, hesaplanan okuma uzunluğu istatistikleri, tüm sıralama okumaları için kesici uç boyutlarının dağılımının bir histogramı olarak çizilir. Bu özel deney, medyan 170 bp ile sonuçlandı. Bu çubuk grafik, eşlenen toplam okumalar için okuma istatistiklerini, düşük kaliteli bir bayrak içeren okumaları, farklı bir kromozoma eşlenen çiftlerle okumaları, mesafe eşiğinin ötesinde bir çiftle okumaları ve PCR kopyalarını gösterir.
Bir zebra balığı örneğinin tipik bir sıralama çalışması için toplam eşlenmiş, eşlenmemiş ve eşleştirilmemiş okuma, kapsam ve okuma çözünürlüğünün temsili sayıları burada listelenmiştir. Filtrelemeden sonra, değişken boyutlu pencerelerde okuma sayıları belirlenir ve veriler düzgünleştirilir ve normalleştirilir. Biyolojik replikalar için temsili bir zebra balığı kromozomunun tipik düzleştirilmiş ve normalleştirilmiş replikasyon zamanlama profilleri burada gösterilmektedir.
Biyolojik ve deneysel kopyalar için profiller çok benzer olmalı ve ayrıca kromozomun uzunluğu boyunca yüksek korelasyon göstermelidir. Profiller ayrıca genom genelinde zamanlama değerleri arasında yüksek korelasyon göstermelidir. Renk haritası, Pearson'ın korelasyon katsayısını temsil eder.
Bu prosedürü denerken, eşzamanlı olarak gelişen embriyoların toplandığından emin olmayı unutmamak çok önemlidir. Bu prosedürü takiben, DNA replikasyonunun diğer gelişimsel süreçlerle koordine edildiği mekanizmalar nelerdir gibi ek soruları yanıtlamak için morfolino enjeksiyonları veya CRISPR-Cas9 mutajenezi gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, eşzamanlı olarak gelişen zebra balığı embriyolarından hücre döngüsünün belirli aşamalarında hücrelerin nasıl toplanacağını iyi anlamış olmalısınız.
Bu örneklerin toplanması, tüm genom DNA replikasyon zamanlama haritalarının oluşturulması için kritik öneme sahiptir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, çeşitli gelişim evrelerindeki zebra balığı embriyolarından tüm genom DNA replikasyon zamanlama haritalarını oluşturmak için bir protokolü ayrıntılı olarak açıklamaktadır. Bu yöntem, embriyonik gelişim sırasındaki kromatin değişiklikleri ve bunların DNA replikasyon başlangıcı üzerindeki etkileri hakkında bilgiler sağlamaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Hücre döngüsü
- Kromatin biyolojisi
- Gelişimsel biyoloji
Arka Plan
- Zebra balıkları, DNA replikasyon zamanlamasını incelemek için in vivo bir model olarak kullanılmaktadır.
- Bu teknik, belirli embriyonik aşamalarda replikasyon değişikliklerini haritalar.
- Elde edilen bilgiler diğer model organizmalara uygulanabilir.
- Embriyolardan tek hücreli süspansiyonlar elde etmede zorluklar vardır.
Çalışmanın Amacı
- Zebra balığı gelişimi sırasında DNA replikasyon zamanlamasını belirlemek.
- Kromatin değişikliklerinin DNA replikasyon başlangıcını nasıl etkilediğini anlamak.
- Çeşitli mutantlar ve hastalık modellerini incelemek için uyarlanan bir protokol sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Farklı gelişim evrelerinde zebra balığı embriyolarının toplanması.
- Tüm genom DNA replikasyon zamanlama haritalarının oluşturulması.
- Yöntemin tunicatlar ve kurbağalar gibi diğer türlere uygulanması.
- Tek hücreli süspansiyonlar oluşturma konusunda pratik yapılması gerekmektedir.
Ana Sonuçlar
- Zebra balığı embriyolarında DNA replikasyon zamanlamasının başarılı bir şekilde haritalanması.
- Embriyonik gelişim sırasında kromatin değişikliklerinin gösterilmesi.
- Diğer model organizmalara uygulanabilir bilgiler.
- Araştırmacıların kullanımını kolaylaştırmak için protokolün iyileştirilmesi.
Sonuçlar
- Bu yöntem, DNA replikasyon dinamiklerini incelemek için değerli bir araç sunmaktadır.
- Bulgular, gelişim sırasında kromatin biyolojisi anlayışını artırmaktadır.
- Çeşitli biyolojik araştırma alanlarında daha geniş uygulamalar için potansiyel bulunmaktadır.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Understanding DNA replication timing dynamics provides mechanistic insights into chromatin regulation and genomic stability, which are critical for target validation in oncology and developmental disorder research. The zebrafish in vivo model enables high-resolution, stage-specific replication timing profiling, supporting predictive confidence in early discovery by linking chromatin architecture to replication initiation. This approach facilitates biological de-risking of therapeutic hypotheses by revealing how developmental perturbations affect genome-wide replication patterns.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by mapping replication timing changes during embryonic development, clarifying chromatin-replication relationships.
- Operational Value: Provides a reproducible in vivo system for functional target validation, reducing mechanistic ambiguity in early-stage programs.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying replication timing alterations associated with disease models or mutant lines, informing go/no-go decisions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, genome-wide replication timing profiles that serve as standardized biomarkers for chromatin state and replication fidelity.
- Operational Value: Delivers normalized, smoothed data outputs suitable for high-throughput screening and cross-condition comparison in assay development.
- Scalability: Enables preparation of single-cell suspensions from staged embryos, supporting scalable sample preparation for downstream sequencing applications.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates evaluation of replication timing changes in disease models or perturbed systems, aligning with translational biomarker discovery in cancer and developmental disorders.
- Operational Value: Ensures continuity from discovery through preclinical validation by providing stage-resolved, in vivo replication timing data applicable to genetic or environmental perturbations.
- Risk Mitigation: Supports risk-adjusted advancement decisions by revealing how replication timing perturbations impact development and disease phenotypes.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target hypothesis testing through preclinical validation, offering a reproducible in vivo readout of replication dynamics that informs mechanistic de-risking and assay readiness.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by linking chromatin changes during development to DNA replication initiation events.
- Screening: Enables assay readiness through standardized, quantitative replication timing profiles derived from sorted embryonic cells at defined developmental stages.
- Analytics: Provides normalized read counts, smoothed replication timing profiles, and genome-wide correlation metrics that allow quantitative comparison of conditions and replicates.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by enabling assessment of replication timing alterations in disease-relevant systems, such as mutant lines or disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for profiling replication timing across genetic backgrounds, developmental stages, and environmental perturbations, supporting platform-based discovery.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence in target validation by reducing uncertainty in chromatin-replication mechanistic links.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible workflows for single-cell preparation and replication timing mapping, improving inter-lab consistency.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early detection of replication timing-associated risks, reducing late-stage attrition in discovery programs.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization by identifying compounds or genetic perturbations that alter replication timing profiles in vivo.
Implementation Considerations
- Expertise in zebrafish embryology and developmental staging is required for synchronized embryo collection and morphological verification.
- Instrumentation includes cell sorters capable of propidium iodide detection and next-generation sequencing infrastructure for genome-wide copy number analysis.
- Standardization across teams depends on consistent embryo collection intervals, dechorionation protocols, and single-cell suspension generation techniques.
- Adaptation to mutant lines or disease models requires validation of developmental timing and cellular yield under perturbed conditions.
- Practical limitations include the technical challenge of generating high-quality single-cell suspensions from embryos, which requires practice to avoid lysing cells during dissociation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:01
Setting Up Adult Zebrafish for Breeding
2:01
Timed Matings - Collecting, Sorting, and Housing Zebrafish Embryos for Experiments
3:23
Dechorionate, Deyolk, and Fix Zebrafish Embryos
6:09
Staining DNA and FACS Sorting Embryos
8:00
Results: Genome-wide DNA Replication Timing at High-resolution in Zebrafish
9:28
Conclusion
