Roller erken piliç embriyonik morfogenez fiziksel güçlerinin sondalama

Bu deneysel protokolün genel amacı, ex ovo deneyler yoluyla erken embriyonik beyin gelişiminde mekanik kuvvetlerin rolünü incelemektir. Bu yöntem, biyolojik formun üretilmesi olan morfogenezde mekanik ipuçlarının rolleri gibi gelişim biyolojisi ve biyomekaniğindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, doku ve organizma düzeyinde morfogenezde mekanik kuvvetlerin rolünün karakterizasyonunu sağlamasıdır.

Bu prosedüre başlamak için, döllenmiş spesifik patojen içermeyen White Leghorn tavuk yumurtalarını temizlemek için %70 etanol içeren hassas mendiller kullanın. Ardından, yumurtaları bir tutucu üzerinde uzunlamasına bir yönde düzenleyin. Bundan sonra, yumurta kuluçka makinesini 37,5 santigrat derece hedef sıcaklığa ayarlayın ve nemi% 48 ila 55 arasında tutun.

Yumurtaları yaklaşık 40 ila 44 saat HH11 ila 13'e kadar kuluçkaya yatırın. Daha sonra,% 70 etanol ile temizlemeden önce yumurtaları oda sıcaklığında yaklaşık 15 ila 30 dakika soğumaya bırakın. Bu adımda, yumurtaları alttan kırın, kabuğu nazikçe ayırın ve içindekileri dikkatlice 150 x 15 milimetrelik bir Petri kabına koyun.

Embriyo tarafının yukarıda olduğundan emin olmak için, yumurtaları çatlatırken kuluçkaya yatırıldıkları yönde tutun. Tek kullanımlık bir Pasteur pipeti kullanarak ince albümini çıkarın. Künt uçlu forseps kullanarak kalın albümini yumurta sarısından ayırın.

Sarısı sarısının üst kısmını hafifçe kazıyarak kalın albüminin çıkarıldığından emin olun. Daha sonra, ince uçlu forsepsler kullanarak, embriyonun üzerine bir filtre kağıdı halkası yerleştirin ve halkanın uzun eksenini embriyonun uzun ekseni ile eşleştirerek ortalayın. Ardından, filtre kağıdı halkasını çevreleyen sarıyı makasla kesin.

Bunu takiben, halkayı ve embriyoyu yumurta sarısından yumurta sarısının ilk kesildiği yere doğru eğik bir yönde çekin. Daha sonra, embriyoyu oda sıcaklığında PBS ile iki ardışık 100 milimetrelik tabakta durulayın. Ardından, 35 milimetrelik bir Petri kabına bir filtre kağıdı halkası yerleştirin.

Embriyo sırt tarafını yukarı bakacak şekilde 35 milimetrelik Petri kabındaki diğer filtre kağıdına yerleştirin. Bundan sonra, filtre kağıdı sandviçinin üzerine paslanmaz çelik bir halka yerleştirin. Embriyoya zarar vermemeye özen gösterin.

Şimdi, her bir Petri kabına önceden hazırlanmış CCM'den üç mililitre ekleyin. Çekilen kılcal iğneyi embriyonun üst kısmı boyunca hafifçe kaydırarak her embriyonun vitellin zarını çıkarın. Ardından, vitellin zarını ön uçtan başlayarak notokord'a doğru soyun.

Bunu takiben, nemi korumak için suya doymuş mendillerle kaplı 150 milimetrelik bir tabağa sekiz adet 35 milimetrelik Petri kabı yerleştirin. Ardından, 150 milimetrelik Petri kabını sızdırmaz bir plastik torbaya koyun ve torbayı %95 oksijen ve %5 CO2'den oluşan bir gaz karışımı ile doldurun. Torbayı kapatın ve 37,5 santigrat derece inkübatöre yerleştirin.

Şimdi, embriyoyu inkübatörden çıkarın ve onları görüntülemek ve nöral tüpün burulma açısını belirlemek için bir OCT sistemi kullanın. Embriyoları bir ışık mikroskobuna aktarın ve 10X büyütmede görselleştirin. Petri kabından 0,2 mililitre ortamı aşamalı olarak çıkarmak için 200 mikrolitrelik bir pipet kullanın.

Ortam-hava arayüzünün embriyo üzerindeki etkisini gözlemlemek için her ortam çıkarma turunun ardından parlak alan görüntüleri çekin. Embriyo boyunca yüzey gerilimi torsiyonu indükleyene kadar ortamı çıkarmaya devam edin. Kontrol embriyolarıyla karşılaştırmak için son bir burulma açısı oluşturmak için OCT sistemini kullanarak embriyoyu bir kez daha görüntüleyin.

Kalp döngüsünün yönünü değiştirmek için, filtre kağıdını çevirmek için bir çift forseps kullanın, böylece embriyo ventral tarafı yukarı bakar. Daha sonra, splanknopleure membranda bir yarık açmak ve kalbi sağ taraftan sol tarafa itmek için mekanik bir kuvvet uygulamak için çekilen kılcal boruyu kullanın. Kalbi sol tarafta tutmak için sıvı yüzey gerilimini uygulayın.

Ardından, burulmanın kiralitesindeki değişikliği görmek için embriyoyu 20 saat daha inkübe edin. Burada gösterilen, HH11'de VM çıkarılmış hasat edilmiş bir embriyodur. Aynı embriyo, VM'nin çıkarılmasından sonra 27 saat boyunca inkübe edildi ve burulma azaldı ve görüldü.

Burada, sıvı yüzey gerilimi uygulandığında beyin torsiyonu uygulanan aynı embriyo ve burada karşılaştırılabilir bir aşamada normal beyin torsiyonu olan kontrol embriyosu görülmektedir. Bu prosedürü denerken, embriyoya zarar vermemeye dikkat etmek önemlidir. Bu prosedürü takiben, fiziksel kuvvetlerin morfolojiyi nasıl etkileyebileceğini hesaplamalı olarak modellemek için sonlu elemanlar analizi gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir.

Bu nedenle, burada geliştirilen bu teknik, civciv embriyolarında morfogenez mekaniği ile ilgili gelecekteki çalışmaların önünü açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, in vitro kültür için civciv embriyolarının nasıl hasat edileceğini, vitellin zarının mikro cerrahi olarak nasıl çıkarılacağını, vitellin zarının sağladığı kuvveti nasıl özetleyeceğinizi ve OCT ve parlak alan görüntüleme yoluyla embriyonik morfolojiyi nasıl izleyeceğinizi anlamalısınız.