Deneysel aspergilloz akciğer mantar yükünü belirlemek için histolojik miktar

Bu protokolün genel amacı, invaziv aspergillozlu farelerde pulmoner mantar yükünü histolojik analiz ile ölçmektir. Bu yöntem, mantar patogenezi alanında koruyucu ve zararlı konak yanıt mekanizmaları ve temel mantar virülans faktörleri hakkındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, mevcut histolojik örneklerin, akciğer mantar DNA'sının kantitatif PCR uygulamasıyla karşılaştırılabilir sonuçlarla mantar yükü elde etmek için kullanılabilmesidir.

Bu yöntem invaziv aspergilloz hakkında bilgi sağlayabilse de, patojenlerin konakçı dokularda farklı şekilde boyanabildiği diğer hastalık çalışmalarına da uygulanabilir. Bu yöntem için ilk olarak, DNA kantitatif yöntemlerinden daha az değişkenlik ile akciğer mantar yükünü ölçmek için alternatif yöntemler düşünmeye başladığımızda aklımıza geldi. Enfeksiyon ve hasat prosedürlerini göstermek, bir araştırma teknisyeni olan Angar Tsoggeral olacaktır.

Enfeksiyondan 24 saat önce, her deneysel yedi ila 10 haftalık faredeki nötrofilleri, intraperitoneal olarak 45 derecelik bir açıyla lateral sağ çeyreğine verilen steril salin içinde 0.5 miligram anti-fare-Ly-6G antikoru ile tüketin ve fareleri kafeslerine geri koyun. Ertesi sabah, 1,5 gram 0,5 milimetre cam boncukları bir A.fumigatus conidia kültür plakasına dökün ve boncuklar mantarla kaplanana kadar plakayı hafifçe ileri geri eğin. Conidia kaplı boncuk karışımını 15 mililitrelik konik bir tüpe toplayın ve boncukları beş mililitre DPBS'ye asın.

Boncukları mantardan ayırmak için girdaplayın ve bir hemositometrede 50X süpernatan seyreltmesinde conidia'yı sayın. Conidia'yı mililitre DPBS konsantrasyonu başına bir kez 10 ila 8. conidia'ya seyreltin ve fare başına 50 mikrolitre conidia solüsyonunu ayrı mikropipetlere yükleyin. Ayak parmağınızın sıkışmasına yanıt verilmediğini doğruladıktan sonra, ilk anestezi uygulanmış fareyi sırtüstü pozisyonda eğimli bir tahtaya yerleştirin ve üst kesici dişleri bir lastik bantla ve alt kesici dişleri metal bir tel ile nazikçe sabitleyin.

Ardından, dili tam uzatmada dikkatlice tutmak için küçük forseps kullanın ve dilin tabanına 50 mikrolitre conidia solüsyonu verin. Dili tam ekstansiyonda tutarak, hızlı nefes almayı ve aspirasyonun belirgin tıklama sesini 20 saniye boyunca veya süspansiyon tamamen aspire edilene kadar dinleyin. Ardından, fareyi tam olarak yaslanana kadar izleme ile nazikçe kafesine geri koyun ve bir sonraki hayvanı enfekte edin.

Tüm fareler enfekte olduğunda, hayvanların bir alt kümesini bir antifungal ajan ile enjekte edin ve enfeksiyondan 24 saat sonra tüm hayvanlarda nötrofil tükenmesini tekrarlayın. Mantarı uyguladıktan üç gün sonra, ilk fareyi emici bir ped ile kaplı bir köpük levha üzerine sırtüstü pozisyonda yerleştirin. Farenin bir ayak parmağı tutamıyla ötenazi yapıldığından emin olun ve saçı %70 etanol ile dezenfekte edin.

Uzuvları sabitledikten sonra, akciğerleri ve kalbi ortaya çıkarmak için göğüs kafesini keserek üst göğüs boşluğunu dikkatlice açmak için makas kullanın. Diğer kan damarlarını kesmekten veya herhangi bir organı delmekten kaçınmaya dikkat ederek kalpten inen inferior vena kava'yı kesin ve beş mililitre soğuk DPBS'yi kalbin sağ ventrikülüne yavaşça perfüze etmek için 45 derecelik bir açıyla tutulan 25 gauge bir iğne ile donatılmış beş mililitrelik bir şırınga kullanın. Aynı şekilde beş mililitre% 10 formalin ile perfüzyondan sonra, trakeayı dikkatlice açığa çıkarın ve trakeayı delmemeye dikkat ederek çevredeki yağ yastıkçıklarını çıkarın.

Açıkta kalan trakeayı forseps ile yükseltin ve üst trakeaya bir delik açmak için 25 gauge bir iğne kullanın. Delikten dikkatlice bir kanülü akciğerlere doğru yerleştirin ve kanülü sabitlemek için trakeanın etrafına gevşek bir şekilde cerrahi bir iplik bağlayın. Akciğerleri kanülden bir mililitre% 10 formalin tamponu ile şişirmek için bir mililitrelik bir şırınga kullanın ve kanülü hızlı ama dikkatli bir şekilde çıkarın.

Trakeayı kapatmak için cerrahi ipliği sıkın ve bağ dokusunun bağlantısını kesmek için ipliği hafifçe çekerek akciğerlerin ve trakeanın alınmasına izin verin. Dokuları, ipliğin bir ucu tüpün dışında olacak şekilde 15 mililitre% 10 formalin tamponu içeren 15 mililitrelik konik bir tüpe yerleştirin. Ardından, kapağı kapatın ve numuneyi ve sabitleyiciyi en az 24 saat boyunca tamamen daldırmak için tüpü ters çevirin.

Hasat edilen dokuyu görüntülemek için, önce uygun bir görüntüleme niceleme programı açın ve 10X objektif altında her Gomori'nin modifiye metanamin gümüşü veya GMS lekeli slaytının en az dört farklı alanını elde etmek için bir ışık mikroskobu kullanın. Görüntülerin akciğer içindeki enfekte hava yollarını temsil ettiğinden ve benzer bir doku yoğunluğu sergilediklerinden emin olun. Görüntülere ölçek çubukları eklemek için, Düzenle menüsü altında Kalibrasyon İşaretleri Ekle/Düzenle'yi seçin ve çizgi kalınlığını, rengi ve ölçek çubuğu boyutunu seçin.

Ölçek çubuğunun yerleştirileceği görüntüye tıklayın, ardından Düzenle menüsünü açın ve her görüntüye bir ölçek çubuğu eklemek ve görüntüleri uygun deney grubu klasörlerine kaydetmek için Kalibrasyon İşaretlerini Birleştir ve Birleştir'i seçin. Her hayvandaki mantar yükünü hesaplamak için uygun bir görüntü işleme programı açın ve ilk görüntü klasörünü açın. Görüntü menüsü altında, görüntüleri dönüştürmek için Tür ve RGB Yığını'nı seçin.

Sağ ok tuşunu kullanarak üç görüntüden ikincisini seçin ve Eşik menü ayarları ayarlayıcısını açmak için Control-Shift-T tuşlarına basın. Referans olarak orijinal tiff veya jpg görüntüsünü bulun ve görüntüyü bir görüntü görüntüleme programıyla açın. Eşik değeri seçerken, seçilen alanın mantar hiflerini temsil etmesi ve numuneler arasında tutarlılığı sağlamak için orijinal görüntüyü görüntüleyebilmek çok önemlidir.

Üst kaydırıcıyı en sola hareket ettirin ve seçilen kırmızı alan mikroskopi görüntüsünü temsil edene kadar alt kaydırıcıyı ayarlayın. Ayarla ve Tamam'a tıklayın ve Analiz Et ve Ölçümleri Ayarla'yı seçin ve Alan, Alan fraksiyonu, Eşik sınırı, Etiketi görüntüle ve alt ayarları varsayılan olarak bırakın. Tamam'a tıklayın ve Analiz Et ve Ölç'ü seçin.

Sonuçlar görünmelidir. Ardından, verileri grafik oluşturma ve istatistiksel analiz için bir veri analiz programına aktarın ve her akciğer örneği için dört veya daha fazla alan yüzdesinin ortalamasını girin. Bu temsili sağkalım grafiğinin gösterdiği gibi, enfeksiyon sonrası bir antifungal ajan ile tedavi edilen invaziv aspergillozlu eozinofil eksikliği olan fareler, vahşi tip hayvanlara kıyasla daha yüksek bir sağkalım sergiler.

İnvaziv aspergillozlu nötropenik vahşi tip ve eozinofil eksikliği olan farelerden temsili GMS boyama, antifungal tedavi ile veya antifungal tedavi olmadan vahşi tip hayvanlarda karşılık verilmeyen antifungal ile tedavi edilen nakavt farelerde neredeyse toplam bir mantar klerensi ortaya koymaktadır. Ayrıca, kantitatif PCR ve manuel ışık mikroskobu GMS miktar tayini, az önce gösterildiği gibi, antifungal ajan tedavisinin vahşi tip ve eozinofil eksikliği olan fareler arasında en önemli mantar yükü azalmasına neden olduğunu doğrulamaktadır. Bununla birlikte, tedavi edilmeyen farelerde, bu deneyde sadece GMS kantitasyonu, eozinofil eksikliği olan farelerde önemli bir azalma belirledi.

Tüm akciğer GMS boyalı kesitlerinin ortalama alanları dört-X büyütme altında hesaplandığında, farklar, daha az istatistiksel anlamlılığa sahip olmasına rağmen, dört temsili 10X alanla elde edilen sonuçlara benzerdir. Aynı antifungal ajan ile tedavi edilen gama-delta T hücresi eksikliği olan farelerde de benzer sağkalım, mantar yükü ve mantar temizleme sonuçları gözlenir. Bu prosedürü denerken, histolojik bölümlerin fotoğraflarını çekerken ve karşılaştırılabilir sonuçlar elde etmek için eşik değerini ayarlarken tutarlı kalmak önemlidir.

Bu prosedürü takiben, akciğerlerdeki ve diğer dokulardaki hastalık patolojisi ile ilgili ek soruları yanıtlamak için hedef ve arka plan boyaması arasındaki açık farklılıkların örneklerinin histolojik analizini içeren diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, istemsiz aspirasyon yoluyla farelere mantar konidia ile nasıl enfekte olunacağını ve bir görüntü işleme yazılımı ile akciğer dokusu kesitlerinde mantar büyümesinin nasıl ölçüleceğini iyi anlamış olmalısınız. Aspergillus fumigatus ve Gomori'nin modifiye edilmiş metanamin gümüş lekesi ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken kişisel koruyucu ekipman giymek ve iyi havalandırılan bir başlık altında çalışmak gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.