Kan - beyin bariyerini bozulma iskemik inme, bir fare modeli Vivo içinde değerlendirilmesi

Bu yordamı genel amacı fare modelleri iskemik inme kan - beyin bariyerini bozulma vivo içinde değerlendirmesi için son derece tekrarlanabilir bir teknik sağlamaktır.

Bu prosedürün genel amacı, iskemik inmenin bir reaksiyon modelinde kan-beyin bariyeri bozulmasının in vivo değerlendirmesi için yüksek oranda tekrarlanabilir bir yöntem sunmaktır. Bu, beynin sol tarafında orta serebral arter tıkanıklığı için intraluminal filament kullanılarak iskemik inme indüksiyonu ile gerçekleştirilir. İşlemin bir sonraki adımı, orta serebral arter tıkanıklığının bitiminde ve reperfüzyon periyodunun başlangıcında juguler ven dış dalının kanülasyonu ve Evans Blue boyasının enjeksiyonudur.

Yirmi dört saat sonra derin anestezi altında, hayvanın dolaşım sistemi Evans Blue'dan yıkanır ve beyin çıkarılır. Daha sonra iki serebral hemisfer ayrılır, homojenize edilir ve santrifüjlenir ve sonuçta bir spektrofotometre ile Evans Blue konsantrasyonunu ölçmek için dokuların süpernatanları kullanılır. Anestezi ve flowmetri.

% 4 izofluran kullanarak anesteziyi indükleyin ve% 70 azot oksitve% 1.5 oksijen karışımı içinde% 1-13 izofluran ile koruyun. Anestezi uygulanmış hayvanı geri besleme kontrollü ısıtma battaniyesi üzerine yüzüstü pozisyonda yerleştirin ve bu ısıtma ünitesine bağlı bir rektal prob vasıtasıyla vücut ısısını normal fizyolojik aralıkta tutun. Kafatasının sol tarafındaki ameliyat bölgesini tıraş edin ve cildi dezenfekte etmek için bir gazlı bez kullanarak Betadine solüsyonu uygulayın.

% 70 etanol içeren steril bir ped ile değiştirin ve her iki adımı da üç döngü ile tekrarlayın. Kafatası üzerinde sol gözün yan kantusundan sol kulağın tabanına kadar uzanan bir santimetre uzunluğunda bir cilt kesisi yapın ve kafatasını ortaya çıkarmak için sol temporalis kasını inceleyin. Ardından, Doppler akış ölçer kalem probunun ucunun yerleştirilmesini kolaylaştırmak için bregmanın beş milimetre yanal ve bir milimetre arkasında küçük bir delik açın.

Fareyi yüzüstü pozisyondan sırtüstü pozisyona çevirin ve ardından bölgesel serebral kan akışını izlemek için lazer kalem probunu daha önce delinmiş kafatası deliğine yerleştirin. Her hayvanın başlangıç bölgesel serebral kan akışını kaydedin ve bunu fokal serebral iskeminin %100 indüksiyonu olarak düşünün. Boyun bölgesini tıraş edin ve cildi Betadine solüsyonu ve% 70 etanol ile dezenfekte edin.

Analjezi için ameliyat bölgesine deri altına 0.2 mililitre% 0.5 bupivakain enjekte edin. Sol ortak karotis artere erişmek için boynun ventral yüzeyinde iki santimetre uzunluğunda bir cerrahi kesi yapın. Dış karotis arter ve iç karotis arterin çatallanmasına erişmek için ortak karotis arteri komşu fasya ve vagus sinirinden izole edin.

Sol ana karotis arteri veya eksternal karotis arteri 5-0 kese sütür kullanarak kalıcı olarak bağlayın ve internal karotis arteri pterygopalatin arter seviyesine kadar diseke edin. Ortak karotis arterin etrafına gevşek bir şekilde 5-0 keseli bir sütür yerleştirin ve ardından iç karotis arteri vasküler bir mikro klipsle geçici olarak klempleyin. Daha önce yerleştirilmiş gevşek kravattan önce ana karotis arter üzerinde küçük bir kesi yapın ve ardından internal karotis arterin lümen boşluğuna 4-0 silikon kaplı naylon sütür yerleştirin ve naylon sütürü sabitlemek ve kan sızıntısını önlemek için sütürü ortak karotis arterin etrafına sıkın.

Vasküler mikro klipsi iç karotis arterden çıkarın. Daha sonra, orta serebral arter orijininin tıkandığını gösteren bölgesel serebral kan akışında belirgin bir düşüş gözlemleyene kadar silikon kaplı intraluminal filamenti ilerletin. Özellikle, bölgesel serebral kan akımında %80'den fazla bir azalma tespit edildiğinde medial serebral arter tıkanıklığı başlar.

Bu modelde, filamenti atriyal yola doğru bir şekilde yönlendirmek için bir mikro kelepçe kullanarak pterygopalatin arteri geçici olarak bloke ediyoruz. Unutmayın, bu adım medial serebral arter tıkanıklığının başarısı için çok önemlidir. Juguler ven kanülasyonu ve Evans Blue enjeksiyonu.

Boyunda orta hattın sol tarafına bir santimetre uzunlamasına bir kesi yapın ve ardından sol juguler venin dış dalına erişmek için yüzeysel fasyayı künt bir şekilde inceleyin. Daha sonra juguler venin kornual ucunu 5-0 kese sütür ile kalıcı olarak bağlayın. Damarın etrafına gevşek bir şekilde iki bağ yerleştirin ve ardından juguler venin kalp ucunu vasküler mikro kelepçe ile geçici olarak klempleyin.

Şah damarı üzerinde iki dikişle küçük bir kesi yapın ve ardından heparinize serum dolu kateteri damarın lümen boşluğuna yerleştirin ve yaklaşık 10 milimetre ilerletin. Daha sonra, kateteri sabitlemek ve kanamayı önlemek için damar etrafındaki bağları sıkın. Damarın çökmesini önlemek için az miktarda serum enjekte edin.

İskemik sürenin sonunda yani 90 dakika sonunda intraluminal sütür çekilerek reperfüzyona başlanır. Reperfüzyon periyodunun başlangıcında, Evans Blue boyasını beş dakikalık bir süre boyunca tuzlu su içinde kilogram başına bir mililitre% 2'lik çözelti üzerine yavaşça enjekte edin. Daha sonra, kanülü 0.5 mililitre normal salin enjeksiyonu ile yıkayın ve enjeksiyon kanülünü damardan çekin.

Evans Blue enjeksiyonundan sonra dokunun renk değişimine dikkat edin. Son olarak, boyun ve baş kesilerini dikin ve hayvanı bir kurtarma kafesine yerleştirin. Kan-beyin bariyeri geçirgenliğinin değerlendirilmesi.

24 saatlik reperfüzyondan sonra, hayvanı sodyum tiyopental ile derinlemesine uyuşturun. Daha sonra sternumun altında küçük bir delik açarak göğüs boşluğunu açın. Sağ atriyumda küçük bir açıklık açın ve atriyumdan kalan normal salin renksiz hale gelene kadar Evans Blue'yu dolaşımdan uzaklaştırmak için sol ventrikülden 15 dakika boyunca 250 mililitre önceden ısıtılmış salin enjekte edin.

Beyni hemen kafatasından çıkarın ve beyin matrisine yerleştirin. Koku soğancağını ve beyinciği inceleyin ve ardından temiz bir tıraş bıçağı kullanarak beynin sağ yarım küresini orta hat boyunca soldan ayırın. Her yarım küreyi tartın ve 2,5 mililitre fosfat tamponlu tuzlu su içinde ayrı ayrı homojenize edin ve ardından bir girdap makinesi kullanarak 2,5 mililitre% 16 trikloroasetik asit ile iki dakika karıştırın.

Beyin örneklerini 30 dakika santrifüjleyin ve buzdolabında 10 dakika soğumaya bırakın. 610 nanometrede bir spektrofotometre ile Evans Blue absorbansını tahmin etmek için süpernatantları kullanın. Temsili sonuçlar.

Sahte olarak ameliyat edilen hayvanlarda, beynin her iki yarım küresi için hazırlanan dokuların Evans Blue konsantrasyonu çok küçüktür ve birbirleriyle karşılaştırıldığında önemli bir fark yoktur. 90 dakika boyunca iskemi indüksiyonu ve ardından 24 reperfüzyon, iskemik sıçanlarda beynin lezyonlu hemisferinde Evans Blue seviyelerinde önemli bir artışa neden oldu. Toplu olarak, bu bulgular, normal koşullar altında, Evans Blue'nun kan-beyin bariyerini serebral parankim'e kolayca geçemediğini ve serebral iskemik hakaretlerin, kan-beyin bariyerinin kurum içi geçirgenliği yoluyla Evans Blue'nun ekstravazasyonunu indüklediğini göstermektedir.

Fotoğraf, sahte ve iskemik hayvanlarda beyni gösteriyor. Mavi renkli beyin dokusundaki Evans Blue ekstravazasyonunun yoğunluğunun, lezyonlu hemisferdeki kan-beyin bariyeri bozulmasının boyutundan kaynaklandığını unutmayın. Son. Kan-beyin bariyerinin in vivo değerlendirmesi, araştırmacının iskemiye bağlı vazojenik beyin ödeminin olası patofizyolojik mekanizmalarını incelemesine ve yeni terapötik müdahaleler bulmasına olanak tanır.

Bu teknik basit ve güvenilirdir. Bir araştırmacının, tekniğin performansını daha da artırmak ve doğruluğunu sağlamak için bazı teknik noktaları dikkate alması gerekir. Lazer Doppler flowmetre ile bölgesel beyin kan akımının sürekli kaydedilmesi ve silikon kaplı filament kullanılması MCAO başarı oranını arttırabilmekte ve mortalite oranını azaltabilmektedir.

Enjeksiyonun dozu ve zaman noktası, iskemik inflatörleri takiben kan-beyin bariyerinin dinamik doğası nedeniyle güvenilir sonuçlar elde etmek için iki temel parametredir.