Name: Confocal mikroskobu ortaya hücre yüzey reseptör toplama görüntü korelasyon spektroskopisi ile (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: Öğrenin hücre yüzeyi reseptör kümelerini konfokal mikroskopi ve görüntü korelasyon spektroskopisi ile nicelendirmeyi. Bu yöntem ilaç hedefi araştırmalarında reseptör dinamiklerini anlamak için kritik öneme sahiptir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Çekmek--dan NHMRC (arkadaş grubu 1084178 ve hibe 1087850, 1030469, 1075898 (AMS)), fon yazarlar kabul kanser Avustralya, Ludwig kanser araştırmaları, John Reid T güvenir, tedavi beyin kanseri Vakfı, La Trobe Üniversitesi ve Victoria kanser Ajansı. Operasyonel altyapı destek programı Victoria Hükümeti tarafından sağlanan fon, Avustralya da kabul edilmektedir.

1. deney görüntüleme için yapisan hücre satırlarını tohumlama
<ol><li>İyi geceleme (O/N) 300 µL % 10 içeren Dulbecco'nın modifiye kartal orta/besin karışımı F-12 (DMEM/F-12) medya başına 10.000 A431 epidermoid Karsinomu Hücre tohum Fetal sığır Serum, 1 penisilin-streptomisin ve % %1 GlutaMAX bir 8 odalı görüntüleme slayt için yüksek çözünürlüklü yağı daldırma objektif lens uygun (Örneğin, NuncTM laboratuar-TekTM odalı coverglass).</li>
	<li>Reseptör toplama 100 ng/mL EGF ligand medya (RT) Oda sıcaklığında 10 dakika ilavesi ile A431 hücreleri üzerinde teşvik.</li>
</ol>2. birincil antikor kuluçka
<ol><li>Medyayı çıkarın ve oda sıcaklığında (RT) fosfat tamponlu tuz (1 x PBS) 300 µL hücrelerle iki kez yıkayın.</li>
	<li>PBS içinde % 4 paraformaldehyde 10 dk RT. az için 200 µL ile hücreleri tamir Not: geçici değişiklikler hedef toplama keşfetmek için bu fiksasyon adımı ihmal gerekir.</li>
	<li>İngiltere'de yılın kaldırmak ve oda sıcaklığında PBS 300 µL hücrelerle iki kez yıkayın.</li>
	<li>10 µg/mL için en az 2 h 4 ° C'de bir konsantrasyon, birincil antikor içeren PBS 200 µL hücrelerle kuluçkaya Not: ICS hesaplamaları geçerli olması için tüm reseptörleri hücre yüzeyi mevcut birincil antikor ile etiketlenmesi gerekir. Bu birincil her antikor seyreltme dizi ile ön deneyler gerektirir (1:10, 1:50, 1: 100, 1: 200, 1:500 1:1, 000, vb) gerçekleştirilecek. Optimum birincil antikor konsantrasyon küme yoğunluğu karşı Floresan Yoğunluk Analizi ile belirlenir. Küme yoğunluğu yaylalar küme yoğunluğu non-spesifik antikor bağlama bir sonucu olarak bir artış daha önce birincil antikor konsantrasyonları artan ile seçilen birincil konsantrasyonu oluşur. Birincil antikor serum ücretsiz medyada bir zaman ders görüntüleme deneyi gerçekleştirmek Eğer seyreltilmiş.</li>
	<li>İstenen kuluçka süresi tamamlanmasını takiben, RT PBS 300 µL hücrelerle iki kez yıkayın.</li>
	<li>%5 Sığır serum albümin (BSA) PBS içinde en az 2 h 4 ° C'de için örnekle engellemek Not: Sabit örnekleri rutin olarak engellenir gecelik (O/N) 4 ° C'de</li>
</ol>3. ikincil antikor kuluçka
<ol><li>10 µg/mL stokunun fluorescently PBS ikincil antikor (Örneğin Alexa 488 Fluor IgG) etiketli hazırlayın. Höchst 33342 2 µg/mL mikroskop gelişmiş örnek keşif için izin vermek için bu seyreltme eklenebilir. Not: hızlandırılmış deneyler için PBS serum boş ortam için değiştirilebilir.</li>
	<li>%5 kaldırmak BSA/PBS hücrelerden ve ortam ışığı örnekleri koruyarak 4 ° C'de 2 h için ikincil antikor çözüm ile kuluçkaya.</li>
	<li>İkincil antikor kuluçka süresi tamamlandığında, PBS (iki kez), 300 µL hücrelerle yıkayın ve ortam ışığı koruma 4 ° C'de depolayın.</li>
	<li>Buharlaşma önlemek için parafilm odası slaytla kenarlarını sarın.</li>
</ol>4. confocal mikroskobu örnekleri
Not: confocal analiz için kullanılan ayarları ekipman ve fluorophores bireysel deneyde kullanılan bağlı olarak farklı olacaktır. Modern confocal aletleri enstrümanın yerel görüntü dosyası biçiminde deneyinde kullanılan tüm görüntüleme parametreler kaydetmek için mekanizmalar kullanır. Bu ayarlar veri toplama farklı dönemleri arasında deneysel koşullar uygun çoğaltma için sağlamak için kaydedilir önemlidir.
<ol><li>Floresan sinyallerini görüntüleme sırasında aşırı doygunluk kaçının. Piksel doygunluk yanlış renk gösterimini sağlar tablo bir resim arama kullanın ve dedektör kazanç azaltmak ve buna göre güç lazer. En confocal aletleri bir "aralığı göstergesi" ayarını veya benzer seçenek satın alma yazılım bunun için içerir.</li>
	<li>Fluorophore güç lazer ilgi pozlandırmayı en aza indirmek. Höchst 33342 gibi DNA etiketleme leke kullanımını algılamak ve örnek koleksiyon önce görüş alanı yerleştirmek için kolay bir mekanizma sağlar.</li>
	<li>Düşük çözünürlükte örnek ilk taramalar gerçekleştirmek ve yazılım hızlı izin verir Eğer tarama hızı. Bu örnek mümkün photobleaching sınırlar.</li>
	<li>Yakalama çözünürlüğünü artırmak ve hazır olduğunuzda görüntü verilerini toplamak tarama hızı yavaş.</li>
	<li>Confocal enstrüman izin veriyorsa, bir foton modu sayma kullanarak veri toplamak. Not: foton sayma araç üzerinde kullanılabilir değilse: gri düzeyleri doğrusal resim alma sırasında olduğundan emin olun.</li>
	<li>İğne deliği ve sondaj 1 havadar birimine (AU) kullanılan her lazer çizgi için ayarlayın.</li>
	<li>Kullanım satır veya çerçeve dedektörü azaltmak için resim alma sırasında (x4) ortalama gürültü ilişkili. Not: yalnızca bir zaman noktası yakalanır gibi ICS bu varyant edinme zaman deneysel değil faktörü sınırlama.</li>
	<li>Resim koleksiyonu seçin yüksek büyütme maksimum çözünürlük ve düzeltme için küresel ve kromatik aberasyonları (planı-Apochromat 100 X veya 63 X /1.40 örnekler sağlamak için bir Plan-Apochromat amaç gibi yüksek sayısal diyafram amaç için Petrol hedefleri).</li>
	<li>Görüntüyü içinde yakalanan piksellerin boyutunu oversample. Her piksele bir 50 x 50 nm bölge yakalama önerilir. Etkili ICS için piksel boyutu 0.1 x 0,1 µm2 piksel başına daha az olmalıdır. Bu nispeten küçük bir alanda taramak için yakınlaştırma ve nispeten büyük resim biçimi (Örneğin 1024 x 1024 veya 2048 x 2048 piksel) seçerek bir kombinasyonu tarafından gerçekleştirilir.</li>
	<li>Hücre bir bölge gibi dümdüz, apikal veya bazal yüzeyi odak. Birden fazla hücreyi tek bir görüntü ve bölgelerde ayrı ayrı ICS çözümleme sırasında işlenen ilgi toplanabilir.</li>
	<li>Örnek normalleştirme için kullanılan aynı araç ayarları kullanarak bir hücre ücretsiz arka plan bölge yakalamak.</li>
</ol>5. resim korelasyon spektroskopisi hesaplanması
Not: Açık kaynak görüntüleme-işlem platformu, Fiji, bir dağıtım ImageJ programının otokorelasyon ve matematiksel işlevler ICS için temel gerçekleştirmek için gereklidir. Çok sayıda önceden yüklenmiş eklentiler ve birden çok görüntüleme deneyler işlemleri yapabilirsiniz daha kolay bir güncelleştirme mimari içerir bu şekilde dağıtılması, ImageJ önerilir.
<ol><li>Fiji programı (http://fiji.sc/Downloads) yükleyin.</li>
	<li>Alınan veri yükleyin.</li>
	<li>Faiz ve yinelenen piksel boyutunu 2n (256 x 256, 128 x 128, 64 x 64) için apikal veya bazal hücre yüzey membran bölgesi tanımlayın. "Menü: görüntü &gt; yinelenen..."</li>
	<li>Kırpılan alanı ilgi ortalama yoğunluğunu hesaplamak "menü: Analiz &gt; ölçümleri."</li>
	<li>Bir arka plan bölge tanımlamak ve yinelenen yakalama hücre yüzey membran aynı piksel boyutunu (2n: 256 x 256, 128 x 128, 64 x 64). "Menü: görüntü &gt; yinelenen..."</li>
	<li>İlgi alanı kırpılmış arka plan ortalama yoğunluğunu hesaplamak. "Menü: Analiz &gt; ölçümleri."</li>
	<li>Görüntü faiz bölge içeren kökenli ortalama yoğunluğu çıkarma. "İşlem &gt; görüntü hesap makinesi &gt; çıkarın."</li>
	<li>
Otokorelasyon hesaplama gerçekleştirmek. Bu hesaplama menü yapısı içinde yer alıyor: "işlem &gt; FTT &gt; FD matematik."
	<ol>
<li>FD Math'kutusunu seçin iletişim: görüntü 1: kırpılmış görüntü adı, işlem olarak korelasyon, resim 2: kırpılmış görüntü adı, ters dönüşüm üzerinde.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ortaya çıkan görüntü piksel toplam sayısına bölerek normalize. "Menü: işlem &gt; Matematik &gt; bölmek..." (yani: 64 x 64 piksel 4096 =)</li>
	<li>Tekrar normalleştirilmiş ortalama yoğunluğu tarafından bölünmesi ile kare alan kırpılmış normalleştirmek. "Menü: işlem &gt; Matematik &gt; bölmek..." Not: Bu görüntü ortalama yoğunluk değeri tarafından iki kez bölerek elde edilebilir.</li>
	<li>Noktaya yayılmış işlevi bir çizgi çizin.</li>
	<li>Tepe değeri hesaplamak için bu satırı profil çiz. "Menü: Analiz &gt; Arsa profil."</li>
	<li>Bir e-tabloya tepe değeri (5.12 sonucu) aktararak ışını alan başına kümeleri hesaplamak ve (Eq 6) aşağıdaki hesaplama: <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/57164/57164eq7v2.jpg">
</li>
</ol>6. toplu işleme ICS veri kümeleri
Not: FIJI/ImageJ makro kurulması yukarıdaki iletişim kuralında tanımlanan yordamlar çoğaltmak için önerilir. Bu görüntü korelasyon Spektroskopi analiz sırasında birden fazla resim dosyaları tutarlı ve hızlı analiz için sağlar.
<ol><li>ICS protokolünde her menü komutu kaydederek bir makro ICS iş akışı kurmak "Menü: Eklentiler &gt; makrolar &gt; kayıt...".</li>
	<li>"Makro oluşturmak için Oluştur" seçeneğini belirleyin.</li>
	<li>Seçin "dil &gt; IJ1 makro."</li>
	<li>Makroyu kaydedin.</li>
	<li>
Makronun her işlev işleçleri için anımsatıcılar sağlayan çeşitli adımlar için iletişim kutuları eklemek. İletişim kutuları da daha fazla işlem (Örneğin, bölge kırpmak için) önce yapılması uygun seçimler için izin vermek için analiz süreci duraklatmak için bir yöntem olarak hizmet.
	<ol>
<li>İletişim kutusu makro kodu Başlık = "İletişim kutusu başlığı"; msg = "İletişim kutusu/iletişim kuralı adım iletisi"; waitForUser (başlık, msg); Not: Ek verimliliği FIJI Güncelleyici (yönergeler https://imagej.net/BAR) içinde BAR update sitesine abone olarak kurulabilir. Bu "geniş ilgili yordamları topluluğu" 14ile FIJI sağlar. Böyle bir rutin bul tepeler var. Menü yapısı: "BAR &gt; Veri Analizi &gt; bul tepeler." Bu komut dosyasını hızlı bir nokta profilde tepe değeri işlev yaymak hesaplama araçları sunmaktadır.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. iletişim kuralı uzantıları: Hesaplama mikroskop ışın alanının
Not: Mikroskop optik transfer fonksiyonu bile moleküler büyüklükteki nesneler hakkında yarıçaplı görüntü olarak görüntülenir sağlar x-y uçaktaki 200-300 nm. ICS iletişim kuralı alt çözünürlük floresan boncuk üzerinde 4-5 adımları gerçekleştirerek noktası yayıldı fonksiyonu tayini sağlar. Özellikle:
<ol><li>Alt çözünürlük monte (yani &lt; 100 nm çapında) üzerine 8 floresan boncuk Oda görüntüleme slayt.</li>
	<li>Başı olarak açıklanan protokol ICS deneyler için kullanılan confocal mikroskop kullanarak görüntü boncuk.</li>
	<li>Ortaya çıkan görüntü Protokolü adımları 5.1-5.13 göre ICS işlevinden hesaplayın.</li>
	<li>Çizilen profilden ışın RADIUS (r) ICS işlevinin yarım maksimum değeri tam genişlikte olarak hesaplayın.</li>
	<li>Işın alan (BA) (Eq 7) hesaplamak:<img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/57164/57164eq8v2.jpg">
</li>
</ol>8. iletişim kuralı uzantıları: Hesaplama alanının birim kümelerinin
<ol><li>Küme yoğunluğu (CD) alan adedi (Eq 8olarak) hesaplamak: <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/57164/57164eq9v2.jpg"> <img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/57164/57164eq10v2.jpg">
</li>
	<li>Işın alan (5.13 sonucu) başına kümeleri (7,5 sonuç) kiriş alanına göre bölün.</li>
</ol>

<ol><li>Scott, A. M., Wolchok, J. D., Old, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+therapy+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Antibody therapy of cancer.</a> Nature reviews. Cancer. 12 (4), 278-287 (2012).</li>
<li>Parslow, A. C., Parakh, S., Lee, F. -T., Gan, H., Scott, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody-Drug+Conjugates+for+Cancer+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">Antibody-Drug Conjugates for Cancer Therapy.</a> Biomedicines. 4 (3), 14(2016).</li>
<li>Sorkin, A., Waters, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytosis+of+growth+factor+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays%22%5BJournal%5D)">Endocytosis of growth factor receptors.</a> BioEssays. 15 (6), 375-382 (1993).</li>
<li>Pawley, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPawley%2C+J+%22Handbook+of+Biological+Confocal+Microscopy%22">Handbook of Biological Confocal Microscopy</a>. , Springer Science & Business Media. (2006).</li>
<li>Petersen, N. O., Höddelius, P. L., Wiseman, P. W., Seger, O., Magnusson, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+membrane+receptor+distributions+by+image+correlation+spectroscopy%3A+concept+and+application%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Quantitation of membrane receptor distributions by image correlation spectroscopy: concept and application.</a> Biophysical Journal. 65 (3), 1135-1146 (1993).</li>
<li>Wiseman, P. W., Petersen, N. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+Correlation+Spectroscopy.+II.+Optimization+for+Ultrasensitive+Detection+of+Preexisting+Platelet-Derived+Growth+Factor-%CE%B2+Receptor+Oligomers+on+Intact+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Image Correlation Spectroscopy. II. Optimization for Ultrasensitive Detection of Preexisting Platelet-Derived Growth Factor-β Receptor Oligomers on Intact Cells.</a> Biophysical Journal. 76 (2), 963-977 (1999).</li>
<li>Costantino, S., Comeau, J. W. D., Kolin, D. L., Wiseman, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accuracy+and+Dynamic+Range+of+Spatial+Image+Correlation+and+Cross-Correlation+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Accuracy and Dynamic Range of Spatial Image Correlation and Cross-Correlation Spectroscopy.</a> Biophysical Journal. 89 (2), 1251-1260 (2005).</li>
<li>Claire Robertson, S. C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theory+and+practical+recommendations+for+autocorrelation-based+image+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Theory and practical recommendations for autocorrelation-based image correlation spectroscopy.</a> Journal of Biomedical Optics. 17 (8), 080801(2012).</li>
<li>Ciccotosto, G. D., Kozer, N., Chow, T. T. Y., Chon, J. W. M., Clayton, A. H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggregation+Distributions+on+Cells+Determined+by+Photobleaching+Image+Correlation+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Aggregation Distributions on Cells Determined by Photobleaching Image Correlation Spectroscopy.</a> Biophysical Journal. 104 (5), 1056-1064 (2013).</li>
<li>Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Abràmoff, M. D., Magalhães, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="https://imagescience.org/meijering/publications/1115/">Image processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11 (7), 36-42 (2004).</li>
<li>Collins, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ+for+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">ImageJ for microscopy.</a> BioTechniques. 43 (1 Suppl), 25-30 (2007).</li>
<li>Rappaz, B., Wiseman, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+correlation+spectroscopy+for+measurements+of+particle+densities+and+colocalization%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Image correlation spectroscopy for measurements of particle densities and colocalization.</a> Current protocols in cell biology. , Chapter 4, Unit 4.27.1-15 (2013).</li>
<li>Ferreira, T., Hiner, M., Rueden, C., Miura, K., Eglinger, J., Chef, B. tferrS. criptsB. A. R. tferr/Scripts: BAR 1.5.1. Zenodo. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://zenodo.org/record/495245">https://zenodo.org/record/495245</a> (2017).</li>
<li>Elson, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+Correlation+Spectroscopy%3A+Past%2C+Present%2C+Future%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Fluorescence Correlation Spectroscopy: Past, Present, Future.</a> Biophysical Journal. 101 (12), 2855-2870 (2011).</li>
<li>Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+molecular+interactions+in+living+cells+by+FRET+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Imaging molecular interactions in living cells by FRET microscopy.</a> Current opinion in chemical biology. 10 (5), 409-416 (2006).</li>
<li>Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2835776/">Super-Resolution Fluorescence Microscopy.</a> dx.doi.org.ez.library.latrobe.edu.au. 78 (1), 993-1016 (2009).</li>
<li>Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+super-resolution+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A guide to super-resolution fluorescence microscopy.</a> The Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).</li>
<li>Nohe, A., Petersen, N. O. <a target="_blank" href="http://stke.sciencemag.org/content/2007/417/pl7">Image Correlation Spectroscopy.</a> Sci. Signal. (417), pl7(2007).</li>
</ol>

Andrew M Scott AbbVie ilaç sanayii, EMD Serono ve Daiichi Sankyo Co destek finansman araştırma ve bir danışmanlık ve Yaşam Bilim İlaç hisse senedi sahipliğini vardır. Yazarlar hiçbir diğer ilgili üyelikler veya herhangi bir organizasyon ile mali müdahalesi veya mali ilgi ile varlık ya da konu veya el yazması bu ifşa dışında ele malzemeleri mali çatışma var.

Biz bu protokol için tarif görüntü korelasyon spektroskopisi (ICS) Teknik uzman Dedektörleri için gerek kalmadan standart confocal mikroskoplar kullanır. Açıklanan ICS tekniği artan istatistiksel analiz için birden fazla tedavi koşullardan hızlı örnekleme sağlamak için köklü immunocytochemistry yöntemleri kullanır. Bu metodoloji kadar tam olarak floresans dalgalanmaları floresans gibi confocal bir birim aracılığıyla difüzyon mobil moleküllerin korelasyon dayalı alternatif tek molekül teknikleri ile karşılaştırıldığında h...

Terapötik antikorlar gelişimi birden fazla tümör tip1tedavisinde olağanüstü başarı göstermiştir. Antikor: reseptör etkileşimleri hücreden dinamiklerini anlamak için gereksinimleri sitotoksik bileşikler için teslimat mekanizmalarını genişletti sıra antikor-uyuşturucu conjugates (ADC) son gelişmeler2yüzey. Başarılı bir antikor hücre yüzey reseptör için hedefleme takiben, bu komplekslerin olanlara ligand: antikor etkileşimleri3' te gözlemlenen benzer toplama modeller tetikleyebilir. Reseptör toplama içinde değişiklikler hücre yüzeyinden membran ve içselleştirilmesi sonucu reseptör ve onun kaldırma için değişiklikleri tetikleyebilir. Bir antikor-uyuşturucu eşlenik bağlamında, bu işlemi daha sonra içine içselleştirilmiş endosomes ve daha sonra etkili hücre öldürme kaynaklanan sitoplazma, sitotoksik yükü serbest bırakır.
Confocal mikroskobu antikorlar ve onların hedef reseptörleri4önemli bu etkileşimleri görselleştirmek için etkili bir yol sağlamıştır. Toplama hedef molekülün hücre yüzeyinde değişiklikler keşfetmek için bir kayma görüntü korelasyon spektroskopisi (ICS) tekniği 5,6,7 ile confocal mikroskobu görüntülerin işlem sonrası bu protokolü kullanır .
Görüntü korelasyon spektroskopisi kayma floresan yoğunluğu dalgalanmaları etiketli yapıları yoğunluğu ve toplama durumunu arasında bir ilişki paylaşmak gözlem temelidir. Bu ilişki bir kayma otokorelasyon işlev yakaladığınız görüntüyü5hesaplanması aşağıdaki kurulur.
Tüm değişik-in resim korelasyon spektroskopisi bir görüntü otokorelasyon hesaplanması gerekir. Bu iki boyutlu bir Gauss eğrisi görüntü içinde bulunan nicel toplama durumu parametreleri çıkarım için bu işleve yaklaştırarak takip ediyor. Tek bir görüntü içinde bulunan ve olasılığını hesaplamak mümkün piksel ikili karşılaştırma bir görüntü otokorelasyon hesaplanması açısından basit içerir bu ikisi de eşit diğer her kadar parlak. Bu işlev mesafe ve yön piksel ayrılık8görüntülenir.
Kuramsal çerçeve resim korelasyon spektroskopisi için kurulan ve Petersen ve Wiseman ve arktarafından tanımlanan. 5 , 6. bu protokol için otokorelasyon hesaplamalar Fiji/ImageJ gibi bir elektronik tablo uygulaması yapılır, yoğunluk dalgalanma kayma otokorelasyon fonksiyonu için temel (Eq 1)tarif edilebilir:
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57164/57164eq1v2.jpg">     
Burada F Fourier dönüşümü gösterir; F– 1 ters Fourier dönüşümü; F * onun karmaşık eşleniği; ve kayma gecikme değişkenleri ε ve η. Kayma ICS bu protokol için açıklandığı gibi otokorelasyon işlevi bir 2D hızlı Fourier dönüşümü algoritma7,9kullanılarak hesaplanabilir. Aksi halde sıfır-lag, g11(0,0) bilinen sıfır kayma ayırma, otokorelasyon parçacıklar mikroskop ışını alan mevcut ters ortalama sayısını sağlar. İki boyutlu bir Gauss işlev (Eq 2)kayma otokorelasyon işleve yaklaştırarak elde edilebilir:
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/57164/57164eq3v2.jpg">     
Bir görüntü içinde çekilen piksel ayarlama alanı içinde bulunan ve bu ölçümler sonsuza kadar uzatmak değil gibi dönem g∞ görüntü içinde bulunan uzun menzilli uzamsal ilişkiler için hesap için bir mahsup hesabı kullanılır. İçin toplamları, moleküler büyüklükteki ω mikroskop noktası yayıldı fonksiyonu ve yarı-maksimum kayma otokorelasyon işlevinin tam genişlikte tarafından açıklanan. Araç noktaya yayılmış işlev içinde yer alan alt çözünürlük floresan boncuklar kullanılarak kalibre edilmesi.
Burada açıklanan resim korelasyon spektroskopisi için protokol, otokorelasyon ve ICS tamamlamaya yönelik matematik fonksiyonları kullanarak açık kaynak görüntüleme-işlem platformu, Fiji10, ImageJ bir dağıtım gerçekleştirilir Program11,12. Fiji/ImageJ önceden yüklenmiş hızlı Fourier dönüşümü FFT matematik işlev kullanır. Bu işlev her boyut13' te ikinin katları tarafından veri aralığını azaltarak bu hesaplanması gereken compute süreyi azaltır. 2D otokorelasyon işlev yaklaşık x, y ekseni, simetrik olduğu gibi bir tek satır profil Arsa otokorelasyon görüntü yoluyla ham otokorelasyon kayma gecikme bir fonksiyonu olarak ölçmek için kullanılabilir. Herhangi bir sıfır-lag gürültü ifade (Eq 3)ile arka plan için düzeltilmiş daha fazla hesaplama, elde edilen otokorelasyon genlik (en yüksek değer, g(0)T) ile önce kaldırılır:
<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/57164/57164eq4v2.jpg">     
nerede benb hücre hariç bir arka plan bölgeden gelen ortalama yoğunluğu olduğunu. Küme yoğunluğu veya floresan nesneleri, yoğunluğu (Eq 4)tarafından tanımlanır:
<img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/57164/57164eq5v2.jpg">    
Burada açıklanan protokolünde bir normalleştirilmiş otokorelasyon işlevi artan kayma lag ile 1.0 yaklaşan bir değere çürüme gözlem temel varsayımı ile küme yoğunluğu (CD), sade bir şekilde hesaplanması daha ayrıntılı. Maksimum kayma gecikme ile yoğunluk değerleri floresans artık herhangi bir korelasyon yoktur ve böylece bir korelasyon hesaplamalar bu bölge, daha sonra bölünür Bu yoğunluğu ile çarpılır bir yoğunluk değerini bilgisayar Meydanı 1.0 için eşit olan tanımı gereği bu yoğunluk. Böylece, küme yoğunluğu bir normalleştirilmiş otokorelasyon işlevden 1.0 önce onun karşılıklı (Eq 5)alarak normalleştirilmiş otokorelasyon işlevden çıkararak hesaplanabilir:
<img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/57164/57164eq6v2.jpg">     
Eni çevrenin daha da kalibrasyon enstrümanın noktaya yayılmış işlev alanı içinde bulunan küme sayısı quantitate için gerçekleştirilebilir. Bu kalibrasyon görüntü korelasyon spektroskopisi çözümleme sırasında kullanılan aynı optik koşullar kullanarak gerçekleştirilmelidir.

<table><tbody><tr><td>Nunc Lab-Tek II Odacıklı Kapak Camı - 8 kuyulu</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>155409</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, kalsiyum yok, magnezyum yok</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10099141</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzim (1x), fenol kırmızısı yok</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12604021</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin (10.000 U/mL)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX Takviyesi</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Keçi Anti-İnsan IgG (H+L) Çapraz Adsorbe Edilmiş İkincil Antikor, Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A11013</td><td></td></tr><tr><td>TetraSpeck Floresan Mikroküre Standartları 0.1 ve mikro; m</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T7279</td><td></td></tr><tr><td>Cetuximab</td><td>Merck Serono</td><td>3023715501</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M 38mx100mm</td><td>Merck Millipore</td><td>BRND701605</td><td></td></tr><tr><td>%16 Paraformaldehit (formaldehit) sulu çözelti</td><td>ProSciTech</td><td>C004</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant İnsan EGF</td><td>R& D Sistemi</td><td>236-EG</td><td></td></tr></tbody></table>

confocal mikroskobu ortaya hücre yüzey reseptör toplama görüntü korelasyon spektroskopisi ile

Confocal Microscopy Reveals Cell Surface Receptor Aggregation Through Image Correlation Spectroscopy

Confocal mikroskobu alt hücresel etkileşimlerin karakterizasyonu ve daha da geliştirilmesi ile floresan problar etiketli önceden klinik ajanların kritik yakalamak için erişilebilir bir yöntem sağlar. Antikor dayalı sitotoksik ilaç son gelişmeler ile dağıtım sistemleri, reseptör toplama ve içselleştirilmesi bölge içindeki Bu aracılar tarafından indüklenen değişiklikler anlama kritik öneme sahiptir. Floresan immunocytochemistry köklü metodolojisi ve ImageJ, açık kaynak FIJI dağıtım dahili otokorelasyon ve resim matematiksel işlevler kayma görüntü korelasyon gerçekleştirmek için bu iletişim kuralını güçlendirir spektroskopisi (ICS). Bu iletişim kuralı etiketli reseptörleri floresan yoğunluğu confocal mikroskop ışını alan bir fonksiyonu olarak quantitates. Bu hücre yüzeyinde niceliksel ölçüsüdür hedef molekül toplama durumunu sağlar. Bu metodoloji genişletin zamansal reseptör toplama soruşturmalar için potansiyeli statik hücrelerin karakterizasyonu odaklanmıştır. Bu protokolü de kullanan teknikleri ve görüntüleme cihazları-İhtisas kurulan hücre yüzeyde oluşan olaylar kümeleme miktar sağlamak için erişilebilir bir metodoloji sunar.

Başarılı görüntü korelasyon spektroskopisi deney tedavi denetimleri düzgün uygulama üzerinde bağlıdır. Bu tedavi grupları floresans incelenmesi yok birincil antikor ve hiçbir ikincil antikor tedavi gruplarını içerir. Kez optimum confocal lazer ayarları bir deney için kurulan örnek içinde non-spesifik floresans eksikliği onaylamak için bu denetim grupların görüntüleri yakalanması gerekir. Birçok yapisan kanser hücre hatlarında bölgeleri ICS için uygun tanımlaması düz yüzeyler eksikliği ned...

Hedef reseptörleri hücre yüzeyinde bağlanan antikorlar uyum ve küme değişikliklerini görüşmek. Bu dinamik değişiklikler ilaç geliştirme hedef hücrelerdeki karakterize konusunda da etkileri vardır. Bu iletişim kuralı confocal mikroskobu ve görüntü korelasyon spektroskopisi ile hücre yüzeyinde kümeleme reseptör kapsamını ölçmek için ImageJ/FIJI kullanır.

Confocal mikroskobu ortaya hücre yüzey reseptör toplama görüntü korelasyon spektroskopisi ile

Confocal microscopy provides an accessible methodology to capture sub-cellular interactions critical for the characterization and further development of ...

Bu görüntü korelasyon spektroskopisi protokolünün genel amacı, hücre yüzeyinde meydana gelen kümelenme olaylarının nicelleştirilmesi için erişilebilir bir metodoloji sağlamaktır. Hücre yüzeyindeki reseptörlere bağlanan antikorlar, doğrulama ve kümelenme değişiklikleri sağlayabilir. Bu dinamik süreçlerin analizleri, ilaç hedeflerinin karakterizasyonu için önemlidir.Bu tekniğin temel avantajı, kolay erişilebilir görüntüleme cihazları kullanılarak hücre yüzeyindeki kümelenme olaylarının nicelleştirilmesi için erişilebilir bir metodoloji sağlamasıdır. Başlamak için, sekiz odacıklı bir görüntüleme slaytının her bir oyuğuna 10.000 A431 epidermoid karsinom hücresi tohumlayın. Ertesi gün, EGF reseptör agregasyonunu uyarmak için hücrelere hemen mililitre EGF ligandı başına 100 nanogram ekleyin.Hücreleri sabitlemeden önce ligand ile oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Ardından, toplama sırasında kullanılan ayarlara çok dikkat ederek eşlik eden metin protokolündeki immünositokimya ve konfokal görüntü protokolünü takip edin ve elde edilen veri setlerini Fiji'ye yükleyin. Aşırı doygunluktan kaçınılmalıdır.Son görüntüler, 1 mikron kareden daha küçük piksel boyutları içermelidir. Ek olarak, a

confocal-microscopy-reveals-cell-surface-receptor-aggregation-through

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Neisseria meningitidis (Nm), gram negatif bir insana özgü solunum patojen, insan α-aktinin bağlayabilirsiniz . Burada insan beyninin mikrovasküler endotel hücreleri (HBMECs) içine bakteriyel girmesinden sonra intraselüler α-aktinin bakterinin colocalisation görselleştirilmesi için bir protokol mevcut.

Görselleştirme ve Miktar hücre içi Etkileşimleri Neisseria meningitidis</emKonfokal Görüntüleme α-aktinin> ve İnsan

Yaşayan hücrelerin plazma membranında flüoresan proteinlerin lipid sal bölümleme araştırmak için bir yöntem tarif edilmiştir. Bu lipid sallar içinde veya dışında bulunan proteinlerin difüzyon zamanlarda eşitsizlik yararlanır. Kazanım kontrol koşullarda ya da ilaç eklenmesinden sonra dinamik olarak gerçekleştirilebilir.

Lipid Raft belirlenmesi Flüoresan Korelasyon Spektroskopisi (FCS) tarafından Yaşayan hücreler içinde floresan etiketli Soruşturmasının Bölümleme

Dolayısıyla, bu işe dahil olan proteinlerin mekansal ve zamansal davranışlarını incelemek için önemli sinyal anlamak için; plazma zarının içinde ya da hücre içi konumlara ya proteinlerin kompartımanlara büyük ölçüde sinyal sonuçlarını etkileyebilecek bir düzenleyici mekanizmadır. Burada T hücrelerinde sinyal iletimi çalışmak üzere bir TIRF mikroskopi tabanlı sistemi tanımlamak, ama genel olarak uygulanabilir.

Gerçek zamanlı, TCR Eşzamanlı Görüntüleme ve İlişkili Sinyal Proteinler için TIRF Mikroskopi Tekniği

Biz tek hücrelerin üç boyutlu konfokal floresans alınan tanımsız bir şekil morfolojisi değişiklikleri ölçmek için Imaris Nörobilim, ImarisXT ve MATLAB kullanan bir yazılım platformu geliştirdi. Bu yeni yaklaşım, reseptör aktivasyonunu takiben hücre şekli değişiklikleri ölçmek için kullanılır ve bu nedenle ilaç keşfi için olası ek bir araç temsil edilebilir.

Üç boyutlu Floresans Images Hücresel Morfoloji Değişiklikleri rakamlarla Analitik Aracı

Bu videoda, HEK hücre agregasyon testi yoluyla sinaptik hücre adezyon molekülleri arasındaki hücre içi etkileşimleri ölçme tekniğini gösteriyoruz. Bu tahlilde, istenen bir presinaptik hücre adezyon molekülünü ve bir floresan proteini eksprese eden eşit sayıda HEK hücresi, bir post-sinaptik hücre adezyon molekülü ve başka bir floresan proteini eksprese eden HEK hücreleri ile karıştırılır. Hücre adezyon molekülleri arasındaki etkileşim, hücreleri floresan mikroskobu ile ölçülebilen toplanmaya...

Hücre Adezyon Molekülleri Arasındaki Trans Etkileşimleri Tespit Etmek için Hücre Agregasyon Testi

Bu video, protein homo-oligomerizasyonunu incelemek için floresan dalgalanma spektroskopisi (FFS) tekniğini göstermektedir. Bir numunedeki floresan etiketli proteinler, FFS kullanılarak protein oligomerizasyonu incelenirken bir ajan kullanılarak dimerize edilir. Konfokal bir mikroskop kullanılarak, proteinler küçük gözlem hacmine girip çıktıkça, proteinlerin oligomerik durumunu belirlemek için floresan moleküllerinin parlaklığındaki dalgalanmaların analizi yapılır.

Protein Homo-Oligomerizasyonunu İncelemek için Floresan Dalgalanma Spektroskopisi

Biz T-hücre aktivasyonu işlemi sırasında protein dinamiği içgörü sağlayan bir canlı hücre görüntüleme yöntem açıklanmaktadır. Bu kantitatif sonuçlar T-hücresi aktivasyonu boyunca kompleks oluşumu sinyalizasyon takip vermek üzere T-hücresi yayılmasını tahlilinde, konfokal mikroskopi ve görüntü analizi, kombine kullanımını göstermektedir.

T hücre gerçek zamanlı Canlı Görüntüleme Kompleks Oluşum Sinyal

Bu protokol, canlı hücrelerin yüzeyindeki tek reseptörleri görselleştirmek ve izlemek ve böylece reseptör yanal hareketliliğini, reseptör komplekslerinin boyutunu analiz etmek ve ayrıca geçici reseptör-reseptör etkileşimlerini görselleştirmek için toplam iç yansıma floresan mikroskobunun nasıl kullanılacağını açıklar. Bu protokol diğer zar proteinlerine genişletilebilir.

Tek molekül Floresan Mikroskopi Reseptör Dinamiği Yüksek çözünürlüklü Spatiotemporal Analizi

Arası hücresel iletişim içinde ve hücre dışında çeşitli fizyolojik aktiviteleri kontrol edilmesi için çok önemlidir. Bu kağıt tek hücre salgılarının uzay-zamansal yapısını ölçmek için bir protokol tanımlamaktadır. Bunu başarmak için, bir multidisipliner bir yaklaşım canlı hücre görüntüleme ile algılama etiket içermeyen nanoplasmonic entegre olan kullanılır.

Tek Hücre Salgıları uzay-zamansal Görüntüleme için bir etiket içermeyen Tekniği

Bu iletişim kuralı hücre-hücre etkileşimleri, yani proteinler hücre kavşaklar, doğrudan canlı hücreler içinde lokalize arabuluculuk proteinler arasındaki etkileşimler araştırmaya floresans dalgalanma spektroskopisi temelli bir yaklaşım açıklar. Biz aleti kalibrasyon, veri toplama ve analizi, olası yapay doku kaynaklarına düzeltmeler dahil olmak üzere ayrıntılı yönergeler sağlar.

Bir floresan dalgalanma spektroskopisi tahlil Protein-Protein etkileşimlerinin hücre-hücre kişiler

Canlı hücrelerin plazma zarında ligand bağlanması ile indüklenen mEGFP etiketli-reseptör oligomerlerinin ortalama oligomerik durumunun belirlenmesi için bir görüntüleme yaklaşımını tanımladık. Protokol, Sayı ve Parlaklık (N&amp;B) analizi ile birlikte Toplam İç Yansıma Floresan (TIRF) mikroskobuna dayanmaktadır.

Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu Ile Canlı Hücrelerdeki Hücre Yüzey Reseptörlerinin Oligomerizasyon Dinamiği Sayı ve Parlaklık Analizi ile Birlikte

Öğrenin hücre yüzeyi reseptör kümelerini konfokal mikroskopi ve görüntü korelasyon spektroskopisi ile nicelendirmeyi. Bu yöntem ilaç hedefi araştırmalarında reseptör dinamiklerini anlamak için kritik öneme sahiptir.

Confocal mikroskobu ortaya hücre yüzey reseptör toplama görüntü korelasyon spektroskopisi ile

Daha fazla video keşfet