Name: Kimyasal amputasyon ve yeniden oluşturulmasını Planarian Schmidtea mediterranea yutak (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-26T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 14 s
Description: Öğrenin, Schmidtea mediterranea'da sodyum azit kullanarak yutak amputasyonu ve rejenerasyonunu inceleyin. Bu hassas yöntem, kök hücrelerin organ kaybına nasıl yanıt verdiğini araştırır ve doku yenilenmesi mekanizmalarını anlamaya katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Alejandro Sánchez Alvarado, ilk iyileştirme ve geliştirme bu tekniğin desteklenen teşekkür etmek istiyorum. Carolyn Adler'in laboratuvar çalışmalarında Cornell Üniversitesi başlangıç fonlar tarafından desteklenir.

1. hazırlık
<ol><li>
Planarialar su hazırlanması 17<ol>
<li>Planarians 1 X Montjuïc tuz solüsyonu içinde korumak. Planarian su hazırlamak için bireysel hisse senedi 1 M CaCl2, 1 M MgSO4, 1 M MgCl2, 1 M KCl ve çözümleri ultrasaf su içinde 5 M NaCl olun. Filtre-0.2 µm şişe-üst filterfor uzun süreli depolama ile sterilize. Not: Montjuïc tuzları hazırlamak için sadece ultrasaf deiyonize su (bir direnci 18,2 MΩ 25 ° c) kullanın.</li>
		<li>5 X tuz solüsyonu 1 L stokunun hazırlamak için 1 M CaCl2, 1 M MgSO4, MgCl2, 0.5 mL KCl ve 5 M NaCl çözümleri 900 mL ultrasaf su 1.6 mL 0.5 mL 5 mL 5 mL birleştirir. Bu çözüm için NaHCO3 0,504 g ekleyin ve karışımı ilave edin. PH hidroklorik asit ile 7.0 için ayarlayın.</li>
		<li>Bu 5 X 1 X çalışma konsantrasyonu ultrasaf su geniş kapasite damacana gibi steril bir kap içinde hisse senedi çözüm seyreltik ( Tablo reçetesigörmek). Bu 1 X çözüm eşeysiz planarians korumak için kullanın. Not: Montjuïc tuz solüsyonu alternatif, yerel olarak satın alınan kaynak suyu veya ultrasaf su piyasada akvaryum tuz içeren kullanın (bkz. Tablo malzeme) bir konsantrasyon of0.5 g/L18karıştırın.</li>
		<li>Statik kültür19bakteriyel enfeksiyonu önlemek için bir antibiyotik içeren suda planarians korumak. 50 mg/mL stok çözüm gentamisin sülfat ultrasaf su hazırlamak ve filtre sterilize. Nerede hayvanlar korunur kaplarına gentamisin sülfat 50 µg/mL (1: 1000 seyreltme) son bir konsantrasyon için ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Karaciğer Yapıştır hazırlanması
	<ol>
<li>Planarians organik bir diyete gelişmek gibi çim beslenen sığır eti karaciğer, satın alma taze karaciğer ve işlemi 24 h içinde kaldırmak yavaşça soyulmuştu tarafından karaciğer Kapsüllenen zar kapsül. Karaciğer ~ 1 cm küpler halinde kesilmiş ve kapalı kazımak ve tüm hepatik damarları ve arterler atmak için bir bıçak kullanın.</li>
		<li>Karaciğer adet gıda fabrikası veya mutfak robotu kullanarak macerate ve sonra bir tel kafes gıda süzgeç aracılığıyla geçer. Hamur işi çanta birleştirmek ve şırınga veya 35 mm Petri yemekler dağıtmak. Besleme önce yavaşça hava kabarcıkları kaldırmak için santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>Aliquots karaciğer için-80 ° c en çok bir yıl ve kullanmadan önce tezcan saklayın. Çözdürme sonra artık herhangi bir karaciğer bir kez yeniden dondurma veya en fazla 24 saat için 4 ° C'de depolayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Hayvan bakım
	<ol>
<li>Planarians büyüyecek ve çeşitli boyutlarda bağlı olarak besleme frekans daraltmak. Planarians her hafta (14 günde bir kez) besleme. Uzun vadeli toplu kültürler, irili ufaklı ( Tablo malzemelerigörmek) plastik kaplar kullanın.</li>
		<li>Hayvanları beslemek için bir metal spatula veya plastik transfer damlalıklı bir kutu içinde bir bezelye büyüklüğünde damla karaciğer eklemenizi sağlar. Hayvanlar kutusunu temizlemeden önce 1-2 h. Kaldır kalan yemek yemek izin.</li>
		<li>Beslenen değilse temiz worms (besleme hemen sonra bir kez ve bir kez iki gün sonra) beslenen Eğer haftada iki kez veya haftada bir kez. Temizlemek için bir plastik kabı dikkatle planarians kutusunda koruyarak suyu dökerek su tahliye. Kutusunu yüzey kağıt havlu ile silin, sonra kutunun temiz olana her tarafta tekrarlayın.</li>
		<li>Su (yaklaşık ¾ kutusu birimi için) eski yerine koymak ve gentamisin 50 µg/mL nihai bir konsantrasyon için ekleyin. Hayvanlar karanlık bir dolap ya da 20 ° C kuluçka saklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Solucanlar yelpazesi
	<ol>
<li>5-7 gün önceden beslenen edildi solucanlar seçin. Not: Bu pharynges son zamanlarda (1-2 gün kala amputasyon) beslenen solucanlar dan kesmek önemli ölçüde daha zordur. Beslenen hayvanlar da sodyum azid için daha duyarlıdır.</li>
		<li>Aşağı yukarı 6 mm uzunluğunda olan solucanlar seçin. Solucan boyutunu tahmin etmek için bir plastik transfer pipet kullanarak bir Petri kabına aktarın. Düz 6 - inç cetvel veya 5 x 5 mm grafik kağıdı altında Petri kabına yerleştirin ve o tarar iken solucan uzunluğu ölçmek. Not: Solucanlar uzunluğu 6 mm daha küçük kesmek daha zordur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sodyum azid hazırlanması
	<ol>
<li>Sodyum azid toz planarialar suda çözülerek 100 mM çözüm hazırlamak. Uyarı: Sodyum azid toksik ve dikkatle ele alınmalıdır. Sodyum azid boşa atmayın. Aşağıdaki kullanmak, bunları ayrı ayrı olarak tehlikeli atık bertarafı için toplar.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. yutak amputasyon
<ol><li>Yer bir 35-mm çap Petri kabına solucanlar. Dikkatle tüm planarian su yemek plastik transfer damlalıklı kullanarak kaldırın. Not: En fazla 20 6 mm solucanlar konforlu bu büyüklükte bir tabak içinde yerleştirilebilir.</li>
	<li>Mikroskop altında tabak yerleştirin ve birden fazla kurt-ebilmek var olmak görüş aynı anda büyütme ayarlayın (örneğin 10 X büyütme). Planarian su 100 mM sodyum azid çözüm ile değiştirin. Not: Bir 35-mm Petri için yaklaşık 5 mL sodyum azid de yeterlidir. Çözüm tamamen planarians daldırın. Çözüm cilt daha büyük yemekler için gerektiği gibi ayarlayın.</li>
	<li>Mikroskop ve yemek için ilk 3-4 dk taşıma kaçının altında hayvanlar izlemek.</li>
	<li>Yutak ekstrüzyon ile mikroskop gözlemlemek; yutak faringeal kese çıkıntı ve tam olarak uzatmak (yaklaşık 1 mm uzunluğunda) şekil 1Badımında gösterildiği gibi. Not: Yutak tamamen devam etmeden önce uzanan işlemini tamamlayana kadar bekleyin önemlidir. Bir kez yutak hayvandan ortaya çıkıyor, tam çekiş kabaca 1 dk alır.</li>
	<li>Bir plastik transfer damlalıklı hayvanlar çanak çevresinde bücür için kullanın. Hayvanlar damlalıklı emmek ve birkaç kez amacına zorla bırakın. Yutak tamamen uzun, bu güçlü pipetting ayırmak için neden olur.</li>
	<li>Alternatif olarak, yutak, uzunluğu boyunca dikey veya yatay olarak iyi forseps ( Tablo malzemelerigörmek) bir çift kullanarak onun çevresi boyunca şekil 1 ciçinde gösterildiği gibi kavramak. Forseps sıkışmak yutak ile hayvan Menisküs yukarı doğru kaldırın. Hayvan ortaya çıkar, yüzey gerilimi hayvandan ayırmak yutak sebep olacaktır. Not: Bu yöntem, nerede güçlü dönen yeterli değil daha küçük hayvanlar (1-3 mm uzunluğunda) pharynges kaldırmak için kullanılabilir. Alay ya da başka türlü hayvan bedeni yaralanmasına kaçının.</li>
	<li>Bir aktarım damlalıklı kullanarak, uzvunu hayvanlar taze planarialar su içeren yeni bir tabak için taşıyın.</li>
	<li>Bir kez transfer, durulama iyice planarialar su tamamen üç kere su alışverişi, hayvanlarda kesilmiş. Planarialar su 50µg/mL gentamisin ile içeren yeni bir tabak aktarın. Not: Tam arabellek değişimi bu üç yıkama sırasında sodyum azid kaldırılmasını sağlamak için önemlidir.</li>
	<li>Ertesi gün, çanak suda gentamisin 50 µg/mL içeren taze planarialar su ile değiştirin. Bundan sonra her gün tekrarlayın.</li>
</ol>3. yutak kaldırıldıktan sonra amputasyon değerlendirilmesi
<ol><li>Şekil 2Agösterildiği gibi karanlık bir nokta yutak, başarılı kaldırıldıktan sonra ortaya çıkmıştır olup olmadığını belirlemek için hayvanlar (10-20 X büyütme ile) mikroskop altında incelemek.</li>
	<li>Alternatif olarak, tamir ve hayvanlar Pearson ve ark. tarafından açıklanan protokolüne göre çamaşır suyu 20. emmek hayvan gecede 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) veya fluorescently Birleşik streptavidin (1 mg/mL sulandırılmış 1:500 1 X %0,3 içeren fosfat Buffered Saline Triton-X). Hayvanlar % 80 glycerol/20% 1 X fosfat Buffered serum ve floresan stereomicroscope (şekil 2B) altında görüntü içindeki slaytları bağlama. Not: Tüm görüntüleri bu el yazması bir floresan stereomicroscope 1.0 X amacı ile ele geçirildi.</li>
</ol>4. yutak rejenerasyon davranış besleme ölçme tarafından değerlendirilmesi
<ol><li>
Karaciğer hazırlanması
	<ol>
<li>Karaciğer hamur gerekli miktar bir microcentrifuge veya konik tüp aktarın. Kısaca hava kabarcıkları kaldırmak için spin. Karaciğer hacmi tahmin ve sonra 1/5 hacminin ve kırmızı gıda boyası toplam hacminin % 2 planarialar su ekleyin. Örneğin, 1000 µL karaciğer yapıştırın, 200 µL planarialar su ve gıda renklendirme 24 µL ekleyin.</li>
		<li>Gıda renklendirme eşit olarak karaciğer Yapıştır dağıtılır kadar iyice karıştırın bir plastik havaneli, pipet ucu veya metal spatula kullanarak. Tekrar kısaca spin. Karaciğer Yapıştır 24 h için 4 ° C'de depolanan veya uzun süreli depolama için-80 ° C'de aliquots donup kalan ev.</li>
		<li>En çok 25 hayvanlar sınama olumlu sonuçlanırsa, 25 µL çanak (yaklaşık 1 µL hayvan başına karaciğer hamur) başı karaciğer hamur hazırlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Hayvan besleme
	<ol>
<li>Yedi gün sonra kimyasal amputasyon, hayvanlar için yeni Petri kabına aktarın. 10-15 hayvan sınama olumlu sonuçlanırsa, bir 35 mm tabak kullanın; 15'den fazla hayvan-meli var olmak sınav 60 mm kabında. Hayvanlar, besleme önce yaklaşık 1 h için bozulmamış anlatmamanı.</li>
		<li>Makas kullanarak, kabaca ½ cm uzakta-in dar ucuna çıkararak P200 pipet ucu genişliğini artırın. Damlalıklı 25 µL çanak içine kırmızı karaciğer yapıştırın. Not: Son kırpma viskoz karaciğer Yapıştır daha kolay pipetting sağlar. Karaciğer yüzeyinde yüzen önlemek için dağıtımı sırasında ucuna çanak dibine kadar dokunma.</li>
		<li>Hayvanlar için 30 dk beslemek izin.</li>
		<li>Hayvanlar beyaz bir arka plan üzerine yerleştirerek veya onları 10-20 X büyütme ile mikroskop altında incelenmesi tarafından yemiş hayvan sayısı puanı.</li>
		<li>Besleme sonra karaciğer yemek çıkarın ve temizleyin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Tanaka, E. M., Reddien, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+basis+for+animal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">The cellular basis for animal regeneration.</a> Dev. Cell. 21, 172-185 (2011).</li>
<li>Tanaka, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Molecular+and+Cellular+Choreography+of+Appendage+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Molecular and Cellular Choreography of Appendage Regeneration.</a> Cell. 165, 1598-1608 (2016).</li>
<li>Curado, S., Stainier, D. Y. R., Anderson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitroreductase-mediated+cell%2Ftissue+ablation+in+zebrafish%3A+a+spatially+and+temporally+controlled+ablation+method+with+applications+in+developmental+and+regeneration+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies.</a> Nat. Protoc. 3, 948-954 (2008).</li>
<li>White, D. T., Mumm, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nitroreductase+system+of+inducible+targeted+ablation+facilitates+cell-specific+regenerative+studies+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The nitroreductase system of inducible targeted ablation facilitates cell-specific regenerative studies in zebrafish.</a> Methods. 62, 232-240 (2013).</li>
<li>Smith-Bolton, R. K., Worley, M. I., Kanda, H., Hariharan, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+growth+in+Drosophila+imaginal+discs+is+regulated+by+Wingless+and+Myc%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Regenerative growth in Drosophila imaginal discs is regulated by Wingless and Myc.</a> Dev. Cell. 16, 797-809 (2009).</li>
<li>Smith-Bolton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Imaginal+Discs+as+a+Model+of+Epithelial+Wound+Repair+and+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Wound+Care%22%5BJournal%5D)">Drosophila Imaginal Discs as a Model of Epithelial Wound Repair and Regeneration.</a> Adv. Wound Care. 5, 251-261 (2016).</li>
<li>Newmark, P. A., Sánchez Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Not+your+father%27s+planarian%3A+a+classic+model+enters+the+era+of+functional+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Not your father's planarian: a classic model enters the era of functional genomics.</a> Nat. Rev. Genet. 3, 210-219 (2002).</li>
<li>Reddien, P. W., Sánchez Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamentals+of+planarian+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fundamentals of planarian regeneration.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 20, 725-757 (2004).</li>
<li>Wagner, D. E., Wang, I. E., Reddien, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonogenic+neoblasts+are+pluripotent+adult+stem+cells+that+underlie+planarian+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Clonogenic neoblasts are pluripotent adult stem cells that underlie planarian regeneration.</a> Science. 332, 811-816 (2011).</li>
<li>Scimone, M. L., Kravarik, K. M., Lapan, S. W., Reddien, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neoblast+specialization+in+regeneration+of+the+planarian+Schmidtea+mediterranea%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Neoblast specialization in regeneration of the planarian Schmidtea mediterranea.</a> Stem Cell Reports. 3, 339-352 (2014).</li>
<li>van Wolfswinkel, J. C., Wagner, D. E., Reddien, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+reveals+functionally+distinct+classes+within+the+planarian+stem+cell+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis reveals functionally distinct classes within the planarian stem cell compartment.</a> Cell Stem Cell. 15, 326-339 (2014).</li>
<li>Adler, C. E., Seidel, C. W., McKinney, S. A., Sánchez Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+amputation+of+the+pharynx+identifies+a+FoxA-dependent+regeneration+program+in+planaria%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Selective amputation of the pharynx identifies a FoxA-dependent regeneration program in planaria.</a> Elife. 3, e02238(2014).</li>
<li>Adler, C. E., Sánchez Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PHRED-1+is+a+divergent+neurexin-1+homolog+that+organizes+muscle+fibers+and+patterns+organs+during+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">PHRED-1 is a divergent neurexin-1 homolog that organizes muscle fibers and patterns organs during regeneration.</a> Dev. Biol. 427, 165-175 (2017).</li>
<li>Wong, M. C., Martynovsky, M., Schwarzbauer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+cell+migration+using+Caenorhabditis+elegans+as+a+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of cell migration using Caenorhabditis elegans as a model system.</a> Methods Mol. Biol. 769, 233-247 (2011).</li>
<li>Margie, O., Palmer, C., Chin-Sang, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C+elegans+chemotaxis+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">C elegans chemotaxis assay.</a> J. Vis. Exp. , e50069(2013).</li>
<li>Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D. T., Bargmann, C. I., Avery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+microsurgery+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Laser microsurgery in Caenorhabditis elegans.</a> Methods Cell Biol. 107, 177(2012).</li>
<li>Tasaki, J., Uchiyama-Tasaki, C., Rouhana, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Stem+Cell+Motility+In+Vivo+Based+on+Immunodetection+of+Planarian+Neoblasts+and+Tracing+of+BrdU-Labeled+Cells+After+Partial+Irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of Stem Cell Motility In Vivo Based on Immunodetection of Planarian Neoblasts and Tracing of BrdU-Labeled Cells After Partial Irradiation.</a> Methods Mol. Biol. 1365, 323-338 (2016).</li>
<li>Roberts-Galbraith, R. H., Brubacher, J. L., Newmark, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+genomics+screen+in+planarians+reveals+regulators+of+whole-brain+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">A functional genomics screen in planarians reveals regulators of whole-brain regeneration.</a> Elife. 5, (2016).</li>
<li>Arnold, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenic+shifts+in+endogenous+microbiota+impede+tissue+regeneration+via+distinct+activation+of+TAK1%2FMKK%2Fp38%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Pathogenic shifts in endogenous microbiota impede tissue regeneration via distinct activation of TAK1/MKK/p38.</a> Elife. 5, (2016).</li>
<li>Pearson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formaldehyde-based+whole-mount+in+situ+hybridization+method+for+planarians%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Formaldehyde-based whole-mount in situ hybridization method for planarians.</a> Dev. Dyn. 238, 443-450 (2009).</li>
<li>LoCascio, S. A., Lapan, S. W., Reddien, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eye+Absence+Does+Not+Regulate+Planarian+Stem+Cells+during+Eye+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Eye Absence Does Not Regulate Planarian Stem Cells during Eye Regeneration.</a> Dev. Cell. 40, 381-391 (2017).</li>
<li>Nishimura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+dopaminergic+neurons+after+6-hydroxydopamine-induced+lesion+in+planarian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Regeneration of dopaminergic neurons after 6-hydroxydopamine-induced lesion in planarian brain.</a> J. Neurochem. 119, 1217-1231 (2011).</li>
<li>Wilson, D. F., Chance, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Azide+inhibition+of+mitochondrial+electron+transport.+I.+The+aerobic+steady+state+of+succinate+oxidation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Azide inhibition of mitochondrial electron transport. I. The aerobic steady state of succinate oxidation.</a> Biochim. Biophys. Acta. 131, 421-430 (1967).</li>
<li>Duncan, H. M., Mackler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+Transport+Systems+of+Yeast%3A+III.+Preparation+and+properties+of+cytochrome+oxidase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Electron Transport Systems of Yeast: III. Preparation and properties of cytochrome oxidase.</a> J. Biol. Chem. 241, 1694-1697 (1966).</li>
<li>Buchan, J. R., Yoon, J. H., Parker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress-specific+composition%2C+assembly+and+kinetics+of+stress+granules+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Stress-specific composition, assembly and kinetics of stress granules in Saccharomyces cerevisiae.</a> J. Cell Sci. 124, 228-239 (2011).</li>
<li>Cebrià, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+the+nervous+system+in+the+model+planarian+Schmidtea+mediterranea%3A+An+immunocytochemical+study%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Organization of the nervous system in the model planarian Schmidtea mediterranea: An immunocytochemical study.</a> Neurosci. Res. 61, 375-384 (2008).</li>
<li>Shimoyama, S., Inoue, T., Kashima, M., Agata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+Neuropeptide-Coding+Genes+Involved+in+Planarian+Pharynx+Extension%5BTitle%5D)+AND+%22Zoolog.+Sci%22%5BJournal%5D)">Multiple Neuropeptide-Coding Genes Involved in Planarian Pharynx Extension.</a> Zoolog. Sci. 33, 311-319 (2016).</li>
<li>Ito, H., Saito, Y., Watanabe, K., Orii, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epimorphic+regeneration+of+the+distal+part+of+the+planarian+pharynx%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">Epimorphic regeneration of the distal part of the planarian pharynx.</a> Dev. Genes Evol. 211, 2-9 (2001).</li>
<li>Bueno, D., Espinosa, L., Baguñà, J., Romero, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Planarian+pharynx+regeneration+in++tail+fragments+monitored+with+cell-specific+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">Planarian pharynx regeneration in tail fragments monitored with cell-specific monoclonal antibodies.</a> Dev. Genes Evol. 206, 425-434 (1997).</li>
<li>Hyman, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHyman%2C+L+%22The+invertebrates%3A+Platyhelminthes+and+Rhynchocoela%2C+the+acoelomate+Bilateria%22">The invertebrates: Platyhelminthes and Rhynchocoela, the acoelomate Bilateria</a>. , McGraw-Hill. (1951).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu iletişim kuralı sodyum azid kullanarak yutak seçici ablasyon yöntemi açıklar. Planarians diğer hedeflenen ablasyon çalışmaları değiştirilmiş ameliyat photoreceptors21 veya farmakolojik tedavi dopaminerjik nöron22ablate kaldırmak için kullandık. Bir önemli mevcut yöntemler üzerinde kimyasal amputasyon cerrahisi gerektirmez avantajdır. Planarian vücut diğerleri ile karşılaştırıldığında farklıdır yutak katı yapısını çok daha yumuşak gövdeli hayvan onun tümüyle kaldırılmasın...

Rejenerasyon hayvanlar alemi tam vücut yenilenme içinde bazı omurgasızlar omurgalıların1daha sınırlı yetenekleri için arasında değişen rejeneratif kapasiteleri ile ortaya çıkan bir olgudur. Yedek fonksiyonel dokuların karmaşık bir süreçtir ve genellikle birden çok hücre tiplerinin eşzamanlı restorasyon üzerine kuruludur. Örneğin, semender uzuv, dokusunu, kondrosit, nöronlar, kas ve epitel hücreleri gerek yeniden oluşturmak için2yerini aldı. Bu yeni oluşturulan hücre tipleri de düzgün yeni bacak işlevini kolaylaştırmak için organize olmak gerekir. Bu karmaşık süreçleri anlamak belirli hücre tipleri ve organları kendi entegrasyon rejenerasyon odaklanmak teknikler gerektirir.
Rejeneratif yanıt-e doğru çalışma kolaylaştırmak için istihdam stratejileri ya belirli hücre tiplerinin hedeflenen ablasyon veya dokuların daha büyük Koleksiyonlar biridir. Örneğin, Zebra balığı, Metronidazol3,4uygulamadan sonra imha edilmesini ifade belirli hücre tipleri içinde nitroreductase yol açar. Drosophila larva pro-apoptotik genler doku özel Organizatör altında ifade seçerek özel bölgeler Imaginal disk5,6ablate. Bu stratejileri her ikisi de hızlı ama kontrollü zarar ve moleküler ve hücresel yenilenme için sorumlu mekanizmaları incelemek için kullanılır.
Bu makale, seçmeli olarak tüm organ yutak planarian Schmidtea mediterraneaadlı ablate için bir yöntemi açıklanmaktadır. Planarians nerede bile dakika parçaları bütün hayvanlar 7,8regrow rejenerasyon, üretken rejeneratif yeteneklerini bilinen klasik bir model vardır. Kök hücreler pluripotent hücreler ve soy tarafından kısıtlanmış ataları9,10,11oluşan büyük, türdeş olmayan nüfusu var. Bu hücreler çoğalırlar ve yutak, gergin, sindirim ve boşaltım sistemleri ve kas ve epitel hücreleri9,10,12de dahil olmak üzere tüm eksik dokular yerine ayırt etmek. Bu kök hücre yenilenme başlatmak biliyoruz iken, biz tam olarak onları tüm bu farklı hücre türleri yerine götürmek moleküler mekanizmaları kavramak değil. Kesin kök hücre yanıt-e doğru çıkarmak tanımlanan yaralama yöntemleri bu karmaşık süreci belirginleştiren yardımcı olabilir.
Yutak beslenmesi için gerekli bir büyük, silindirik tüp ve nöronlar, kas, epitelyal ve salgı hücreleri13,29içerir. Normalde hayvan ventral tarafta bir kese içinde gizli, hayvanın tek vücut yiyecek varlığı algılama üzerine açılış ile uzanır. Seçmeli olarak yutak kesmek için bir kimyasal denilen sodyum azid, yaygın olarak kullanılan bir anestezi C. elegans14,15,16planarians emmek. Planarians kullanımı ilk Adler ve arktarafından bildirildi., 201412. Sodyum azid maruz dakikada planarians onların pharynges bükün ve nazik ajitasyon ile yutak hayvandan ayırır. Biz bu yutak tam ve seçici kaybına yol "kimyasal amputasyon" bakın. Bir hafta sonra amputasyon, tamamen işlevsel bir yutak geri yüklenen12olur. Yutak beslenmesi için gerekli olduğundan, fonksiyonel rejenerasyon beslenme davranışı izleyerek ölçülebilir. Aşağıda, protokolü için kimyasal amputasyon ve yutak yenileme ve restorasyon davranış beslenme değerlendirmek açıklar.

<table><tbody><tr><td>Kalsiyum Klorür Dihidrat (CaCl2)</td> <td>Fisher Kimyasal</td><td>C79-3</td><td>Montju&iuml; c tuz çözeltisi</td></tr><tr><td>Magnezyum Sülfat Susuz (MgSO4)</td> <td>Fisher Chemical</td><td>M65-3</td><td>Montju&iuml; c tuz çözeltisi</td></tr><tr><td>Magnezyum Klorür Hekzahidrat (MgCl2)</td> <td>Acros / VWR</td><td>41341-5000</td><td>Montju&iuml; c tuz çözeltisi</td></tr><tr><td>Potasyum Klorür (KCl)</td><td>Acros Organics/VWR</td><td>196770010</td><td>Montju&iuml; c tuz çözeltisi</td></tr><tr><td>Sodyum Klorür (NaCl)</td> <td>Acros Organics / VWR</td><td>207790050</td><td>Montju&iuml; c tuz çözeltisi</td></tr><tr><td>Sodyum Bikarbonat (NaHCO3)</td> <td>Acros Organics / VWR</td><td>123360010</td><td>Montju&iuml; c tuz çözeltisi</td></tr><tr><td>Nalgene otoklavlanabilir polipropilen kopolimer lowboy ile tıkaç</td><td>ThermoFisher Scientific / VWR</td><td>2324-0015</td><td>Planarya suyunun depolanması</td></tr><tr><td>Anında Okyanus Deniz Tuzu</td><td>Spektrumu Markaları</td><td>Amazon</td><td>Planaria suyu</td></tr><tr><td>Gentamisin Sülfat</td><td>İkizler Biyo-ürünler</td><td>400-100P</td><td>Planaria su</td></tr><tr><td>Jiletleri</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>71970</td><td>Kıyma karaciğer&nbsp;</td></tr><tr><td>Tek kullanımlık pasta poşetleri-16", 12 paket</td><td>Wilton</td><td>Amazon</td><td>Karaciğer alikotları</td></tr><tr><td>5 mL şırınga</td><td>BD/VWR</td><td>309647</td><td>Karaciğer alikotları</td></tr><tr><td>Petri kapları-35mm/60mm</td><td>Greiner Bio-One/VWR</td><td>82050-536/82050-544</td><td></td></tr><tr><td>Plastik kaplar (çeşitli boyutlarda)</td>Statik kültürde <td>Ziploc</td><td>Amazon</td><td>Konut planaryaları</td></tr><tr><td>Sodyum Azide</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Transfer Pipeti</td><td>Globe Scientific</td><td>138030</td><td></td></tr><tr><td>Forseps - Dumont Cımbız, Stil 5 Elektron</td><td>Mikroskobu Bilimleri&nbsp;</td><td>72700-D (0203-5-PO)</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>DAPI&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>62247</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin, Alexa Fluor 488 konjuge</td><td>ThermoFisher</td><td>S11223</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Fisher BiyoReaktifleri</td><td>BP229-1</td><td></td></tr></tbody></table>

kimyasal amputasyon ve yeniden oluşturulmasını planarian schmidtea mediterranea yutak

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

Planarians yeniden oluşturma işlemi son derece verimli solucanlar vardır. Bu yeteneği hızla herhangi bir yaralanma türüne yanıt verebilir kök hücreler çok sayıda borçlular. Bu hayvanların ortak yaralanma modellerinde birden çok organları zarar doku büyük miktarda kaldırın. Bu geniş doku hasarı üstesinden gelmek için burada seçerek tek bir organ, yutak, planarian Schmidtea mediterraneakaldırmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu sitokrom oksidaz inhibitörü sodyum azid içeren bir çözümde iliklerine hayvanlar tarafından elde etmek. Sodyum azid kısa maruz kalma "kimyasal amputasyon." dediğimiz hayvan yutak ekstrüzyon neden olur Kimyasal amputasyon tüm yutak kaldırır ve nerede yutak bağırsak için verdiği küçük bir yara oluşturur. Geniş durulama sonra tüm uzvunu hayvanların yaklaşık bir hafta içinde tamamen işlevsel bir yutak yeniden. Vücudun geri kalanıyla kök hücre yenilenme yeni yutak sürücü. Burada, bir ayrıntılı sağlamak protokol için kimyasal amputasyon ve başarılı amputasyon ve rejenerasyon değerlendirmek için histolojik ve davranış yöntemleri açıklanmaktadır.

Sodyum azid maruz planarians, esneme ve kıvranmak hayvanlar neden normal hareketliliğini bozar. Bu hareketler yutak hayvan ventral taraftan çıkmaya zorlamak ve sodyum azid çözümünde yaklaşık 6 dakika sonra-ebilmek var olmak seen yutak beyaz ucu (şekil 1B-sol kapı aynası). Birkaç dakika sonra hayvanlar aktif olarak sözleşme ve tamamen yutak zorla vücut dışına iterek genişletir. (Şekil 1B-orta Masası)</stro...

Planarian Schmidtea mediterranea kök hücre ve doku rejenerasyonu çalışmak için mükemmel bir modeldir. Bu yayın seçerek bir organ, yutak, kimyasal sodyum azid hayvanlara açarak kaldırın yöntemi açıklanır. Bu iletişim kuralı Ayrıca yutak rejenerasyon izlemek için yöntem açıklar.

Kimyasal amputasyon ve yeniden oluşturulmasını Planarian Schmidtea mediterranea yutak

Planarians are flatworms that are extremely efficient at regeneration. They owe this ability to a large number of stem cells that can rapidly respond to ...

Bu amputasyon prosedürünün genel amacı, diğer organlara zarar vermeden farenksi planaryalardan seçici ve tamamen çıkarmaktır. Bu yöntem, rejenerasyon alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Kök hücrelerin eksik organları nasıl tanıdığı ve yenilenmelerini nasıl başlattığı gibi.Bu tekniğin en büyük avantajı çok hassas olması ve işlem sırasında diğer organların zarar görmemesidir. Bu yöntem için ilk olarak planaryaları sodyum azid ile uyuştururken aklıma geldi. Sodyum azide maruz kalmanın farenksin dışarı çıkmasına neden olduğunu fark ettim.Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir, çünkü amputasyon, hayvanların uygun şekilde seçilmesinin yanı sıra hayvan hareketi ve morfolojisinin dikkatli bir şekilde gözlemlenmesini gerektirir. Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan yüksek lisans öğrencisi Divya Shiroor olacak. Prosedüre başlamadan önce, beş ila yedi gün önce temiz bir petri kabına beslenen solucanları seçmek için plastik bir transfer pipeti kullanın.Her bir planaryanın çanak boyunca sürünürken en az 6 milimetre uzunluğunda olduğunu doğrulamak için petri kabının altına düz bir cetvel yerleştirin. Daha sonra seçilen 20 adede kadar solucanı 35 milime

chemical-amputation-regeneration-pharynx-planarian-schmidtea

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

, Canlı hayvan içinde kök hücre farklılaşması çalışmak için cazip bir model planarian flatworm. Yenileme, temel laboratuvar kolayca yapılır basit amputasyon deneyleri ile çalışılmış ve farmakolojik ve genetik...

Farmakolojik ve Fonksiyonel Genetik Tahliller Planarian Rejenerasyon işleyin<emJaponica> Dugesia</em

Planaria arasında tanımlanmış ve tutarlı bir büyüklükte doku aşılama için etkili bir yöntem tarif edilmiştir. Ayrıca nakli için kullanılan immobilizasyon tekniği canlı hayvanların kısmi ışınlanması için kurşun kalkanlar, ile birlikte, nasıl uyarlanabileceğini bir açıklama dahildir.

Planarian İmmobilizasyon, Kısmi Işınlama, ve Doku Nakli

Burada, bir model cnidarian anthozoan olan Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis'te rejenerasyonun nasıl indükleneceğini ve izleneceğini gösteriyoruz.  Morfolojik bir evreleme sistemi kullanarak rejenerasyonun nasıl ampute edileceğini ve kategorize edileceğini gösteriyoruz ve bu sistemi polip yapılarının yenilenmesinde otofaji gereksinimini ortaya çıkarmak için kullanıyoruz.

Starlet Deniz Anemone Aboral physa Tam Polip Regeneration uyaran Nematostella vectensis

Bu protokol sürekli çevredeki dokulara bozmadan planarian gözleri (optik bardak) çıkarılması için nasıl gösterir. ya bir ensülin iğne ve şırınga kullanılarak, ya da her iki gözü göz rejenerasyon, görsel yenilenme evrimi, ve ışık kaynaklı bir davranışın temel düzenleyici mekanizmalarının soruşturma kolaylaştırmak için kesilip edilebilir.

Cerrahi Ablasyon Tahlili Planaryalar Göz Rejenerasyon incelenmesi için

Burada, meme blastema oluşumu ve Intramembranous ossifikasyon araştırmak için yetişkin fare terminali falanks amputasyon bir protokol sunuyoruz, floresan immünhistokimya ve sıralı in-vivo MİKROBİLGİSAYARLI tomografi ile analiz.

Yetişkin fare basamak amputasyon ve rejenerasyonu: Mammalin Blastema oluşumu ve Intramembranous ossifikasyon araştırmak için basit bir model

Tatlı su planarians üç yürüyüş sergiler (kayma, peristalsis, ve scrunching) kantitatif davranış analizi ile ayırt edilebilir. Çeşitli zararlı uyaranlar, bunların nicelliği ve peristalsis ve süzülme ayrımı kullanılarak scrunching'i tetikleyen bir yöntem tanımladık. Gen nakavtını kullanarak, kantitatif henotipik okuma olarak scrunching özgüllüğünü gösteririz.

Zararlı Uyaranlar Algılama için Nicel Davranışsal Okuma olarak Planarian Scrunching

Bu çalışmanın amacı, Ambystoma mexicanum'da mandibulanın tam enine amputasyonu için güvenli ve tekrarlanabilir bir cerrahi yaklaşımı standartlaştırmaktı; böylece kraniofasiyal doku yenilenmesi incelendi.

Ambystoma Mexicanum Modelinde kraniofasiyal doku yenilenmesinin incelenmesi için mandibular yaralanma modelinin tasarımı ve standartlaştırılması

Bu protokol, mantar enfeksiyonu sırasında konak-patojen etkileşimlerini incelemek için planarial Schmidtea akdeniz deniz sistemini model sistem olarak kullanmak için optimize edilmiş ve ayrıntılı bir rehber sunar. Yöntem, insan mantar patojeni Candida albicans ile planarian hayvanları enfekte etme prosedürünün üzerine inşa edilerek, tekrarlanabilirliği ve deneysel tutarlılığı artırmak için ayrıntılı rehberlik sağlar.

Schmidtea Akdeniz'de Candida albicans enfeksiyonu için Mantar Patogenezi ve Konak Savunmasını Araştırmak İçin Optimize Edilmiş Bir Protokol

Germ hattı toksisitesini değerlendirmek için kullanılan nematod Caenorhabditis elegans'ta yüksek verimli bir kimyasal testin ayrıntılı adımlarını açıklıyoruz. Bu tahlilde, kimyasal maruziyeti takiben germ hattı fonksiyonunun bozulması, anöploid embriyolara özgü bir floresan raportör kullanılarak izlenir.

Nematod kullanma Germline Kimyasal zehirlilik Kapsamlı Değerlendirme<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Drosophila kan hücreleri veya hemositler, yerleşik bölgeler ve dolaşım arasında döngü yapar.  Larvada, yerleşik (sapsız) hemositler indüktif mikro ortamlara, Hematopoetik Ceplere lokalize olurken, dolaşımdaki hemositler hemolenf içinde serbestçe hareket eder. Bu protokolün amacı, davranışsal olarak farklı ancak birbirini değiştiren bu iki hemosit popülasyonunun standartlaştırılmış izolasyonu ve miktarının belirlenmesidir.

Ve tahlil Kan Hücresi popülasyonlar<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larva

Öğrenin, Schmidtea mediterranea'da sodyum azit kullanarak yutak amputasyonu ve rejenerasyonunu inceleyin. Bu hassas yöntem, kök hücrelerin organ kaybına nasıl yanıt verdiğini araştırır ve doku yenilenmesi mekanizmalarını anlamaya katkı sağlar.

Kimyasal amputasyon ve yeniden oluşturulmasını Planarian Schmidtea mediterranea yutak

Daha fazla video keşfet