Ayagin Gram-negatif bakterilerde temel Metal alımı: x-ışını Floresans, Radioisotopes ve hücre ayırma

Bu tekniğin genel amacı, x-ışını floresansı, x-ışını kristalografisi ve radyo metal alımı dahil olmak üzere biyofiziksel karakterizasyon için hücre fraksiyonasyonu yoluyla bakteriyel periplazmik içerikleri çıkarmaktır. Bu yöntem, ABC taşıma sistemlerinin yapı-fonksiyon ilişkileri ve özellikle substratlarını nasıl tanıdıkları ve bunları lipid çift tabakası yoluyla hücreye nasıl taşıdıkları dahil olmak üzere temel biyolojik ilişkileri anlamamıza yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, hücre içeriğini ayrı ayrı değerlendirmek ve proteini minimum çapraz kontaminasyon ile doğal ortamından ekstrakte etmektir.

Bu yöntem için ilk olarak YfeA substratını çıkarmaya çalışırken aklımıza geldi, yapay bir yaklaşım kullanmak yerine hücreyi apo proteini üretmek için kullanabileceğimizi fark ettik. Bakteri hücre bölmeleri boyunca substrat bağlanması ve taşınması hakkında bilgi sağlamanın yanı sıra, bu radyoizleyici testi gibi yöntemler, aynı zamanda sağlam fraksiyonlama tekniklerine sahip ökaryotik sistemler için de geçerlidir. İlk olarak, önceden hazırlanmış bir bakteri alt kültür yeniden süspansiyonunu dört santigrat derecede çözün.

Daha sonra, çözülmüş hücreleri 4.000 kez yerçekiminde 4 santigrat derecede 20 dakika boyunca peletleyin. Daha sonra, otomatik bir pipet ve 25 mililitrelik bir uçla aspire ederek hücreleri 50 mililitre buz gibi yüksek tuzlu tamponda yeniden askıya alın. Süspansiyonu, karıştırmak için ara sıra ters çevirerek 20 dakika buz üzerinde inkübe edin.

İnkübasyondan sonra, hücreleri 4 santigrat derecede 20 dakika boyunca yerçekiminin 4.500 katı ile pellet edin. Otomatik bir pipet ve 25 mililitrelik bir uçla aspire ederek hücreleri 15 mililitre buz gibi düşük tuzlu tamponda yeniden askıya alın. Ardından, süspansiyonu buz üzerinde 20 dakika boyunca inkübe edin ve karıştırma için ara sıra ters çevirin.

Ozmotik şok, çevresel tuz konsantrasyonundaki ani bir düşüşün ardından gram negatif dış zarı yırtar. Hücrelerin nazikçe ele alınması, iç zarın istenmeyen daha fazla yırtılmasını, periplazma sitoplazmasının çapraz kontaminasyonunu ve serbest kalan periplazma proteinlerinin destabilizasyonunu veya agregasyonunu önlemek için çok önemlidir. Bunu takiben, sferoplastları 4 santigrat derecede 20 dakika boyunca yerçekiminin 4.500 katı derecede peletleyin.

Ardından, periplazmayı içeren süpernatanı geri kazanın. Peletlenmiş sferoplastları, otomatik bir pipet ve 25 mililitrelik bir uç ile aspire ederek fosfat tamponlu tuzlu su çözeltisi içinde yeniden süspanse edin. Daha sonra, hücreleri 1.500 psi'de bir Fransız basınç hücresi presinin üç döngüsü ile parçalayın.

Şimdi, hücresel kalıntıları 50.000 kez yerçekiminde 20 dakika boyunca 4 santigrat derecede peletleyin. Sitoplazmayı içeren süpernatanı geri kazanın. Periplazmik fraksiyonun fraksiyonlanmasını ve saflaştırılmasını takiben, saflaştırılmış proteinin 1.5 mikrolitresini PEG 4000, sodyum klorür, Bis-Tris tamponu ve sodyum azid ile bir pipet ve 10 mikrolitrelik bir uç ile aspire ederek oturan bir damla veya asılı damla kurulumunda karıştırın.

Kristalleşme damlalarını 293 Kelvin'de iki ila dört hafta inkübe edin. Kuluçkadan sonra, kristalleri hasat edin ve senkrotronda sevkiyat için sıvı bir nitrojen havuzunda dondurun. X-ışını floresan analizi için, numuneyi ışının dışına taşıyın ve yazılımdaki Hutch sekmesine gidin.

Enerjiyi 10 kiloelektron volt olarak ayarlamak için Enerji alt başlığını kullanın. Ardından, örneği ışına geri taşıyın ve Tara sekmesine gidin. Etkileşimli sekmesine gidin.

Floresan sinyalini optimize et'i seçin. Zaman alt başlığının altına dört saniye girin ve Floresan spektrumu al'ı seçin. Spektrum, Arsa sekmesi altında görüntülenmek üzere otomatik olarak çizilir.

Emisyon zirvelerine karşılık gelen enerji bölgelerinin analizine rehberlik etmek için ilgili unsurlar seçilebilir. Metal enerji absorpsiyon analizi için numuneyi ışının dışına çıkarın. Tara sekmesine gidin, ardından Periyodik Tablo sekmesine gidin ve ilgilenilen öğelerin K kenarını seçin.

Ardından, Hutch sekmesine gidin. Enerjiyi kiloelektron volt cinsinden önceki adımdaki değere ayarlamak için Enerji alt başlığını kullanın. Numuneyi ışının içine taşıyın.

Tarama sekmesine gidin. Otomatik sekmesine gidin ve Zaman alt başlığı altına iki saniye girin. Şimdi, Taramayı Başlat'ı seçin ve Çizim sekmesini kullanarak MAD taramasını görüntüleyin ve enerji emme kenarını belirlemek için kenar taraması'nı seçin.

Ardından, floresan ile bitti'yi seçin. Radyoaktif izleyici ile alt kültür hazırladıktan sonra, bir pipet ve bir mililitrelik bir uç ile aspire ederek 1.5 mililitrelik ayrı ayrı santrifüj tüplerine bir mililitre alikot edin. Üç çoğaltma standardını bir kenara koyun.

Deneyin sonuna kadar onlara tekrar ihtiyacınız olmayacak. Kalan tüpleri 37 santigrat derece ThermoMixer'a yerleştirin ve yerçekiminin bir katı kadar girdap yapın. İnkübasyonun ardından, tüpleri, tercihen 4 santigrat dereceye kadar soğutulmuş bir tezgah üstü santrifüj kullanarak 30 saniye boyunca yerçekiminin 15.000 katı sıcaklıkta santrifüjleyin.

Süpernatanları attıktan sonra, hücreleri bir pipet ve bir mililitrelik bir uçla aspire ederek bir mililitre buz gibi yüksek tuzlu tamponda tekrar askıya alın ve hemen 20 dakika boyunca buzun üzerine koyun. Santrifüjlemeden sonra, bir pipet ve bir mililitrelik uçla aspire ederek hücreleri buz gibi düşük tuzlu tamponda yeniden askıya alın ve 20 dakika buz üzerinde inkübe edin. Hücreleri 30 saniye boyunca yerçekiminde 15.000 kez peletledikten sonra, süpernatanların her birini yeni 1.5 mililitrelik santrifüj tüplerine toplayın.

Her fraksiyondaki ve standarttaki radyoaktiviteyi ölçün. Her numuneye orijinal olarak eklenen toplam radyoaktivite miktarını belirlemek için standartlardaki radyoaktivite miktarını kullanın. SDS-PAGE jel ve jel filtrasyon kromatogramları, hazırlayıcı periplazma fraksiyonasyonundan protein saflaştırmasının kalitesini değerlendirmek için toplandı.

Anyon değişim kromatografisi için bir astar elüsyon gradyanı, periplazma fraksiyonunun %8'ini oluşturan YfeA zenginleştirmesini anyon değişim ürününün %49'una kadar önemli ölçüde iyileştirir. Bu bileşim jel filtrasyonu ile %61'e kadar iyileştirilir ve apo proteini ile holo proteininin elüsyon hacimleri aynıdır. Saflaştırılmış apo ve holo YfeA aynı kristalleşme koşullarında kristalleşir, ancak apo ve holo YfeA kristal morfolojilerinin görüntüleri, apo ve holo YfeA durumları arasındaki kristal büyümesinde farklılıklar gösterir.

Çinkonun rekombinant YfeA'ya bağlı birincil substrat olduğu göz önüne alındığında, x-ışını floresan spektrumları, çapraz kontaminasyonun göstergesi olan holo YfeA ile orantılı güçlü bir çinko sinyali içeren bir numune veya apo YfeA'yı düşündüren daha zayıf bir çinko sinyali ile minimum çapraz kontaminasyon arasında ayrım yapabilir. Yalnızca YfeA'yı, tam YfeABCDE taşıyıcısını ve YfeABCDE bileşenlerinin hiçbirini eksprese eden E.coli hücrelerinin periplazmik ve sitoplazmik fraksiyonlarını karşılaştıran radyoaktif metal alım fraksiyonasyonunun 60 dakikalık bir anlık görüntüsü, tek bir rekombinant protein veya protein kompleksinin eksprese edilmesinin metal alımı üzerindeki sonuçlarını ortaya koymaktadır. Bir kez ustalaştıktan sonra, periplazmik bölme fraksiyonlama yoluyla tüm hücrelerden ekstrakte edilebilir.

Kromatografi ile daha da saflaştırılan protein ve kristalizasyonla ilgilenen protein, prosedürler uygun şekilde gerçekleştirildiğinde yaklaşık dört saat 30 dakika içinde düşer. Fraksiyonlama ve saflaştırma prosedürü denenirken, numunenin fraksiyonlama sırasında buz üzerinde ve saflaştırma sırasında 4 santigrat derecede tutulması önemlidir. Bu koşullar, fraksiyonlama kalitesini ve saflaştırılmış proteinin stabilitesini artıracaktır.

Bu prosedürü takiben, kanonik olmayan substratların rekabetçi inhibisyonunu veya taşıma oranlarını ölçmek ve substrat özgüllüğü ve temel fonksiyonel amino asitler hakkında ek soruları yanıtlamak için bakır veya galyum gibi diğer metaller tanıtılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, E.coli hücrelerinin nasıl fraksiyone edileceğini ve sitoplazmanın kontaminasyonu olmadan periplazma gibi bir hücre bölmesinin içeriğinin biyofiziksel analizlerinin nasıl yapılacağını iyi anlamalısınız. Radyoaktivite ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken yeterli atık yönetimi ve minimum radyoaktif reaktif kullanımı gibi önlemlerin her zaman göz önünde bulundurulması gerektiğini unutmayın.