Size Matters: Cryptococcus neoformans kapsül çap ölçümü

Bu prosedürün genel amacı, kapsül çapının görselleştirilmesi ve ölçülmesi için C. neoformans suşlarının polisakkarit kapsülünü boyamaktır. Bu yöntemler, araştırmacılara Cryptococcus neoformans'ta kapsül boyutunun indüksiyonu, görüntülenmesi ve ölçülmesi konusunda yardımcı olabilir. Boyama ve görüntüleme tekniklerinin temel avantajı, basit, hızlı olmaları ve kapsül çapının doğru bir şekilde ölçülmesine izin vermesidir.

Bu yöntemin görsel gösterimi, yazılım adımları ilk kez kullanıldığında kafa karıştırıcı olabileceğinden çok önemlidir. Cryptococcus neoformans kapsülünün çapı genellikle virülansın bir ölçüsü olarak kullanılır. Bu süreci otomatikleştirme yeteneği, analiz süresinden önemli ölçüde tasarruf sağlayabilir.

Kapsül üretimini indüklemek için, önce bir C.neoformans kolonisini maya pepton dekstroz suyunda 37 santigrat derecede inkübe edin ve kültür log fazına gelene kadar 18-36 saat çalkalayın. Kültürün sonunda, mayayı santrifüjleme ile peletleyin ve mayayı PBS'de üç kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, mayayı iki mililitre DMEM konsantrasyonu başına 10 ila beşinci hücrede iki kez yeniden süspanse edin ve kültürü 18 saat boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin.

Ertesi gün, hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve süpernatantın son 10 mikrolitresi hariç hepsini çıkarın. Mayayı Hindistan mürekkebi ile lekelemek için, kalan süpernatandaki peleti yeniden süspanse edin ve dört mikrolitre hücre süspansiyonunu ve dört mikrolitre Hindistan mürekkebini bir cam mikroskop lamına aktarın. Elde edilen çözeltiyi kabarcıklar oluşturmadan yavaşça karıştırın.

Daha sonra hücre numunesinin üzerine 1.5 numara kalınlığında 13 milimetre cam lamel yerleştirin ve kenarları toksik olmayan bir dolgu macunu ile kapatın. Mayayı bir floresan boya ile boyamak için, gece boyunca kültür peletini %1 sığır serumu ile takviye edilmiş 50 mikrolitre PBS içinde yeniden süspanse edin ve hücreleri 55-60 mikrolitre kalkoflor beyazı ve Alexa Fluor 488 konjuge kapsül monoklonal 18B7 antikoru içinde 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. İnkübasyonun sonunda, hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve peleti 10 mikrolitre PBS artı sığır serum albümini içinde yeniden süspanse edin.

Daha sonra sekiz mikrolitre hücreyi bir cam mikroskop lamına aktarın, hücre örneğini 1.5 numara kalınlığında 13 milimetre cam lamel ile kaplayın ve kenarları toksik olmayan bir dolgu macunu ile kapatın. Mayayı her iki boya ile boyamak için, önce hücreleri az önce gösterildiği gibi bir floresan kapsül ve hücre duvarı boyası ile inkübe edin. Daha sonra bir cam slayt üzerine dört mikrolitre floresan lekeli hücre ve dört mikrolitre Hindistan mürekkebi ekleyin ve gösterildiği gibi mantar hücresi örneğinin üzerine kapalı bir lamel yerleştirin.

Hücreleri ışık mikroskobu ile görüntülemek için, 100X objektifini seçin ve küçük hücre hareketlerinin neden olduğu bulanıklığı en aza indirirken görüntü kontrastını en üst düzeye çıkarmak için optimize edilmiş pozlama süreleriyle koşul başına en az 50 örtüşmeyen hücre görüntüleyin. Hücreleri floresan mikroskobu ile görüntülemek için mikroskop görüntüleme yazılımını açın ve kullanılan floroforlar için uygun uyarma ve emisyon dalga boylarını seçin. Z yığını kontrol panelinde, son ilk seçeneği seçin.

Mikroskop üzerindeki ince odak kontrolünü kullanarak, önce tek bir maya hücresinin hücre gövdesinin en geniş noktasının ve mevcut görüş alanındaki tüm hücrelerin kapsüllerinin altına odaklanın ve önce ayarla'ya tıklayın. Ardından, geçerli görüş alanındaki tüm hücreler için aynı hücrenin hücre gövdesinin ve kapsülün en geniş noktasının üzerine odaklanmak için ince odak kontrolünü kullanın ve en son ayarla'yı tıklayın. Ardından edinme sekmesini açın ve mevcut konum için Z yığınını almak üzere denemeyi başlat'a tıklayın.

Kapsül ve hücre çaplarını manuel olarak ölçmek için uygun bir hücre ölçüm programı açın ve ölçülecek görüntüyü seçin. Ölç'ü seçin ve toplam hücre çapını ölçmek için tüm hücrenin en geniş noktası boyunca düz bir çizgi çizmek için imleci kullanın. Hücre gövdesi çapını ölçmek ve sonraki hücreyi açmak için tekrar ölç'e tıklayın ve hücre gövdesi boyunca düz bir çizgi çizin.

Tüm hücreler ölçüldüğünde, görüntüleri kaydedin. Kapsül ve hücre çaplarının otomatik ölçümü için, önce uygun bir görüntü düzenleme programı açın ve Hindistan mürekkebi lekeli tüm hücre görüntülerini ters çevirin. Ardından, hem orijinal hem de ters çevrilmiş görüntüleri hücre ölçüm yazılımına aktarmak için, ölçüm programındaki dosya menüsünü açın ve sırayı içe aktar, görüntüyü yükle, diziyi manuel olarak tanımla, kanalı boyutlandır, içe aktar ve uygula'yı seçin.

Hücre gövdesini algılamak ve maskelemek için, ilgilenilen ilk ters çevrilmiş görüntü için koloni analizörü floresan protokolünü seçin ve uygula'ya tıklayın. Ters çevrilmiş C.neoformans hücre gövdesi görüntülerini kapsüllerinden segmentlere ayırmak için koloni analizörü floresan protokolünü tekrar seçin ve bir sayım maskesi oluşturmak için tekrar uygula'ya tıklayın. Sayım maskesi hücre gövdesini yeniden adlandırmak için sağ tıklayın ve kapsülü algılamak ve maskelemek için orijinal görüntüdeki hücre proliferasyon protokolünü kullanın.

Orijinal görüntü için bir sayım maskesi oluşturmak ve sayım maskesi kapsülünü yeniden adlandırmak için uygula'yı tıklatın. Bitişik kapsülleri birbirinden ayırmak üzere orijinal görüntü üzerinde yeni bir maske oluşturmak için, kapsül bölgesi için kapsül bölmesi ve kapsülü seçin. Verileri dışa aktarmak için elektronik tabloya tıklayın ve ardından elektronik tabloya aktar simgesine tıklayın.

Dışa aktarmak istediğiniz ölçümleri seçin ve son olarak verileri kaydedin. İndüksiyon sonrası çoğu suşta kapsül boyutunda bir artış belirgindir, ancak bazı suşlar doğal olarak küçük kapsüller sergiler. Bu temsili deneyde, en büyük suş ile iki küçük suş arasında kapsül boyutunda önemli bir fark sürekli olarak gözlendi.

Kapsül boyutundaki farklılıklar floresan boyalar kullanılarak da tespit edilebilir. Z yığını görüntü yakalama, her hücre için maksimum kapsül ve hücre gövdesi çapının elde edilmesini sağlar. Yığınlar daha sonra maya hücresi kapsülünün ve hücre çapının manuel ölçümü için maksimum yoğunluk projeksiyonları üretmek üzere işlenebilir.

Her iki boyama yöntemi kullanılarak yapılan kapsül ölçümleri arasında deney içi önemli bir fark yoktur, ancak floresan boya boyamaya kıyasla kapsül çaplarını ölçmek için Hindistan mürekkebi kullanıldığında deneyler arası daha büyük bir değişkenlik gözlenir. Kullanılan yöntemden bağımsız olarak, farklı araştırmacılar arasında kapsül çapı ölçümlerinde önemli farklılıklar tipik olarak gözlenmezken, otomatik ölçüm yöntemi kullanılarak kapsül boyutunda küçük ama önemli farklılıklar tespit edilebilir. Başarılı bir otomatik ölçüm için, hücreler odakta olmalı, orta ila büyük bir kapsüle sahip olmalı ve aşırı kümelenmemelidir.

Bu videoyu izledikten sonra, kapsülü Cryptococcus neoformans'ta nasıl indükleyeceğinizi, Hindistan mürekkebi veya floresan boyama kullanarak nasıl boyayacağınızı, kapsülü nasıl görüntüleyeceğinizi ve otomatik yazılım aracılığıyla nasıl ölçeceğinizi iyi anlamalısınız.