Size Matters: Cryptococcus neoformans kapsül çap ölçümü
February 27th, 2018
Polisakkarit kapsülü Cryptococcus neoformans, birincil virülans faktörü olduğunu ve onun büyüklüğü zorlanma virülans ile karşılıklı olarak ilişkilendirir. Kapsül çapı ölçümleri fenotipik test ve tedavi edici etkinliği ölçmek için kullanılır. Burada kapsül indüksiyon için standart bir yol sunulmaktadır ve boyama ve çapı ölçmek için iki yöntem karşılaştırılır.
Bu prosedürün genel amacı, kapsül çapının görselleştirilmesi ve ölçülmesi için C. neoformans suşlarının polisakkarit kapsülünü boyamaktır. Bu yöntemler, araştırmacılara Cryptococcus neoformans'ta kapsül boyutunun indüksiyonu, görüntülenmesi ve ölçülmesi konusunda yardımcı olabilir. Boyama ve görüntüleme tekniklerinin temel avantajı, basit, hızlı olmaları ve kapsül çapının doğru bir şekilde ölçülmesine izin vermesidir.
Bu yöntemin görsel gösterimi, yazılım adımları ilk kez kullanıldığında kafa karıştırıcı olabileceğinden çok önemlidir. Cryptococcus neoformans kapsülünün çapı genellikle virülansın bir ölçüsü olarak kullanılır. Bu süreci otomatikleştirme yeteneği, analiz süresinden önemli ölçüde tasarruf sağlayabilir.
Kapsül üretimini indüklemek için, önce bir C.neoformans kolonisini maya pepton dekstroz suyunda 37 santigrat derecede inkübe edin ve kültür log fazına gelene kadar 18-36 saat çalkalayın. Kültürün sonunda, mayayı santrifüjleme ile peletleyin ve mayayı PBS'de üç kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, mayayı iki mililitre DMEM konsantrasyonu başına 10 ila beşinci hücrede iki kez yeniden süspanse edin ve kültürü 18 saat boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin.
Ertesi gün, hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve süpernatantın son 10 mikrolitresi hariç hepsini çıkarın. Mayayı Hindistan mürekkebi ile lekelemek için, kalan süpernatandaki peleti yeniden süspanse edin ve dört mikrolitre hücre süspansiyonunu ve dört mikrolitre Hindistan mürekkebini bir cam mikroskop lamına aktarın. Elde edilen çözeltiyi kabarcıklar oluşturmadan yavaşça karıştırın.
Daha sonra hücre numunesinin üzerine 1.5 numara kalınlığında 13 milimetre cam lamel yerleştirin ve kenarları toksik olmayan bir dolgu macunu ile kapatın. Mayayı bir floresan boya ile boyamak için, gece boyunca kültür peletini %1 sığır serumu ile takviye edilmiş 50 mikrolitre PBS içinde yeniden süspanse edin ve hücreleri 55-60 mikrolitre kalkoflor beyazı ve Alexa Fluor 488 konjuge kapsül monoklonal 18B7 antikoru içinde 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. İnkübasyonun sonunda, hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve peleti 10 mikrolitre PBS artı sığır serum albümini içinde yeniden süspanse edin.
Daha sonra sekiz mikrolitre hücreyi bir cam mikroskop lamına aktarın, hücre örneğini 1.5 numara kalınlığında 13 milimetre cam lamel ile kaplayın ve kenarları toksik olmayan bir dolgu macunu ile kapatın. Mayayı her iki boya ile boyamak için, önce hücreleri az önce gösterildiği gibi bir floresan kapsül ve hücre duvarı boyası ile inkübe edin. Daha sonra bir cam slayt üzerine dört mikrolitre floresan lekeli hücre ve dört mikrolitre Hindistan mürekkebi ekleyin ve gösterildiği gibi mantar hücresi örneğinin üzerine kapalı bir lamel yerleştirin.
Hücreleri ışık mikroskobu ile görüntülemek için, 100X objektifini seçin ve küçük hücre hareketlerinin neden olduğu bulanıklığı en aza indirirken görüntü kontrastını en üst düzeye çıkarmak için optimize edilmiş pozlama süreleriyle koşul başına en az 50 örtüşmeyen hücre görüntüleyin. Hücreleri floresan mikroskobu ile görüntülemek için mikroskop görüntüleme yazılımını açın ve kullanılan floroforlar için uygun uyarma ve emisyon dalga boylarını seçin. Z yığını kontrol panelinde, son ilk seçeneği seçin.
Mikroskop üzerindeki ince odak kontrolünü kullanarak, önce tek bir maya hücresinin hücre gövdesinin en geniş noktasının ve mevcut görüş alanındaki tüm hücrelerin kapsüllerinin altına odaklanın ve önce ayarla'ya tıklayın. Ardından, geçerli görüş alanındaki tüm hücreler için aynı hücrenin hücre gövdesinin ve kapsülün en geniş noktasının üzerine odaklanmak için ince odak kontrolünü kullanın ve en son ayarla'yı tıklayın. Ardından edinme sekmesini açın ve mevcut konum için Z yığınını almak üzere denemeyi başlat'a tıklayın.
Kapsül ve hücre çaplarını manuel olarak ölçmek için uygun bir hücre ölçüm programı açın ve ölçülecek görüntüyü seçin. Ölç'ü seçin ve toplam hücre çapını ölçmek için tüm hücrenin en geniş noktası boyunca düz bir çizgi çizmek için imleci kullanın. Hücre gövdesi çapını ölçmek ve sonraki hücreyi açmak için tekrar ölç'e tıklayın ve hücre gövdesi boyunca düz bir çizgi çizin.
Tüm hücreler ölçüldüğünde, görüntüleri kaydedin. Kapsül ve hücre çaplarının otomatik ölçümü için, önce uygun bir görüntü düzenleme programı açın ve Hindistan mürekkebi lekeli tüm hücre görüntülerini ters çevirin. Ardından, hem orijinal hem de ters çevrilmiş görüntüleri hücre ölçüm yazılımına aktarmak için, ölçüm programındaki dosya menüsünü açın ve sırayı içe aktar, görüntüyü yükle, diziyi manuel olarak tanımla, kanalı boyutlandır, içe aktar ve uygula'yı seçin.
Hücre gövdesini algılamak ve maskelemek için, ilgilenilen ilk ters çevrilmiş görüntü için koloni analizörü floresan protokolünü seçin ve uygula'ya tıklayın. Ters çevrilmiş C.neoformans hücre gövdesi görüntülerini kapsüllerinden segmentlere ayırmak için koloni analizörü floresan protokolünü tekrar seçin ve bir sayım maskesi oluşturmak için tekrar uygula'ya tıklayın. Sayım maskesi hücre gövdesini yeniden adlandırmak için sağ tıklayın ve kapsülü algılamak ve maskelemek için orijinal görüntüdeki hücre proliferasyon protokolünü kullanın.
Orijinal görüntü için bir sayım maskesi oluşturmak ve sayım maskesi kapsülünü yeniden adlandırmak için uygula'yı tıklatın. Bitişik kapsülleri birbirinden ayırmak üzere orijinal görüntü üzerinde yeni bir maske oluşturmak için, kapsül bölgesi için kapsül bölmesi ve kapsülü seçin. Verileri dışa aktarmak için elektronik tabloya tıklayın ve ardından elektronik tabloya aktar simgesine tıklayın.
Dışa aktarmak istediğiniz ölçümleri seçin ve son olarak verileri kaydedin. İndüksiyon sonrası çoğu suşta kapsül boyutunda bir artış belirgindir, ancak bazı suşlar doğal olarak küçük kapsüller sergiler. Bu temsili deneyde, en büyük suş ile iki küçük suş arasında kapsül boyutunda önemli bir fark sürekli olarak gözlendi.
Kapsül boyutundaki farklılıklar floresan boyalar kullanılarak da tespit edilebilir. Z yığını görüntü yakalama, her hücre için maksimum kapsül ve hücre gövdesi çapının elde edilmesini sağlar. Yığınlar daha sonra maya hücresi kapsülünün ve hücre çapının manuel ölçümü için maksimum yoğunluk projeksiyonları üretmek üzere işlenebilir.
Her iki boyama yöntemi kullanılarak yapılan kapsül ölçümleri arasında deney içi önemli bir fark yoktur, ancak floresan boya boyamaya kıyasla kapsül çaplarını ölçmek için Hindistan mürekkebi kullanıldığında deneyler arası daha büyük bir değişkenlik gözlenir. Kullanılan yöntemden bağımsız olarak, farklı araştırmacılar arasında kapsül çapı ölçümlerinde önemli farklılıklar tipik olarak gözlenmezken, otomatik ölçüm yöntemi kullanılarak kapsül boyutunda küçük ama önemli farklılıklar tespit edilebilir. Başarılı bir otomatik ölçüm için, hücreler odakta olmalı, orta ila büyük bir kapsüle sahip olmalı ve aşırı kümelenmemelidir.
Bu videoyu izledikten sonra, kapsülü Cryptococcus neoformans'ta nasıl indükleyeceğinizi, Hindistan mürekkebi veya floresan boyama kullanarak nasıl boyayacağınızı, kapsülü nasıl görüntüleyeceğinizi ve otomatik yazılım aracılığıyla nasıl ölçeceğinizi iyi anlamalısınız.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu makale, Cryptococcus neoformans'ın, önemli bir virülans faktörü olan polisakkarit kapsülünün boyanması ve ölçülmesi için bir yöntem sunmaktadır. Açıklanan teknikler, suş virülansıyla ilişkili doğru görselleştirme ve çap ölçümünü kolaylaştırmaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Mikrobiyoloji
- Patojenisite
- Immunoloji
Arka Plan
- Polisakkarit kapsül, Cryptococcus neoformans'ın virülansı için kritik öneme sahiptir.
- Kapsül çapı, suş virülansının önemli bir ölçüsüdür.
- Doğru ölçüm teknikleri, terapötik etkinlik değerlendirmeleri için gereklidir.
- Görsel gösterim, metodolojiyi anlamaya yardımcı olur.
Çalışmanın Amacı
- Kapsül indüksiyonu için standartlaştırılmış bir yöntem sağlamak.
- Farklı boyama ve ölçüm tekniklerini karşılaştırmak.
- Kapsül çapı ölçümünün doğruluğunu ve verimliliğini artırmak.
Kullanılan Yöntemler
- C. neoformans suşlarında polisakkarit kapsül indüksiyonu.
- Görselleştirme için boyama teknikleri.
- Görüntüleme yazılımı kullanılarak kapsül çapının ölçülmesi.
- Etkililik açısından farklı boyama yöntemlerinin karşılaştırılması.
Ana Sonuçlar
- Sunulan yöntemler, kapsülün basit ve hızlı görselleştirilmesine olanak tanır.
- Kapsül çapının doğru ölçümü sağlandı.
- Sürecin otomasyonu analiz süresini önemli ölçüde azaltabilir.
- Görsel yardımcılar, yazılım adımlarını anlamak için kritik öneme sahiptir.
Sonuçlar
- Sunulan yöntemler, C. neoformans virülansının çalışması için etkilidir.
- Doğru kapsül ölçümü, terapötik etkinliğin değerlendirilmesi için hayati öneme sahiptir.
- Gelecek çalışmalar bu tekniklerin otomasyonundan faydalanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Accurate measurement of Cryptococcus neoformans capsule diameter provides a quantitative proxy for virulence assessment, supporting target validation in antifungal discovery. The ability to automate capsule size measurement enhances reproducibility and throughput in phenotypic screening campaigns. This method enables mechanistic de-risking by linking capsule modulation to therapeutic intervention efficacy.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of virulence-associated phenotypes through direct measurement of capsule diameter.
- Operational Value: Supports hypothesis testing of genetic or chemical modulators of capsule biosynthesis.
- Strategic Value: Facilitates target confidence by correlating capsule size with pathogenic potential.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a quantifiable readout for high-content screening of compounds affecting capsule formation.
- Operational Value: India ink staining with automated image analysis enables scalable, standardized capsule diameter measurement.
- Strategic Value: Improves assay reproducibility and reduces inter-operator variability in virulence phenotype assessment.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links capsule diameter changes to strain virulence, supporting predictive modeling of therapeutic efficacy.
- Operational Value: Fluorescent co-staining with confocal imaging allows for precise, resolution-enhanced capsule visualization.
- Strategic Value: Enables translational continuity from in vitro phenotype to in vivo pathogenicity assessment.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target validation through phenotypic screening to preclinical evaluation, where capsule diameter serves as a biomarker of virulence modulation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven interrogation of capsule biosynthesis pathways as virulence determinants.
- Screening: Enables automated, quantitative measurement of capsule size for compound library screening.
- Analytics: Generates morphometric data (capsule and cell body diameter) for comparative analysis across conditions.
- Translational Research: Connects in vitro capsule measurements to in vivo virulence models for risk-adjusted advancement.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for antifungal lead identification and mechanism-of-action studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in virulence assessment through direct, quantifiable phenotyping.
- Operational Value: Standardization via automated image analysis improves throughput and reduces manual measurement bias.
- Strategic Value: Increases predictive confidence in go/no-go decisions by linking capsule size to pathogenic potential.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of antifungal candidates based on virulence attenuation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microbiological culture techniques and microscopy-based imaging.
- Dependent on access to light or fluorescence microscopy and image analysis software capable of morphometric segmentation.
- Necessitates standardization of capsule induction protocols across laboratories to ensure comparability.
- Automated measurement requires cells to be in focus with sufficient capsule size and minimal clustering for accurate segmentation.
- Inter-experiment variability is higher with India ink than fluorescent staining, necessitating careful protocol adherence.
