İki fotonlu Lipopolysaccharide tedavi fare karaciğer bağışıklık yanıtında sırasında lökositlerin Intravital görüntüleme

Bu prosedürün genel amacı, septik şok sırasında karaciğer içindeki lökositlerin morfolojisini ve işlevselliğini gözlemlemektir. Bu tekniğin temel avantajı, karaciğer içindeki lökositlerin doğrudan videolarını elde edebilmenizdir. Ameliyattan önce ameliyat masasını ve tüm aletleri dezenfekte etmek için %70 etanol kullanın.

Ardından karaciğer ameliyatı için aletleri ayarlayın ve ısıtma plakasını 37 santigrat dereceye ayarlayın. Metin protokolüne göre LPS veya PBS enjekte edilen fareleri uyuşturduktan sonra, retinanın kurumasını önlemek için az miktarda göz merhemi uygulayın. Karın çevresindeki tüyleri almak için bir jilet ve tüy dökücü krem kullanın.

Ardından karnı temizlemek için ıslak gazlı bez kullanın. Bir insülin şırıngası kullanarak retro-orbital enjeksiyon yaparken, 200 mikrolitre Texas kırmızı dekstran çözeltisi enjekte edin. Ksifoid işleminden kaburganın sonuna kadar sağ subkostal alanı işaretlemek için bir işaretleyici kullanın.

Daha sonra ikincil enfeksiyonu önlemek için farenin karnına povidon iyot uygulayın. Epidermisi kesmek için forseps ve makas kullanın. Daha sonra, mikro makas ve forseps kullanarak karın boşluğunu açın ve karaciğeri dikkatlice ortaya çıkarın.

Sol yan lobu açmak için pamuklu çubuklar kullanın. Daha sonra karaciğerin kurumasını önlemek için karın boşluğuna 500 mikrolitre steril PBS dökün. Fareyi özel olarak tasarlanmış bir haznede doğru dekübit pozisyonuna yerleştirin ve silikon yatağa az miktarda doku yapıştırıcısı uygulayın.

Ardından karaciğeri dikkatlice takmak için pamuklu çubuklar kullanın. Karaciğer dokusu son derece gevrektir. Karaciğeri açığa çıkarırken ve tutarken asla keskin veya ağır aletler kullanmayın.

Birkaç saniye sonra, kurumasını önlemek için karaciğeri 500 mikrolitre steril PBS ile tekrar ıslatın. Ardından metal çerçeveyi karaciğerin üzerine yerleştirin ve sıkıca sabitlemek için somun kullanın. Metal çerçeveyi yerleştirmeden önce daima destek somunlarını yerleştirin.

Bu, metal çerçevenin basıncını azaltmaya yardımcı olacaktır. Karaciğerin intravital görüntülemesini yapmak için, lazeri açmak için Zen yazılımını çalıştırın. Dalga boyunu 880 nanometreye ayarlayın ve yeşil ve kırmızı kanalları ayarlayın.

Ardından lazer gücünü floresan yoğunluğuna göre ayarlayın. Hazneyi görüntüleme tablasına yerleştirin ve 20 güçlü suya daldırma objektif lensini kapak camına yakın bir yere yerleştirin. Vücut sıcaklığını korumak için silikon kauçuk ısıtıcıyı fare gövdesinin altına sabitleyin.

Daha sonra metal çerçeve üzerine 500 mikrolitre damıtılmış su çekin. Ve sonra objektif lensi karaciğere yakın konumlandırın. Odağı ayarlayın ve görüntüleme alanının derinliğini ve süresini belirleyin.

Uzun süreli görüntüleme için, etik nedenlerle görüntüleme sırasında her saat için önceden hazırlanmış Zoletil ve Rompun anestezik karışımından yarım doz enjekte edin. Vücut ısısını 37 santigrat derecede tutun ve anestezi süreleri her fare için farklı olduğundan her zaman fareye göz kulak olun. Verileri analiz etmek için Velocity'yi açın ve ham verileri kitaplıktan içe aktarın.

Ardından görüntüdeki paraziti kaldırın ve anlık görüntü alın. Son olarak, düzenlenen öğeleri %100'e sığdırın ve dosyaları anlık görüntü görüntüleri için JPEG veya TIF dosyaları ve filmler için AVI dosyaları olarak dışa aktarın. Kontrol farelerinin intravital görüntüleme analizi, kan damarında az sayıda nötrofilin dolaştığını gösterdi.

LPS ile tedavi edilen farelerde nötrofil sayısı önemli ölçüde artmıştır. LPS durumunda, kan dolaşımı içinde çok sayıda nötrofil dolaşıyordu, ancak damarın dışına göç etmiyorlardı. Bu filmlerde görüldüğü gibi, kontrol farelerine kıyasla, LPS ile tedavi edilen farelerdeki nötrofiller, damarın lümen yüzeyine daha sıkı bir şekilde yapıştı ve bu da nötrofillerin damarda daha sık tespit edilmesini sağladı.

Nötrofillerin motilitesinin yanı sıra, CX3CR1-GFP farelerinde karaciğer kapsüler makrofajları veya LCM'ler, dokunun derinliklerinden ziyade karaciğer dokusunun yüzeyinde gözlendi. Ek olarak, LCM'ler, LPS ile tedavi edilen farelerde bile karaciğerde çok az hareket veya aktivasyon gösterdi. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa 30 dakika içinde yapılabilir.

Bu prosedürü denerken, insizyon hattını ksifoid işleminden sağ subkostal karnın sonuna kadar ayarlamayı unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, karaciğerin hasar ve enfeksiyondan nasıl kurtulduğu gibi ek soruları yanıtlamak için tedavi enjeksiyonu gibi diğer yöntemler de uygulanabilir. Geliştirilmesinden sonra bu teknik, tıp alanındaki araştırmacıların lökositin sepsis sırasındaki reaksiyonunu keşfetmelerinin ve potansiyel ilaçları test etmelerinin yolunu açtı.

Bu videoyu izledikten sonra, minimal karın kesisi ile bir karaciğeri nasıl açığa çıkaracağınızı iyi anlamalısınız. Lipopolisakkarit ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken sterilizasyon ve el yıkama gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.