İnsan kullanarak Pluripotent kök hücre kaynaklı hepatosit benzeri hücreler indüklenen ilaç bulma için

Bu deneyin genel amacı, insan kaynaklı pluripotent kök hücreleri, yüksek verimli tarama için uygun bir şekilde hepatosit benzeri hücrelere ayırmaktır. Karaciğer hücrelerinin laboratuvarda büyütülmesi zordur, ancak karaciğer hastalığı için tedavileri tanımlamak için bir tarama platformu sağlayan indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden üretilebilirler. Bu tekniğin temel avantajı, karaciğer hastalığı olan herhangi bir hastadan laboratuvarda hastalığı özetleyen sınırsız sayıda hepatosit üretilebilmesidir.

Kök hücre biyolojisi hakkında kapsamlı bilgi sahibi olmadan bile prosedürün kurulması nispeten kolaydır. Tekrarlanabilirliği, araştırmacıların karmaşık robotiklere ihtiyaç duymadan binlerce bileşiği taramasına olanak tanır. Doktora sonrası araştırmacı Ray Liu ve yüksek lisans öğrencisi Paige Lamprecht bugün prosedürü gösterecek.

İlk olarak, füzyon proteini Ecad'ı Dulbecco'nun fosfat tamponlu salini veya kalsiyum ve magnezyum içeren DPBS ile mililitrede 15 mikrograma seyreltin. 100 milimetre süspansiyon doku kültürü kaplarını beş mililitre seyreltilmiş matris ile kaplayın ve 37 santigrat derecede en az bir saat inkübe edin. İnkübasyonun ardından, substratı çıkarın ve beş mililitre iPSC kültür ortamı ile değiştirin.

Sıvı nitrojenden dondurularak saklanmış insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden oluşan bir şişe alın. Küçük bir buz kristali kalana kadar 37 santigrat derecede çözdürün. Ardından, hücreleri dört mililitre kültür ortamı içeren steril 15 mililitrelik konik bir tüpe nazikçe pipetleyin.

Hücreleri beş dakika boyunca 300 G'de santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve hücreleri, Rho ile ilişkili, sarmal bobin içeren bir protein kinazın seçici bir inhibitörü olan on mikromolar Y-27632 ile takviye edilmiş beş mililitre ortamla nazikçe yeniden askıya alın. Şimdi, kültür ortamını Ecad kaplı on milimetre süspansiyonlu doku kültürü kaplarından çıkarın ve beş mililitre hücre ekleyin.

iPSC'ler yaklaşık% 80 birleşmeye ulaştığında, kültür ortamını çıkarın ve bir kez kalsiyum ve magnezyum içermeyen DPBS ile yıkayın. DPBS'yi aspire edin ve bulaşıkları kaplamak için yeterli miktarda% 0.02 EDTA çözeltisi ekleyin. Ardından, hücreleri oda sıcaklığında üç dakikaya kadar inkübe edin.

Hücreler serbest kalmaya başlar başlamaz,% 0.02 EDTA çözeltisini çıkarın ve hücreleri serbest bırakmak için tabağı on mililitre M ortamı ile doldurun. Nazik pipetleme ile iPSC'lerin ayrılmasına yardımcı olun. Beş mililitre M ortamı içeren taze Ecad kaplı doku kültürü kabı başına asılı hücrelerin 1 / 10'unu aktarın.

Kültürleri 37 santigrat derecede% 4 oksijen ve% 5 karbondioksit altında inkübe edin ve ortamı günlük olarak değiştirin. Mililitrede iki miligram konsantrasyonda 250 mikrolitre buz gibi soğuk matris stoğundan oluşan bir şişe alın ve buz üzerinde çözün. Daha sonra, çözülmüş matrisi, mililitre başına 0,05 miligramlık bir nihai konsantrasyon elde etmek için önceden soğutulmuş bir pipet kullanarak hafifçe karıştırarak on mililitre soğuk DMEM/F12 ile birleştirin.

100 mikrolitre seyreltilmiş matrisi 96 oyuklu bir doku kültürü plakasının her bir oyuğuna aktarın. Plakayı 37 santigrat derecede% 4 oksijen ve% 5 karbondioksit altında en az bir saat inkübe edin. İnkübasyonun ardından, matrisi atın ve oyuk başına 50 mikrolitre M ortamı ile değiştirin, aynı kaplama prosedürünü plakaların geri kalanıyla tekrarlayın.

Şimdi, iPSC'leri hücreler %80 birleşmeye yaklaşana kadar 100 milimetrelik tabaklar üzerinde kültürleyin. Her 100 milimetrelik plakadan iPSC'leri toplamak için kültür ortamını aspire edin ve beş mililitre DPBS ile durulayın. Durulamayı Accutase gibi üç mililitre hücre ayırma solüsyonu ile değiştirin.

Ardından, %4 oksijen ve %5 karbondioksit altında 37 santigrat derecede yaklaşık iki dakika inkübe edin. Hücreler ayrılmaya başlar başlamaz, yedi mililitre M ortamı ekleyerek hasat edin. Hücre kolonilerini yaklaşık üç ila altı hücreden oluşan küçük kümelere ayırmak için birkaç kez pipetleyin.

Daha sonra, iPSC'leri 15 mililitrelik steril bir santrifüj tüpüne toplayın ve beş dakika boyunca 300 G'de santrifüjleyin. Bittiğinde, süpernatanı çıkarın ve hücre peletini beş mililitre M ortamında yeniden askıya alın. Çok kanallı bir pipet kullanarak her bir oyuğa 50 mikrolitre süspansiyon hücresi pipetleyerek hücreleri 96 oyuklu matris kaplı plakalara eşit olarak dağıtın.

Daha sonra, hücreleri gece boyunca 37 santigrat derecede %4 oksijen ve %5 karbondioksit altında kültürleyin ve hücre tohumlama prosedürlerini plakaların geri kalanıyla tekrarlayın. Hücrelerin her bir kuyucuğun yüzeyinin en az% 70'ini kapladığından emin olmak için 96 oyuklu plakayı mikroskopi ile inceleyin. Farklılaşmanın birinci gününden ikinci gününe kadar, kültür ortamını kuyu başına 100 mikrolitre RPMI bazlı farklılaşma ortamı ile değiştirin.

Daha sonra, hücreleri ortam oksijeninde 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte iki gün boyunca günlük ortam değişikliği ile inkübe edin. Farklılaşmanın üçüncü gününden beşinci gününe kadar, kültür ortamını% 2 ve mililitre aktif NA başına 27 nanogram ile desteklenmiş 100 mikrolitre RPMI bazlı farklılaşma ortamı ile değiştirin. Hücreleri ortam oksijeninde 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte üç gün boyunca günlük ortam değişikliği ile kültürleyin. Farklılaşma beşinci gününde, her bir kuyucuğa 30 saniye boyunca 100 mikrolitre% 0.02 EDTA çözeltisi uygulayın ve çözeltiyi hemen çıkarın.

100 mikrolitre taze RPMI bazlı farklılaştırma ortamı ekleyin ve plakaların geri kalanı için aynı işlemi tekrarlayın. Altı ila onuncu günler arasındaki farklılaşma için, kültür ortamını 100 mikrolitre RPMI bazlı farklılaşma ortamı ile değiştirin. Hücreleri 37 santigrat derecede% 4 oksijen ve% 5 karbondioksit altında% 5 gün boyunca günlük orta bir değişiklikle inkübe edin.

11 ila 15. günler arasındaki farklılaşma için, kültür ortamını, mililitre HGF başına% 2 ve 27 nanogram ile desteklenmiş 100 mikrolitre RPMI bazlı farklılaşma ortamı ile değiştirin. Hücreleri 37 santigrat derecede% 4 oksijen ve% 5 karbondioksit altında% 5 gün boyunca günlük orta bir değişiklikle inkübe edin. 16 ila 20. günler arasındaki ayrım için, kültür ortamını mililitre oncostatin-M başına 20 nanogram ile takviye edilmiş bir hepatosit hücre kültürü ortamı ile değiştirin.

Hücreleri ortam oksijeninde 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte günlük orta değişiklikle beş gün boyunca inkübe edin. 20. günde farklılaşmanın tamamlanmasının ardından, kültür ortamını mililitre oncostatin-M başına 20 nanogram ile desteklenmiş 100 mikrolitre taze hepatosit hücre kültürü ortamı ile değiştirin. 24 saat inkübe ettikten sonra, kültür ortamını 96 oyuklu taze bir plakaya alın ve 20 santigrat derecede saklayın.

Plakaların geri kalanı için aynı toplama prosedürünü tekrarlayın. 96 oyuklu plakanın her bir oyuğuna oncostatin-M ile takviye edilmiş 90 mikrolitre taze hepatosit hücre kültürü ortamı ekleyin. Önceden hazırlanmış bir çalışma stoğu çözeltisinden seçilen her bir bileşiğin on mikrolitresini ekleyin.

İşlem görmüş numunelerdeki nihai konsantrasyona uyması için kontrol kuyularına% 0,2'ye DMSO ekleyin. 24 saat inkübe ettikten sonra, kültür ortamını 96 oyuklu taze bir plakaya toplayın ve 20 santigrat derecede saklayın. Plakaların geri kalanı için aynı toplama prosedürünü tekrarlayın.

Beş günlük tedaviden sonra, hücreler Kesin Endoderm'de karakteristik olarak ifade edilen proteinleri eksprese eder. Beş gün daha farklılaştıktan sonra, Endoderm hepatik bir kadere dönüşür ve hücreler FOXA2 ve HNF 4a'yı eksprese eder. HGF ilavesinden sonra, hücreler fetal hepatositlerde bulunan proteinleri eksprese eder ve farklılaşmanın tamamlanmasında, hücreler, belirgin nükleoller içeren bir çekirdek ve çoklu lipid damlacıkları olan büyük bir sitoplazma ile küboidal bir morfoloji benimser.

Farklılaşmanın 20. gününde HNF 4a ve albümini tespit etmek için yapılan immün boyama, bu hepatosit proteinlerinin dağılımının tüm kuyucuklarda benzer olduğunu göstermektedir. iPSC'ler, küçük molekül taraması için iPSC'den türetilmiş hepatositlerin kullanılmasına bir örnek sağlamak için APOB düşürücü bileşikleri taramak için kullanıldı. APOB testinin z faktörü 0.73'tür ve bu da platformun ilaç keşfi için kullanılmasının uygunluğunu doğrular.

Her bir bileşik için APOB'un ilaç sonrası, ilaç öncesi oranı belirlendi. İsabetlerin tanımlanması z-skor analizi ile sağlandı. APOB oranı 0,86 ile 0,44 arasında olan 24 potansiyel isabet tespit edildi.

Hücre canlılığı üzerinde olumsuz bir etkiye sahip olan bileşikleri dışladıktan sonra, APOB'u düşürmek için iki bileşiğin tekrarlanabilir olduğu bulundu. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa 25 gün içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, günlük olarak taze ortam hazırlamayı unutmamak önemlidir.

Bozunma nedeniyle bileşenlerin yanlış konsantrasyonu, hücrelerin farklılaşma yeteneğini değiştirecektir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, ilaç keşfi alanındaki araştırmacıların, insan kaynaklı pluripotent kök hücreleri kullanarak karaciğer hastalığı için terapötik tedaviyi keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin nasıl kültürleneceğini ve korunacağını ve yüksek verimli tarama için küçük bir yüzeye preslenmiş formda hepatik farklılaşmanın nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız.

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücrelerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken eldiven ve laboratuvar önlüğü gibi kişisel koruyucu ekipmanların her zaman giyilmesi gerektiğini unutmayın.