Toplanması ve işlenmesi büyük hayvanlar lenf düğümlerinden RNA analizi için: büyük hayvan türlerinin lenf nodu Transcriptomic çalışmalar için hazırlanıyor

Merhaba, benim adım Dr.Robert Schaut ve Ames, Iowa'daki Ulusal Hayvan Hastalıkları Merkezi'nde bir bilim insanıyım. Bu JoVE videosunda, aşağı akış RNA deneylerinde kullanılmak üzere büyük hayvanlardan lenf düğümlerinin toplanması ve işlenmesi hakkında sizinle bilgi paylaşacağız. Örneğin, bu deneyler, ters transkripsiyonlu ürünler üzerinde kantitatif PCR'yi veya transkriptomların RNA dizileme çalışmalarını içerebilir.

Lenf düğümleri, konakçı bağışıklık tepkilerinin değerlendirilmesi için yararlı örneklerdir, ancak aynı zamanda, lenf düğümleri içindeki bağışıklık hücrelerinde bulunan hücre içi patojenler gibi, çalışma için bir patojen RNA kaynağı da sağlayabilir. Hem hayvancılık hem de yaban hayatı türleri dahil olmak üzere büyük hayvanlardan alınan örnekler, zoonotik hastalıkların incelenmesinde ilgi çekicidir. Burada, Ulusal Hayvan Hastalıkları Merkezi'nde, sığır ve bizonlarda bruselloza neden olan brucella abortus ve sığırların bağırsak izlerinden dökülen E.Coli O157:H7 gibi türlerle çiftlik hayvanlarının enfeksiyonlarını inceliyoruz.

Ayrıca geyik ve geyik gibi vahşi yaşam türlerinden doku örneklerini de geri alacağız. Farklı hastalıklarla enfekte olmuş hayvanlardan bir dizi lenf nodu toplanabilir. Bu doğal konakçı türlerdeki dokular üzerinde yapılan çalışmalar, genellikle hastalığın doğal ilerlemesi ile fare modellerinden daha ilgilidir.

Bununla birlikte, büyük türlerden doku toplama işlemi, ötenazi ve doku toplama arasındaki daha uzun gecikme ve daha büyük boyutta lenf düğümleri de dahil olmak üzere, farelerden daha karmaşıktır. Burada, büyük hayvan enfeksiyonlarının transkriptomik çalışmalarında yer alan moleküler biyologların yanı sıra transkriptomik çalışmalara başlayan veteriner araştırmacılar için bilgilendirici olacak RNA çalışması için büyük hayvan lenf düğümlerinin izolasyonu için bir protokol sunacağız. Bu videoda, sığırlar için lenf düğümleri ile ilgili prosedürleri göstereceğiz.

Nekropsiden önce, doku izolasyon prosedürüne özel aşağıdaki malzemelerin bir araya getirilmesini öneririz. RNAlater, tek kullanımlık neşterler, temiz ve otoklav forsepsleri, biyopsi iğneleri, kullanılmış neşter ve iğneler için keskin bir kap ve bir kesme tahtası veya tek kullanımlık tepsi gibi yaklaşık 1 ml RNA doku koruyucusu ile doldurulmuş mikrofüj tüpleri, ilgili malzemelerin bulaşıcılık seviyesine bağlı olarak. Bu durumda, genellikle sığırlardan topladığımız lenf düğümlerini kullanarak prosedürün temel unsurlarını göstereceğiz.

Bruselloza neden olan bakterilerle enfekte olurlar. Bunlar preskapular lenf düğümleri ve parotis lenf bezidir. RNA geri kazanımı için büyük bir hayvan nekropsisi yaparken, hayvan dokuları üzerinde çalışan en az üç katılımcının olması yararlıdır.

Disektör bir, hayvanın farklı bölümlerinin büyük hayvan kesitlerinden sorumlu olacak, disektör iki, ana nekropsi masasında farklı hayvan bölümlerinden lenf düğümlerini geri kazanacak ve disektör üç, her lenf düğümünden kesitleri izole etmek için ayrı bir masada çalışacak ve bunları koruyucu solüsyon ile tüplere aktaracaktır. Preskapüler lenf nodunun tanımlanması ve çıkarılması ile başlayacağız. İdeal olarak, diseksiyondan önce bir lenf nodunun palpasyonu, lenf nodunun yerini belirlemeye yardımcı olacaktır.

Tespit etmek her zaman mümkün olmasa da, preskapular lenf nodu tipik olarak sağlıklı bir hayvanda aşikardır. Hayvanı yanal yaslanmaya yerleştirerek başlayın. Ön uzuvu diz hizasında geriye doğru hareket ettirerek omzu uzatın.

Bu hareket omzu geri getirecek ve lenf nodunun kolay palpasyonunu sağlayacaktır. Gösterildiği gibi lenf düğümünün varlığını hissedin. Yerleştirildikten sonra ve omuz hala uzatılmış durumdayken, omzun dış hatları boyunca bir cilt kesisi yapmak için bir neşter veya otopsi bıçağı kullanın.

Omuz ve boyun kaslarının noktasını ortaya çıkarmak için cildi geri çekin. Bazen, özellikle aşırı şartlandırılmış hayvanlarda, deri altı yağının bir bölümü görülür. Preskapular lenf nodu genellikle deri altı yağ bölümleriyle birlikte bulunur.

Burada cildin, kasın ve deri altı yağının üç katmanını görebilirsiniz. Bir kez daha, bir lenf nodunun yerini palpe edin. Deri altı yağının aksine, lenf nodu palpe edildiğinde şeklini koruyacaktır.

Preskapüler lenf düğümünü bulduktan sonra, deri altı yağını dikkatlice inceleyin ve lenf düğümünü inceleyin. Büyük Yellowstone bölgesindeki bizonun brusellaya yatkınlığı nedeniyle bruselloz çalışmalarında kullandığımız bizonda bu lenf nodlarının görünümü benzerdir. Burada, bir Amerikan bizonunun sağ omzundan diseke edilen preskapular lenf nodunun görünümünü gösteriyoruz.

Daha sonra parotis lenf düğümünün izolasyonuna geçeceğiz. Hayvan yanal yaslanma durumundayken, temporomandibular eklemi bulun. Bir neşter veya nekropsi bıçağı kullanarak, cilt üzerinde dikkatlice bir kesi yapın.

Eklemin dorsalinden başlayın ve çene çizgisi boyunca dikey olarak uzanın. Deri altı dokusunu ortaya çıkarmak için cildi inceleyin. Parotis tükürük bezi, öncelikle büyük boyutu, loblu yüzey görünümü ve kırmızı rengi nedeniyle görünür olacaktır.

Forseps ve neşter kullanarak, tükürük bezinin sadece kraniyal ve medialinde oturan parotis lenf düğümünü bulmak için parotis tükürük bezini bir kenara koyun. Parotis lenf düğümünü izole ederken, lenf bezi dokusunu parotis tükürük bezinin dokusundan ayırmak çok önemlidir. Doku tipleri, doku kesiti de dahil olmak üzere farklı görünür.

Bu, solda parotis lenf nodu ve sağda parotis tükürük bezi ile burada görülebilir. Daha fazla işlemden önce parotis lenf nodu dokusunu doku açısından dikkatlice incelediğinizden emin olun. Bazı durumlarda, parotis lenf düğümünü bulmak için parotis tükürük bezinin eksize edilmesi gerekebilir.

Burada, lenf nodunun tükürük bezinin içine gömüldüğü ve bez çıkarılmadan önce görülmediği bir direksiyondan çıkarılan bir parotis bezi örneği verilmiştir. Seçilen lenf nodlarının tanımlanması hakkında ek bilgi ana makalede verilmiştir. Lenf düğümleri toplandıktan sonra, koruma için bölümleri eksize etmeye hazırsınız.

Bir neşter veya otopsi bıçağı kullanın, lenf düğümünün bir bölümünü çıkarın ve lenf düğümünü açmak için sagital bir kesim yapın. Lenf düğümünün içini, özellikle enfekte hayvanlardan alınan örneklerde, asimetri, lezyonlar, renk farklılıkları vb. Bu sığır preskapular lenf nodunda, çıplak gözle birden fazla özellik görülebilir.

Bunlar, B lenfositlerine ev sahipliği yapan folikülleri ve T hücrelerine ev sahipliği yapan derin kortikal üniteleri içerir. Bu nedenler daha açık olan medüller sinüslere göre daha koyu görünür. Burada, enfekte olmamış bir lenf nodunun başka bir örneği tasvir edilmiştir.

Bu lenf nodu daha genç bir bizona aittir. Bu örnekte foliküllerin daha az belirgin olduğunu unutmayın. Dokuları işlenmek üzere bölümlere ayırmak için, bir seçenek, sonraki RNA geri kazanımı için her lenf düğümünden küçük doku parçalarını bir neşter ile toplamaktır.

Bununla birlikte, numuneler arasındaki ekspresyon profillerini karşılaştırmanın en büyük zorluğu, RNA ekstraksiyonu için kolayca bütün olarak çıkarılabilen bir fare lenf nodu ile karşılaştırıldığında, büyük hayvan lenf düğümlerinin büyük boyutudur. Sonuç olarak, küçük doku bölümleri, bir lenf düğümü boyunca hücrelerin profilini eşit şekilde yakalayamayacaktır. Bunun yerine, bir lenf nodunun profili boyunca hücreleri yakalamak için, lenf nodundan pasta şeklinde bir kama çıkarın, 5 mm'den daha kalın olmayan küçük parçalar halinde kesin ve forseps ile RNA içeren tüplere yerleştirin.

Alternatif olarak, her lenf düğümünden doku kesitlerini çıkarmak için biyopsi metodolojilerini kullanın. Düğümden belirli foliküller gibi belirli bölümleri toplamak ve ardından forseps ile RNAlater'a aktarmak istiyorsanız punch biyopsi aracını seçin. Örnekler RNA'ya aktarıldıktan sonra, bunları laboratuvara geri aktarın ve doku penetrasyonuna izin vermek için gece boyunca 4 santigrat derecede saklayın.

Daha sonra, fazla RNA'yı temizleyin ve doku örneklerini 80 santigrat derecede saklayın. RNA koruyucu çözelti kullanmanın bir artısı, nekropsi sırasında veya sahadan numune toplanması sırasında sıvı nitrojenin gerekli olmamasıdır. Numunelere erişmeden önce, homojenizasyon için tüplere Trizol reaktifini önceden alikot edin.

Numuneler dondurucudan çıkarıldıktan sonra, üreticinin tavsiyelerine göre sonraki işlemler için bunları hemen Trizol reaktifine aktarın. Burada, 50-100 mg'lık bir doku parçası Trizol reaktifine aktarılır. Trizol ilavesinden önce çözülmeyi mümkün olduğunca sınırlayın.

Kuru buz üzerinde saklama, işlenmek üzere dondurucudan birden fazla numune çıkarıldığında kullanılabilir. Tüpleri homojenizatöre yerleştirin ve Trizol reaktifinde homojenize edin. Burada, iki dakikalık bir RNA ekstraksiyon ayarı kullanılır.

Tamamlandığında, bulutlu bir görünüm olup olmadığını kontrol edin. Gerekirse tekrarlayın. Her numune için sulu ve organik katmanlar oluşturmak için üreticinin protokolünü izleyin.

Üst şeffaf sulu fazı bir pipet ucuyla çıkarın. Yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Daha sonra, eşit hacimde% 100 etanol ile karıştırın.

İyice karıştırın. Tüp genellikle bulanık görünecektir. Bir mikro pipet ucuyla, RNA'nızı daha da saflaştırmak ve ardından elüte etmek için sıvıyı silika bazlı bir ticari döndürme kolonuna aktarın.

RNA kalitesini değerlendirmek için, ayrıştırılmış RNA örneğinin bir veya iki l'sini analiz için bir spektrofotometreye yükleyin. Prosedürün tamamlanmasından sonra, 260-280 oranı ve 260-230 oranı için yaklaşık iki absorbans oranları gözlemliyoruz, bu da minimum kimyasal taşınma ile yüksek saflığı gösterir. Fenol kontaminasyonu, 260-230nm absorbans oranındaki bir azalmadan gözlemlenebilir.

Bizon gibi hayvanlarda nekropsi işlemi sırasında, ötenazi ile ilk doku örneğinin koruyucuya aktarılması arasında en az 20 dakikalık bir zaman dilimi gözlemledik. Buna karşılık, fare lenf düğümleri ötenaziden sonra birkaç dakika içinde çıkarılabilir ve korunabilir. Bu nedenle, zaman içinde lenf düğümlerinin bozulma profilini karakterize etmekle ilgilendik.

Ana el yazmasında, diğer yayınlarda test edilmiş bir dizi başka doku tipindeki RNA stabilite profillerinin bir özetini de derledik. Bizon lenf nodları ile yapılan temsili deneylerde, RNA stabilitesi ötenaziden sonraki bir saat boyunca nispeten tutarlıydı. Burada, bir Amerikan bizonundan alınan meme üstü lenf nodu dokusu parçalarından saflaştırılmış toplam RNA'nın jel görüntüsünü gösteriyoruz.

Bu bulgu, literatürden derlenen diğer doku tipleri için önceki verilerle tutarlıdır. Bu, gen ekspresyonunun aşağı akış analizi için kabul edilebilir kalitede örneklerin, bizon ve geyik gibi daha zorlu türlerden bile toplanabileceğini göstermektedir. Bununla birlikte, ölüm ve numune koruma arasındaki daha uzun sürelerin, mRNA transkriptlerinin üç asal ucundan bozunmadaki artış da dahil olmak üzere RNA ekspresyon profillerinde değişikliklere neden olabileceğini takdir etmek önemlidir.

Bu nedenle, biyolojik olarak en geçerli RNA profillerini elde etmek için, hayvan nekropsi için uygun olduğunda daha fazla gecikmeyi azaltmak için doku geri kazanımı için hızlı, kolaylaştırılmış bir iş akışı kullanmak hala önemlidir. Ek olarak, dokularda zaten mevcut olanların ötesinde, süreç boyunca numunelere RNA kirleticilerinin girmesini önlemek için prosedür boyunca dikkatli olunması gerektiğini not ediyoruz. Bu, gerekli diğer kişisel koruyucu ekipmanların bir parçası olarak eldivenlerin kullanılmasını içerir.

Ayrıca, RNA örneklerinin serbest durmasını mümkün olduğunca sınırlamak için nihai RNA ürününü birden fazla tüpe ayırıyoruz. Örneğin, kalite kontrol testlerinde kullanılmak üzere ayrı alikotlar saklanabilir. Özetle, bu videoda, aşağı akış gen ekspresyon analizi için lenf düğümlerinin tanımlanması, toplanması, temsili örneklemesi ve işlenmesinde kullanım için önemli bilgiler sağladık.

Temsili videomuz sığır ve bizon örnekleriyle gösterilirken, keçi ve geyik de dahil olmak üzere diğer büyük türlerden lenf düğümleriyle de çalıştık. İster işinizde transkriptomik yöntemlerin kullanımını düşünen bir veteriner bilim adamı olun, ister büyük hayvan bilimi alanına girmek isteyen bir moleküler biyolog olun, bu videoyu işinizde faydalı bulacağınızı umuyoruz.