Parafin gömme ve ince mikrobiyal koloni biyofilmler mikroskobik analizlerin yapıldığı için kesit

Bu prosedürün genel amacı, bozulmamış doğal morfolojiler içinde floresan protein üretimi ile rapor edilen gen ekspresyonunun dağılımını değerlendirmek için kullanılabilecek parafine gömülü biyofilm bölümleri oluşturmaktır. Bu yöntem, mikrobiyal toplulukların çalışmasında, ekzopolimerik maddelerin üretiminde spesifik genlerin ekspresyonunun doğal biyofilm mimarisi bağlamında nasıl dağıtıldığı gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, biyofilm kesitlerinin korunmuş morfolojisi içinde gen ekspresyonunun analizine izin verirken, aynı zamanda farklı özelliklerin boyanması ve konfokal veya elektron mikroskobu gibi yüksek çözünürlüklü görüntüleme gibi alt işlemlere uygun olmasıdır.

Metin protokolüne göre agar tripton çözeltisini hazırladıktan sonra, çözeltinin 45 mililitresini 100 milimetreye 100 milimetre karelik bir tabağa dökmek için 50 mililitrelik bir konik tüp kullanın. Agarın yaklaşık 20 ila 30 dakika katılaşmasına izin verin. İlk katmanın üzerine 15 milimetrelik ikinci bir katman dökün, ardından gece boyunca katılaşmasına izin verin ve gerekirse kapaklardaki yoğuşmayı gidermek için tüy bırakmayan bir doku kullanın.

Daha sonra, koloni biyofilmlerini tespit etmek için, metin protokolüne göre donmuş bir stoktan izole edilmiş tek bir P.Aeruginosa kolonisi büyüttükten sonra, orta iki katmanlı bir plakaya 2,5 ila 10 mikrolitre hücre süspansiyonu pipetleyin. Koloniler karanlıkta 25 santigrat derecede% 80 ila 100 bağıl nemde dört güne kadar inkübe edilebilir. Büyüme ortamı ve koloni üzerine 15 mililitre agar solüsyonunu yavaşça dökün ve agarın oda sıcaklığında beş dakika boyunca bir jel oluşturmasına izin verin.

Ardından, koloni üst iki katman arasına lamine edilmiş kare, üç katmanlı bir aynayı kesmek için keskin bir tıraş bıçağı kullanın. Birden fazla numune hazırlıyorsanız, her bir aynanın karşılaştırılabilir bir boyutta kesildiğinden emin olun. Mandren içeren kolonideki fazla agarı nazikçe çıkarın.

Ardından, bir spatulanın düz başını PBS veya suyla ıslatın ve agarın üst ve alt katmanları arasına nazikçe yerleştirin. Lamine koloniyi hemen kimyasallara dayanıklı bir işaretleme kalemi ile etiketlenmiş bir gömme kasetine aktarın. Gömme kasetini, önceden hazırlanmış sabitleyici içeren bir cam slayt posta kutusuna yerleştirin.

Numuneleri işleyin. Her birini bir saat boyunca iki kez yıkamak için 1X PBS kullanın. En iyi sonuçlar için, otomatik bir doku işlemcisinin döndürme işlevindeki düşük ayarı kullanarak reaktif homojenizasyonunu otomatikleştirin.

Numuneleri gömmek için, bir balmumu kalıbını 55 santigrat dereceye kadar ısıtılmış erimiş parafin mumu ile doldurun, ardından sızan aynayı gömme kasetinden balmumu kalıbına hızlı bir şekilde aktarmak için ısıtılmış düz bir spatula kullanın ve aynanın kalıbın tabanına paralel durmasını sağlayın. Balmumunun gece boyunca dört santigrat derecede katılaşmasına izin verin. Katı mumda kalıplanmış numuneler bu sıcaklıkta süresiz olarak saklanabilir.

Balmumu katılaştıktan sonra, numuneyi kalıptan çıkarın ve numunenin etrafındaki fazla mumu kesmek için bir tıraş bıçağı kullanın. Numunenin bir ucundan uzanan, onu mikrotomun içine sıkıştırmak için kullanılabilecek bir miktar balmumu bırakın. Balmumu gömülü numunenin, şekli pürüzsüz doğrusal şeritlerin toplanmasını kolaylaştıracak şekilde kesilmesi önemlidir.

Kırpmadaki küçük kusurlar şeritte artefaktlar oluşturabilir ve bölümün bütünlüğünü tehlikeye atabilir. Ardından, bir su banyosunu 42 santigrat dereceye ısıtın. Ardından, numuneyi, koloninin yüzeyi bıçağın kenarına dik olarak yönlendirilmiş olarak mikrotomun içine sıkıştırın.

Numuneyi, 75 ila 80 RPM'lik bir kesit hızına ve altı ila 10 derecelik bir boşluk açısına ayarlanmış bir mikrotom kullanılarak toplanacak olan koloninin istenen düzlemine ulaşılana kadar 50 mikrometre aralıklarla kesin. İstenilen sayıda 10 mikrometre kalınlığında bir şerit kesin. Ardından, şeridi bıçaktan ayırmak için ince uçlu bir boya fırçası kullanın.

Şimdi, bir Pasteur pipetinin ucunda forseps veya bir damla su ile şeridi yavaşça su banyosuna aktarın. Hemen su banyosuna bir slayt yerleştirin ve şeridin altına 45 derecelik bir açıyla yerleştirin. Şeridin dar kenarını, buzlu etiketin hemen altındaki slayta dokundurun.

Kurdele yapışmalı. Kaydırağı su banyosundan dışarı çekin ve açıyı, su yüzeyine dik olacak şekilde ayarlayın, böylece şeridin uzunluğu boyunca kaydırağa karşı düz bir şekilde durmasına izin verin. Fazla suyu şeridin altına hapsetmekten kaçının.

Slaytı, bölümdeki fazla suyu emen emici, tüy bırakmayan bir doku üzerine nazikçe tutun. Ardından, slaytı bir kağıt havlu üzerine koyun ve gece boyunca oda sıcaklığında karanlıkta kurumaya bırakın. Düzleştirilmiş bir sıcak plakayı 45 santigrat dereceye ısıtın ve slaytı 30 ila 60 dakika boyunca plakaya yerleştirin.

Balmumu yarı erimiş hale gelecek ve slayta karşı düzleşecektir. Sürgüyü sıcak plakadan yavaşça kaldırın ve balmumu katılaşana kadar yaklaşık bir dakika boyunca pürüzsüz, düz bir oda sıcaklığında yüzeye düz bir şekilde koyun. Erimiş balmumunun sürgünün her iki tarafına da çekilmediğinden emin olun.

Numuneler bir cam slayt posta göndericisinin içindeyken, slaytları her biri beş dakika boyunca dört yıkama temizleme maddesinde mumdan arındırın. Yıkamalar arasında solüsyonu çıkarmak için bir Buchner aspiratörü kullanın. Slaytları her biri bir dakika boyunca üç kez yıkamak için% 100 etanol kullanın.

Ardından, slaytları metin protokolüne göre yeniden sulandırdıktan sonra, bölümleri hemen üç tamponlu bir montaj ortamına monte edin ve bir lamel uygulayın. Bölümün etrafındaki bindirme agarı, sabitleyici ile reaksiyona girmez, bu nedenle pazı kızağına yapışmaz. Bu agar rehidrasyon sırasında yerinden çıkabilir ve bölüme zarar verebilir, bu nedenle rehidrasyon sırasında çözeltiyi çalkalamamaya özen gösterilmelidir.

Montaj ortamının gece boyunca oda sıcaklığında polimerize olmasına izin verin. Polimerize edildikten sonra, lamel slayta yapıştırmak için şeffaf oje kullanın. Son olarak, mühürlü slaytları karanlıkta dört santigrat derecede süresiz olarak saklayın.

Biyofilm ince kesitlerinin bazı morfolojik özelliklerini göstermek için 40 kez yağa daldırma objektifi kullanan DIC görüntüleme, biyofilm ince kesitlerinin bazı morfolojik özelliklerini göstermek için yeterli olabilirken, floresan proteinleri yapısal olarak eksprese etmek için tasarlanmış suşların floresan mikroskobu, numuneler içindeki hücresel dağılımın gelişmiş görselleştirmesini sağlar. Bu panellerde gösterildiği gibi, tek tek bölümlerin görüntüleri, tüm koloninin bir kesitini oluşturmak için bir araya getirilebilir ve makroskopik düzeyde genel morfoloji içindeki yapısal özelliklerin lokalizasyonu için bağlam sağlar. Spesifik bir promotörün kontrolü altında floresan proteini eksprese etmek için tasarlanmış bir suşun kullanılması, gen ekspresyonunun dağılımının görselleştirilmesini sağlar.

Ek olarak, koloniler orta içeren boyalar üzerinde büyütülebilir veya boyaların spesifik polisakkaritlerine kesit sonrası boyalar eklenebilir. Son olarak, numuneler burada sunulduğu gibi transmisyon elektron mikroskobu kullanılarak daha yüksek çözünürlükte hazırlanabilir ve görüntülenebilir. Bu prosedürü denerken, numunelerin taşınabilirliğine ve verileri yorumlamanızı etkileyebilecek fiksasyon, kesit alma veya rehidrasyon yoluyla floresan ve yapısal artefaktlar oluşturma potansiyeline dikkat etmek önemlidir.

Bu prosedür, floresan raportörlerin ekspresyon profillerinin morfolojik özellikler ve bir biyofilmin Z ekseni ile ilişkilendirilmesi gibi nicel bir görüntü analizine izin verir. Bu protokol, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholerae ve Bacillus subtilis gibi tıbbi ve endüstriyel öneme sahip çeşitli biyofilm oluşturan mikrop türlerine uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, parafin gömme yoluyla kesit almak için koloni biyofilmlerinin nasıl büyütüleceğini ve hazırlanacağını iyi anlamış olmalısınız.