Name: Parafin gömme ve ince mikrobiyal koloni biyofilmler mikroskobik analizlerin yapıldığı için kesit (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Öğrenin mikrobiyal koloni biyofilmlerin parafin gömme ve ince kesit tekniklerini kullanarak gen ifadesi dağılımını analiz etmeyi. Bu yöntem biyofilm mimarisinin korunmuş morfolojisinde yüksek çözünürlüklü görüntülemeyi mümkün kılar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser NSF kariyer Ödülü 1553023 ve NIH/NIAID Ödülü R01AI103369 tarafından desteklenmiştir.

1. Pseudomonas aeruginosa koloni biyofilmler büyüme
<ol><li>Orta-Bilayer plakaları hazırlanması<ol>
<li>Hazırlamak bir 10 g/L tryptone, 10 g/M agar (bakınız Tablo reçetesi) çözüm deiyonize su.</li>
		<li>Otoklav 20 dk. 50-60 ° c serin bir su banyosunda.</li>
		<li>45 mL agar-tryptone çözeltisi bir 100 x 100 mm kare tabak içine dökün ( Tablo malzemelerigörmek) 50 mL konik tüp kullanarak. Agar kuvvetlendirmek izin (~ 20-30 dk). İlk katman üzerinde bir ikinci, 15 mL katmanı dökün. Gecede kuvvetlendirmek izin, yoğunlaşma üzerinden kaldırılması gerekirse hav bırakmayan dokusu ile silerek kapakları.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Koloni biyofilmler lekelenme<ol>
<li>Dondurucu stokları LB Ağar kaplamalar13 üzerine gelen faiz suşları çizgi ve 12-16 h 37 ° C ve 80-%100 bağıl nem, karanlıkta kuluçkaya.</li>
		<li>Her zorlanma veya çoğaltma için bir koloni 2 mL lb aşılamak ve 12-16 250 devir / dakikada sallayarak ile h 37 ° C'de karanlıkta kuluçkaya için kullanın.</li>
		<li>Taze LB ve 250 devir / dakikada sallayarak ile 2,5-3 h 37 ° C'de karanlıkta kuluçka 1: 100 sulandrarak alt kültür.</li>
		<li>Ölçmek bir Spektrofotometre kullanarak optik yoğunluk ve aşırı doz ile bir hücre süspansiyon ulaşmak için steril LB ile ayarlamak500 nm ~ 0,5.</li>
		<li>Üzerinde istenen kolonisi bağlı olarak boyut, damlalıklı 2.5-10 µL hücre süspansiyon (1.1 adımda hazırlanan) bir orta-bilayer plaka üzerine ve ~ 20 dk. petri kapağı açık alev yakınındaki Aralık bırakarak kurutma kolaylaştırmak için kuru için bir yer sağlar.</li>
		<li>Spot colonies adlı 25 ° C ve 80-%100 bağıl nem, 4 gün için karanlıkta kuluçkaya.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. sabitleştirici çözüm hazırlanması
<ol><li>Sabitleştirici çözüm örnek hasat gününde hazırlamak. 1 x PBS son konsantrasyonu % %4 37 formaldehit (FA) seyreltik SK. Dikkat: SK geçici ve zehirli. Koruyucu ekipman giymek ve iyi havalandırılan bir duman-hood işe.</li>
	<li>Kullanımdan hemen önce L-lizin hidroklorür % 4 olarak dağıtılması (2.1 adımda hazırlanan) FA 50 mM L-lizin HCl son bir konsantrasyon için oda sıcaklığında.</li>
</ol>3. doğrudan sabitleştirici uygulamaya koloni biyofilm [isteğe bağlı]
Not: Biz agar bindirme fiksasyon önce eklendiğinde biyofilm Morfoloji en iyi korunmuş bulduk. Ancak, bu adımı da gen ifadesinin etkileyebilecek çevre koşullarında bir değişiklik kabul ettiğiniz anlamına gelir. Floresan muhabir ifade desenleri bu nedenle burada açıklandığı gibi fiksasyon adım agar yerleşimi, toplamadan önce içinde yapılan ayrı bir iletişim kuralı kullanılarak doğrulanması gerekir.
<ol><li>Fiksasyon ve iyi havalandırılan bir duman mahallede çalışma günü, koloni'nın kenar, koloni'nın çevre batış olmadan ulaşmak izin etrafında agar yüzeye doğrudan 2. adımda hazırlanan sabitleştirici pipette. Koloni için tam gerektiği kadar sabitleştirici surround olarak yaklaşık 500 µL. izin sadece koloni ve çevresindeki agar yaygın sabitleştirici uygulanır.</li>
	<li>Bir kez sabitleştirici koloni ve çevre medya, yaklaşık 20-30 dakika, tamamen absorbe olmuştur ve kalan SK artık plaka üzerinde görünür, 3.1 arasındaki adımları yineleyin. Bu sabitleştirici koloni ve çevresindeki agar yaygın izin.</li>
	<li>Sabitleştirici tamamen koloni içine emilir ve çevresindeki edildikten sonra medya 3.1, bu sefer sabitleştirici koloni yüzeyine doğrudan uygulama adımları yineleyin. Bu sabitleştirici koloni ve çevresindeki agar yaygın izin, adım 4'e sadece devam sonuçta sabitleştirici absorbe oldu ve artık plaka üzerinde görünür.</li>
</ol>4. overlaying kolonileri Agar ile
<ol><li>Fiksasyon günü, 10 g/M agar çözüm deiyonize su ve basınçlı kap çözülmeye 10-20 dakika içinde hazır olun. Bir su banyosu 50 ˚C için serin.</li>
	<li>Yavaşça agar çözüm 15 mL büyüme orta ve koloni üzerine dökün. Agar 5 min (şekil 1B) için oda sıcaklığında bir jel oluşturmak olanak sağlar.</li>
	<li>Keskin bir ustura arasında en iyi iki kat lamine koloni ile bir kare, 3 katmanlı chuck kesmek için kullanın. Birden çok örnekleri hazırlama, her chuck karşılaştırılabilir bir boyutuna kesme emin.</li>
	<li>Yavaşça aşırı agar koloni içeren Chuck'tan çıkarın.</li>
	<li>Agar (koloni içeren) iki üst kat chuck (şekil 1 c) alt tabaka uzakta kaldırmak için bir spatula 1 x PBS veya su düz kafa ıslak ve yavaşça arasında üst ve alt Katmanlar ekleyin. Lamine koloni alt katmandan ayrı olmalıdır. Deforme etmek ya da ne zaman onun tabanından kaldırarak lamine koloni viraj değil dikkatli olun.</li>
</ol>5. fiksasyon
<ol><li>Gömme bir kaset lamine kolonisi (yani, 2 katlı chuck) Aktarım hemen bir iyi havalandırılmış duman-başlık, çalışma (bakınız Tablo malzemeler), etiketli bir kimyasal dayanıklı işaretleme kalemiyle. Bir cam slayt mailler gömme kaset yerleştirin (bkz. tablo malzemelerin) 2.1-2.2 adımda hazırlanan sabitleştirici içeren. Gömme kaset içinde hapsolmuş hava hava kabarcığı yok olduğundan emin olun.</li>
	<li>Oda sıcaklığında karanlık gecede sabitleştirici örnekte kuluçkaya.</li>
</ol>6. örnek işleme: Arabellek yıkama, su kaybı, takas ve infiltrasyon
<ol><li>Gecede fiksasyon sonra örnek iki kez 1 x PBS için 1 h yıkayın. En iyi sonuçlar için reaktif homojenizasyon spin kullanarak otomatikleştirmek işlevi bir otomatik doku işlemcinin düşük bir ayara ayarla (malzemelerin tabloya bakın). Hiçbir işlemcisi varsa, işleme el ile çalıştırabilirsiniz.</li>
	<li>1s için her oda sıcaklığında dehidratasyon etanol (alkol) dilutions 1 x PBS (% 25, % 50, % 70, % 95) içinde kademeli bir dizi tarafından arabellek yıkama izleyin.</li>
	<li>% 100 üç yıkar kurutmak için 1 h her oda sıcaklığında alkol.</li>
	<li>% 100 portakal yağ bazlı temizleme aracının üç yıkama susuz örnekte temizleyin (malzemelerin tabloya bakın) oda sıcaklığında her 1 h için.</li>
	<li>Temizlenen örnek iki kez ile erimiş parafin balmumu (bkz. Tablo reçetesi) sızmak ısıtmalı 2 h için 55˚C için.</li>
</ol>7. örnek katıştırma
<ol><li>Bir mum kalıp için 55 ˚C ısıtılan erimiş parafin mum ile doldurun. Bir ısıtmalı, düz spatula gömme kaset infiltre chuck chuck kalıp tabanına paralel aittir sağlanması mum kalıp içine hızlı bir şekilde aktarmak için kullanın. Chuck üzerine aşırı basınç uygulamaktan kaçının. Mum kalıpları özel 3 boyutlu baskılı olabilir veya piyasada bulunan ( Tablo reçetesi' ya bak›n).</li>
	<li>Gecede 4 ˚C kuvvetlendirmek balmumu izin. Katı mum kalıp örnekleri 4 ˚C süresiz olarak depolanabilir.</li>
	<li>Bir kez balmumu katılaşmış, kalıp örnekten tüketim ve fazla balmumu bir tıraş bıçağı ile örnek etrafında döşeme. Microtome kelepçe için kullanılan örnek, kesit, uçağa paralel bir ucunu uzanan aşırı balmumu bırakın ( Tablo malzemelerigörmek). Ayrıca balmumu, yaklaşık 1 mm kalın, örnek etrafında kılıf bırakın ve onun yüzleri pürüzsüz.</li>
</ol>8. kesit
<ol><li>Bir su banyosu için 42 ˚C ısı. Örnek microtome yüzeye dik bıçak kenarına odaklı koloninin içine kelepçe ( Tablo malzemelerigörmek).</li>
	<li>Kadar koloni istenen boyutunda ulaştı, hangi bölümlerde toplanacak örnek 50 µm aralıklarla kırpın.</li>
	<li>İstenen sayıda 10 µm kalınlığında bölümü 75-80 rpm bir parça hız ve bir boşluk açısı 6-10˚ olarak ayarlanmış bir microtome kullanarak bir şerit kesin. Şerit'ten bıçak ayırmak için ince uçlu bir fırça kullanın.</li>
	<li>Pasteur pipet (tercih edilen) veya forseps ucunda bir damla su kullanarak, yavaşça su banyosu için transfer folyosunu. Bindirme hava kabarcıkları altında belgili tanımlık parça önlemek için dikkatli olun.</li>
	<li>Hemen su banyosu bir slayt ekleyin ve bir 45˚ açıyla şerit altında konumlandırın.</li>
	<li>Sadece buzlu etiketinin altında slayt Şerite dar kenarı dokun. Şerit i uygun olmalıdır.</li>
	<li>Slayt su yüzeyine dik olmak için açı ayarlayarak ve slayt uzunluğu boyunca karşı yat için şerit i sağlayan su banyosu dışarı çekin. Şerit altında aşırı su bindirme kaçının.</li>
	<li>Yavaşça slayt bölümünde aşırı su esneklik emici bir hav bırakmayan dokusu üzerine standı.</li>
	<li>Slaydı bir kağıt havlu üzerinde yatıyordu ve gece karanlıkta oda sıcaklığında kurumasını bekleyin. Slaytlar, karanlıkta 4 ˚C süresiz olarak saklanır.</li>
</ol>9. ısı sabitleme, rehidrasyon ve montaj
<ol><li>Düzeltilmiş elektrikli Ocak 45 ˚C için ısı. Slayt için 30-60 dk ısı. Balmumu yarı erimiş olmak ve slayt karşı düzleştirin.</li>
	<li>Yavaşça sıcak plaka slayttan kaldırın ve yatıyordu kullanarak bir düz, düzeltilmiş, oda sıcaklığında yüzeye düz kulak balmumu (~ 1 dk) katılaşır kadar erimiş mum slayt, her iki tarafına çekin değil olduğunu emin olmak.</li>
	<li>Bir cam slayt mailler kullanarak, dört yıkar yıkar arasında çözüm kaldırmak için bir Büchner aspiratör kullanarak Aracısı 5 dk her, açıklığın slaytları de-balmumu.</li>
	<li>Slaytları üç kere % 100 yıkama alkol 1 dk için.</li>
	<li>Etanol (% 95, % 70, % 50 ve % 25) her iki 1-dak yıkar 1 x PBS ardından 1dk için işleme tersten kademeli bir dizi slayt rehydrate.</li>
	<li>Hemen Tris tamponlanmış montaj orta bölümlerinde mount ( Tablo malzemelerigörmek) ve hava kabarcıkları getirilmesi kaçınarak bir coverslip uygulayın. Gecede oda sıcaklığında polimerize için montaj orta izin.</li>
	<li>Sonra polimerli, coverslip açık oje kullanarak slayt için mühür. Kapalı slaytlar süresiz olarak 4 ˚C kararınca depolanabilir.</li>
</ol>

<ol><li>Ray, V. A., Morris, A. R., Visick, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+semi-quantitative+approach+to+assess+biofilm+formation+using+wrinkled+colony+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A semi-quantitative approach to assess biofilm formation using wrinkled colony development.</a> J. Vis. Exp. (64), e4035(2012).</li>
<li>Friedman, L., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+involved+in+matrix+formation+in+Pseudomonas+aeruginosa+PA14+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genes involved in matrix formation in Pseudomonas aeruginosa PA14 biofilms.</a> Mol. Microbiol. 51 (3), 675-690 (2004).</li>
<li>Okegbe, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron-shuttling+antibiotics+structure+bacterial+communities+by+modulating+cellular+levels+of+c-di-GMP%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Electron-shuttling antibiotics structure bacterial communities by modulating cellular levels of c-di-GMP.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 114 (26), E5236-E5245 (2017).</li>
<li>Vlamakis, H., Aguilar, C., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+cell+fate+by+the+formation+of+an+architecturally+complex+bacterial+community%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Control of cell fate by the formation of an architecturally complex bacterial community.</a> Genes Dev. 22 (7), 945-953 (2008).</li>
<li>Serra, D. O., Richter, A. M., Klauck, G., Mika, F., Hengge, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microanatomy+at+cellular+resolution+and+spatial+order+of+physiological+differentiation+in+a+bacterial+biofilm%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Microanatomy at cellular resolution and spatial order of physiological differentiation in a bacterial biofilm.</a> MBio. 4 (2), e00103-e00113 (2013).</li>
<li>Serra, D. O., Richter, A. M., Hengge, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellulose+as+an+architectural+element+in+spatially+structured+Escherichia+coli+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Cellulose as an architectural element in spatially structured Escherichia coli biofilms.</a> J. Bacteriol. 195 (24), 5540-5554 (2013).</li>
<li>McGlinn, E., Mansfield, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+gene+expression+in+mouse+embryos+and+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Detection of gene expression in mouse embryos and tissue sections.</a> Methods Mol. Biol. 770, 259-292 (2011).</li>
<li>Choi, Y. S., Kim, Y. C., Baek, K. J., Choi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Situ+Detection+of+Bacteria+within+Paraffin-embedded+Tissues+Using+a+Digoxin-labeled+DNA+Probe+Targeting+16S+rRNA%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA.</a> J. Vis. Exp. (99), e52836(2015).</li>
<li>James, G., Hunt, A. M. A. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/chapter/10.1007/978-3-642-53833-9_3">Imaging Biofilms in Tissue Specimens.</a> Antibiofilm Agents. , 31-44 (2014).</li>
<li>Madsen, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facultative+control+of+matrix+production+optimizes+competitive+fitness+in+Pseudomonas+aeruginosa+PA14+biofilm+models%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Facultative control of matrix production optimizes competitive fitness in Pseudomonas aeruginosa PA14 biofilm models.</a> Appl. Environ. Microbiol. 81 (24), 8414-8426 (2015).</li>
<li>Jo, J., Cortez, K. L., Cornell, W. -C., Price-Whelan, A., Dietrich, L. E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+orphan+cbb3-type+cytochrome+oxidase+subunit+supports+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+growth+and+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">An orphan cbb3-type cytochrome oxidase subunit supports Pseudomonas aeruginosa biofilm growth and virulence.</a> bioRxiv. , 171538(2017).</li>
<li>Fong, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+dynamics+of+RbmA+governs+plasticity+of+Vibrio+cholerae+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Structural dynamics of RbmA governs plasticity of Vibrio cholerae biofilms.</a> Elife. 6, (2017).</li>
<li>Bertani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysogeny+at+mid-twentieth+century%3A+P1%2C+P2%2C+and+other+experimental+systems%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Lysogeny at mid-twentieth century: P1, P2, and other experimental systems.</a> J. Bacteriol. 186 (3), 595-600 (2004).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Dietrich, L. E. P., Teal, T. K., Price-Whelan, A., Newman, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox-active+antibiotics+control+gene+expression+and+community+behavior+in+divergent+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Redox-active antibiotics control gene expression and community behavior in divergent bacteria.</a> Science. 321 (5893), 1203-1206 (2008).</li>
<li>Zupančič, D., Terčelj, M., Štrus, B., Veranič, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+obtain+good+morphology+and+antigen+detection+in+the+same+tissue+section%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">How to obtain good morphology and antigen detection in the same tissue section?</a> Protoplasma. , (2017).</li>
<li>Priester, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+visualization+of+microbial+biofilms+by+staining+and+environmental+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Enhanced visualization of microbial biofilms by staining and environmental scanning electron microscopy.</a> J. Microbiol. Methods. 68 (3), 577-587 (2007).</li>
<li>Boyles, J., Anderson, L., Hutcherson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+fixative+for+the+preservation+of+actin+filaments%3A+fixation+of+pure+actin+filament+pellets%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">A new fixative for the preservation of actin filaments: fixation of pure actin filament pellets.</a> J. Histochem. Cytochem. 33 (11), 1116-1128 (1985).</li>
<li>Blackburn, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examination+of+normal+and+abnormal+placentation+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Examination of normal and abnormal placentation in the mouse.</a> Methods Mol. Biol. 136, 185-193 (2000).</li>
<li>Hoffman, E. A., Frey, B. L., Smith, L. M., Auble, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formaldehyde+crosslinking%3A+a+tool+for+the+study+of+chromatin+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Formaldehyde crosslinking: a tool for the study of chromatin complexes.</a> J. Biol. Chem. 290 (44), 26404-26411 (2015).</li>
<li>Jennings, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pel+is+a+cationic+exopolysaccharide+that+cross-links+extracellular+DNA+in+the+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Pel is a cationic exopolysaccharide that cross-links extracellular DNA in the Pseudomonas aeruginosa biofilm matrix.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112 (36), 11353-11358 (2015).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Parafin gömme ve ince kesit doku örnekleri mikro morfolojik yapılarının görüntüleme sağlar ve ökaryotik dokular üzerinde yaygın olarak kullanılan ve bazı başarı ile mikrobiyal örnekleri8 için uygulanan bir tekniktir klasik histolojik ,9. Cryoembedding endojen ve immünfloresan sinyal güçlü saklamak için izin verirken, Morfoloji16daha iyi koruma sağladığından parafin katıştırma genellikle tercih edilir. Bu yöntem uygulama mikrobiyal biyofil...

Çoğu mikroplar için formu biyofilmler kapasitesine sahip, hücre toplulukları birlikte kendi ürettiği matrisler tarafından düzenlenen. Biyofilmler fiziksel kurulumları, birçok türde besin ve substrat hükmün çeşitli rejimleri ile yetiştirilen olabilir. Biyofilm oluşumu için belirli deneyleri tekrarlanabilir çok hücreli yapıları verim eğilimi ve ortak mimariler topluluk veya makroskopik düzeyinde filogenetik çeşitli türler için gözlenir. Mikroplar bir atmosfer altında katı ortamdaki koloniler yetiştirilmektedir, makroskopik Morfoloji için matris üretim kapasitesi hakkında bilgi veriyor ve sık sık diğer özellikleri 1,2,3ile karşılıklı olarak ilişkilendirir. Mikrobiyal kolonileri iç mimarisini de biyofilm özel kimya ve fizyolojisi ile ilgili ipuçları sağlayabilir ama karakterize için zor olmuştur. Cryoembedding ve cryosectioning teknikleri son uygulamaları bakteri kolonileri için görüntüleme ve görselleştirme benzeri görülmemiş çözünürlük 4,5,6' daki belirli özelliklerin etkinleştirdiniz. Ancak, çalışmalar ile hayvan doku parafin gömme cryoembedding 7 ' ye göre Morfoloji üstün koruma sağlar ve bakteri doku 8,9görselleştirmek için kullanılan göstermiştir. Bu nedenle bir protokol fiksasyon, parafin katıştırma ve mikrobiyal koloni biyofilmler ince kesit için geliştirdik. Burada, Pseudomonas aeruginosa PA14 koloni-biyofilm ince kesitler 10,11hazırlanması anlatacağız ama biz de başarıyla bu teknik bakteriler tarafından kurulan biyofilmler başvuran Pseudomonas synxantha, Bacillus subtilis, ve Vibrio cholerae12.
İşlemi parafin gömme ve ince kesit biyofilmler için basit bir mantık uygulanabilir. İlk olarak, biyofilmler Morfoloji işleme sırasında korumak için agar tabakası kaplı. İkinci olarak, kaplı biyofilmler bir sabitleştirici crosslink oluştururlar sular altında ve micromorphology korumak. Bunlar, bir daha kutup solvent ile temizlenir, alkol ile sıvı kaybı ve Sıvı parafin balmumu ile sızmış. Sızmış bir kez örnekleri kesit için balmumu bloklara yerleştirilmiştir. Bölümler kesmek, slaytların üzerine monte edilmiş ve sonra onları daha yerel bir duruma döndürmek için rehydrated. Bu noktadan sonra onlar lekeli veya montaj orta mikroskobik analizlerin yapıldığı için kapalı.
Bu iletişim kuralı ince mikrobiyal biyofilmler histolojik analiz için uygun bölümlerini üretir. Bu yöntem kullanılarak hazırlanan ince bölümleri tarafından ışık mikroskobu görüntüsü zaman koloni biyofilm kümelendirilebilir görülebilir. Biyofilmler Ayrıca medya içeren floresan lekesi için bireysel özellikleri belirli yetiştirilen veya hemen önce (adım 9.5-9,6) Montaj rehidrasyon aşamada lekeli. Son olarak, mikroplar floresan proteinler hücre dağıtım veya gen ifade bu topluluklar içinde in situ raporlama sağlayan bir kurucu veya düzenlenmiş moda üretmek için tasarlanmış. Koloni biyofilm derinlik, hücre dağıtım, matris dağılım, büyüme kalıpları ve kronolojik zamanmekansal gen ekspresyonu belirlemek için bu yöntemler kullandık.

<table><tbody><tr><td>5 3/4" Pasteur pipeti</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-6A</td><td>Üniversite biyostorelarından satın alındı&nbsp;</td></tr><tr><td>Ağar&nbsp;</td><td>Teknova&nbsp;</td><td>A7777</td><td></td></tr><tr><td>Buchner Aspiratör (Vakum) Şişesi&nbsp;</td><td>Pyrex</td><td>5340</td><td>Üniversite biyostorelarından satın alındı&nbsp;</td></tr><tr><td>Kimyasallara Dayanıklı İşaretleme Kalemi</td><td>VWR</td><td>103051-182</td><td>Üretici: Leica</td></tr><tr><td>Clear Tırnak Cilası&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Mağaza satın alınan</td></tr><tr><td>Kongo Kırmızı Gösterge Sınıf</td><td>VWR</td><td>AAAB24310-14</td><td>Üretici: Alfa Aesar</td></tr><tr><td>Coomassie Blue&nbsp;</td><td>VWR</td><td>EM-3340</td><td>Üretici: EMD Millipore</td></tr><tr><td>TRIS Tamponlu Montaj Ortamı (DAPI ile)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>50 247 04</td><td>Üretici: Elektron Mikroskobu Bilimleri</td></tr><tr><td>Gömme Kalıp&nbsp;</td><td></td><td></td><td>3D baskılı şirket içi</td></tr><tr><td>Gömme Kalıbı (ticari)&nbsp;</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>70182</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 200P</td><td>Decon Labs, Inc.&nbsp;</td><td>2701</td><td>Üniversite biyostorelarından satın alındı&nbsp;</td></tr><tr><td>İnce Uçlu Fırça Mağazası</td><td></td><td></td><td>satın alındı, boya fırçası</td></tr><tr><td>Cam Lameller 60x22mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-519-21C</td><td></td></tr><tr><td>Cam Rehidrasyon Mailer&nbsp;</td><td>Ted Pella</td><td>21043</td><td>20 slaytlı postacı&nbsp;</td></tr><tr><td>Histoclear-II, portakal yağı bazlı temizleme maddesi&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>50 899 90150</td><td>Üretici: National Diagnostics&nbsp;</td></tr><tr><td>Histosette, Gömme Casette</td><td>Fisher Scientific</td><td>15 182 701A</td><td></td></tr><tr><td>L-lizin hidroklorür&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP386 100</td><td></td></tr><tr><td>Düşük Profilli Mikrotom Bıçakları</td><td>Fisher Scientific</td><td>22 210 048</td><td>Üretici: Sturkey&nbsp;</td></tr><tr><td>Mikropipet&nbsp;</td><td>VWR</td><td>89080-004</td><td>Promosyon</td></tr><tr><td>Paketi Mikropipet Uçları&nbsp;</td><td>Yorumlar bölümüne bakın</td><td>Yorumlar bölümüne bakın</td><td>p10 (Fisher Scientific, 02 707 469), p200 (VWR, 89079-474), p1250 (VWR, 89079-486)</td></tr><tr><td>Mikrotom&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>905200U/00016050</td><td>Model: HM355S, Üretici: Microm, NON-CATALOG, Satıcı Kataloğu # 905200U/00016050</td></tr><tr><td>Formaldehit, %37 Sulu (Formalin)</td><td>Ricca Chemical</td><td>RSOF0010-500A</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast Xtra (parafin mumu)</td><td>VWR</td><td>15159-486</td><td>Üretici: McCormick Scientific&nbsp;</td></tr><tr><td>Petri Kapları Kare 100x100x15mm</td><td>Laboratuvar Tek Kullanımlık Ürünler&nbsp;</td><td>D210-16</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum klorür&nbsp;</td><td>EMD Kimyasalları&nbsp;</td><td>PX1405-1</td><td>Kurum içinde hazırlanan fosfat tamponlu salin bileşeni&nbsp;</td></tr><tr><td>Potasyum fosfat&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>P380-500</td><td>Kurum içinde hazırlanan fosfat tamponlu salin bileşeni&nbsp;</td></tr><tr><td>Tıraş Bıçakları&nbsp;</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td>Üniversite biyostorelarından satın alındı&nbsp;</td></tr><tr><td>Slayt Isıtıcı&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0865259</td><td>KATALOG OLMAYAN, Satıcı Kataloğu # 12857D</td></tr><tr><td>Sodyum klorür&nbsp;</td><td>VWR</td><td>0241-1KG</td><td>Kurum içinde hazırlanan fosfat tamponlu salin bileşeni&nbsp;</td></tr><tr><td>Sodyum fosfat&nbsp;</td><td>VWR</td><td>BDH9296.500</td><td>, Kurum içinde hazırlanan fosfat tamponlu salin bileşeni&nbsp;</td></tr><tr><td>Suprafrost Histoloji Slaytları&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-2</td><td></td></tr><tr><td>Doku Flotasyon Su Banyosu</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0815797</td><td>Üretici: Ted Pella, Satıcı Kataloğu # 28156-B</td></tr><tr><td>Otomatik Doku İşlemcisi&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>813160U/Q#00009061</td><td>Model: STP120 Doku İşlemcisi</td></tr><tr><td>Tripton&nbsp;</td><td>Teknova&nbsp;</td><td>T9012</td><td></td></tr><tr><td>Maya özü</td><td>Teknova&nbsp;</td><td>Y9010</td><td></td> Serisi</tr></tbody></table>

parafin gömme ve ince mikrobiyal koloni biyofilmler mikroskobik analizlerin yapıldığı için kesit

Paraffin Embedding and Thin Sectioning of Microbial Colony Biofilms for Microscopic Analysis

Parafin katıştırma üzerinden kesit bir genel olarak kurulan ökaryotik sistemlerinde bir tekniktir. Burada biz gömme ve bozulmamış mikrobiyal koloni biyofilmler periosteum parafin balmumu kullanarak kesit fiksasyon için bir yöntem sağlayın. Bu yöntem koloni biyofilmler kullanmak için adapte, agar overlayer ile laminasyon ve her örnek, büyüme substrat olarak muhafaza geliştirilen ve lizin sabitleştirici çözümü eklendi. Bu en iyi duruma getirmeleri örnek saklama ve koruma micromorphological özellikleri geliştirmek. Bu şekilde hazırlanan numune kesit ve ışığı, floresan ve transmisyon elektron mikroskobu ile düşsel ince mükellef bulunmaktadır. Bu teknik, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas synxantha, Bacillus subtilisve Vibrio choleraekoloni biyofilmler için başvurdum. Ayrıntı bu yöntemle oluşturulan örneklerinde görünür yüksek düzeyde muhabir gerilme ile birlikte mühendislik veya belirli boya, kullanımı heyecan verici yorumlara fizyolojisi ve mikrobiyal topluluklar gelişimi sağlayabilir.

Bu yöntem biyofilm ince-neyin farklı Morfolojik özellikleri ve gen ekspresyonu bölgeleri DIC, Floresans mikroskobu ve TEM tarafından yansıması bölümleri oluşturur. DIC görüntüleme 40 X yağı daldırma amacı istimal bazı Morfolojik özellikleri (şekil 2E) göstermek yeterli olabilir, biz o floresan bulduk mikroskobu yapısal ifade floresan protein Mühendisliği suşları sağlar gelişmiş hücre dağıtım örnek (şekil 2B) içinde görselleştirme...

Fiksasyon, parafin katıştırma ve mikrobiyal koloni biyofilmler için ince parça teknikler açıklanmaktadır. Hazır örnekleri, mikroskobu tarafından biyofilm altyapı ve muhabir ifade desenleri görüntülenmeyecektir.

Parafin gömme ve ince mikrobiyal koloni biyofilmler mikroskobik analizlerin yapıldığı için kesit

Sectioning via paraffin embedding is a broadly established technique in eukaryotic systems. Here we provide a method for the fixation, embedding, and ...

Bu prosedürün genel amacı, bozulmamış doğal morfolojiler içinde floresan protein üretimi ile rapor edilen gen ekspresyonunun dağılımını değerlendirmek için kullanılabilecek parafine gömülü biyofilm bölümleri oluşturmaktır. Bu yöntem, mikrobiyal toplulukların çalışmasında, ekzopolimerik maddelerin üretiminde spesifik genlerin ekspresyonunun doğal biyofilm mimarisi bağlamında nasıl dağıtıldığı gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, biyofilm kesitlerinin korunmuş morfolojisi içinde gen ekspresyonunun analizine izin verirken, aynı zamanda farklı özelliklerin boyanması ve konfokal veya elektron mikroskobu gibi yüksek çözünürlüklü görüntüleme gibi alt işlemlere uygun olmasıdır.Metin protokolüne göre agar tripton çözeltisini hazırladıktan sonra, çözeltinin 45 mililitresini 100 milimetreye 100 milimetre karelik bir tabağa dökmek için 50 mililitrelik bir konik tüp kullanın. Agarın yaklaşık 20 ila 30 dakika katılaşmasına izin verin. İlk katmanın üzerine 15 milimetrelik ikinci bir katman dökün, ardından gece boyunca katılaşmasına izin verin ve gerekirse kapaklardaki yoğuşmayı gidermek için tüy bırakmayan bir doku kullanın.Daha sonra, koloni biyofilmle

paraffin-embedding-thin-sectioning-microbial-colony-biofilms-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Işık ve elektron mikroskopi için kesit maya kolonileri izin gömmek için bir yöntem. Bu protokol, bir mantar toplum içinde hücre tiplerinin organizasyon anlayışına yönelik yeni bir araç sağlayan koloniler içinde sporulated hücreleri ve pseudohyphal hücrelerin dağılımı belirliyor.

Maya Colony Gömme Yöntemi

Aşağıdaki videoda, formalin fiksasyonu ve parafin gömme ile bir dokunun morfolojisinin nasıl korunacağı açıklanmaktadır.

Formalinle Sabit Parafin Gömülü (FFPE) Doku Koruma: Doku Morfolojisini İncelemek İçin Bir Yöntem

Kaynak: Bucher, T. ve diğerleri, B. subtilis biyofilmlerini küçük moleküllü biyofilm inhibitörlerinin karakterizasyonu için bir model olarak inceleme yöntemleri. J. Vis. Exp.(2016)Bu video, yüksek çözünürlüklü görüntüleme için olgun bakteriyel biyofilm kolonilerinin hazırlanmasını gösteriyor. Fiksasyon, kurutma, montaj ve metal kaplama adımlarını kapsayarak biyofilm morfolojisini koruma ve görselleştirmeyi içerir.

Morfolojik Analiz için Bakteriyel Biyofilm Kolonilerinin Hazırlanması

Bu videoda, mikroskopi kullanarak mantar hifleri üzerinde bakteriyel biyofilmleri büyütmek ve kalitatif olarak analiz etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bakteriyel biyofilmler sıklıkla mantar yüzeylerinde oluşur ve metabolik işbirliği, rekabet veya avlanma gibi çok sayıda bakteri-mantar etkileşim sürecini içerir.

Mantar Hifleri Üzerinde Biyofilm Oluşturan Bakterileri Görselleştirmek için Numune Hazırlama Yöntemi

Bu çalışma, biyofilm inhibitörlerini ve bunların Bacillus subtilis çok hücrelilik üzerindeki etkilerini incelemek için tekrarlanabilir metodolojilerin geliştirilmesini sunmaktadır.

Araştırma yöntemleri<em&gt; B. subtilis</emKüçük Molekül Biyofilm İnhibitörleri Karakterizasyonu için Bir Model Olarak&gt; Biyofilmler

Bu protokol büyümek ve niteliksel konfokal ve elektron mikroskobu ile mantar hif bakteri biyofilm analiz etmek için yeni bir yöntem açıklanır.

Yeni Bir Yöntem Filamentli Mantar kolonileri ile ilgili Bakteriyel Biyofilmler Niteliksel Çok ölçekli Analizi için kullanılması Eşodaklı ve Elektron Mikroskobu

Candida albicans biyofilmlerinin iç özelliklerini görüntülemek ve ölçmek için, kırılma indisi eşleştirmesi ile açıklığa kavuşturulan sabit bozulmamış numuneler hazırlıyoruz. Daha sonra, optik kesit mikroskopisi biyofilmin tam kalınlığı na rağmen üç boyutlu görüntü verilerini elde etmek için kullanılabilir.

Aydınlatma ve Görüntüleme Candida albicans Biyofilmler

Burada, 100 μm'den birkaç milimetreye kadar değişen sabit üç boyutlu hücre kültürü modellerinin boyama ve hücre altı çözünürlükte görüntülenmesini gerçekleştirmek için ayrıntılı, sağlam ve tamamlayıcı protokoller sunuyoruz, böylece morfolojilerinin, hücre tipi bileşimlerinin ve etkileşimlerinin görselleştirilmesini sağlıyoruz.

Üç Boyutlu Organoid ve Küresel Modellerin Boyama ve Yüksek Çözünürlüklü Görüntülenmesi

Bu protokol, mikoheterotrofik bitki örneklerinin toplanması, sabitlenmesi ve sürdürülmesi için ayrıntılı prosedürler sağlamayı, mikorizal mantarlarla çimlenmiş bitki dokularında ve tohumlarda mantar kolonizasyonunu incelemek için tarama ve iletim elektron mikroskobu, ışık, konfokal ve floresan mikroskobu gibi farklı mikroskopi tekniklerini uygulamayı amaçlamaktadır.

Mikoheterotrofik Bitki Dokularında Mantar Kolonizasyonunu Yorumlamak ve Tohumların Simbiyotik Çimlenmesi için Mikroskopi Teknikleri

Koloni oluşturan hücre (CFC) tayini hematopoetik atalarıdır yarı-katı ortamda koloniler oluşturur in vitro testtir. Koloni morfolojisi, hücre morfolojisi ve akış sitometri bir arada, farklı hematopoetik soy boyunca çoğalırlar ve ayırt atalarıdır yeteneklerini değerlendirmek için kullanılır.

Koloni Oluşturan İnsan Hematopoetik Hücreler Hücre (CFC) Testi

Öğrenin mikrobiyal koloni biyofilmlerin parafin gömme ve ince kesit tekniklerini kullanarak gen ifadesi dağılımını analiz etmeyi. Bu yöntem biyofilm mimarisinin korunmuş morfolojisinde yüksek çözünürlüklü görüntülemeyi mümkün kılar.

Parafin gömme ve ince mikrobiyal koloni biyofilmler mikroskobik analizlerin yapıldığı için kesit

Daha fazla video keşfet