Varisler oluşumu ve kurtarma merkezi nöron aksonlar içinde çalışmak için bir Microbiomechanical sistemi

Bu basınçlı sıvı kurulumunun genel amacı, kültürlenmiş nöronların aksonları boyunca tekrarlanabilir ve tutarlı şişlikler üretmektir. Bu yöntem, yaralanma sonrası nöronlardaki hücre altı morfolojik değişikliklerin arkasındaki mekanizmalar gibi beyin hasarı alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, yöntemin zamanla iyileşen tutarlı ve tekrarlanabilir morfolojik değişiklikler üretmesidir.

Bu laboratuvarda geliştirdiğimiz çok önemli bir teknik. Bunun nedeni, sistemi sadece yeni bir nöronal plastisite formu olarak mekanik strese bağlı akson morfoloji değişikliğini yöneten moleküler mekanizmayı tanımlamak için değil, aynı zamanda sistemi yeni ilaçları ve hafif veya travmatik beyin hasarı için tedavi stratejisini tanımlamak için bir tarama aracı olarak da kullanabilmemizdir. Bu işleme başlamak için, bir veya daha fazla kutu 12 milimetre veya 25 milimetre lamel kutusunu %70 nitrik asit içeren bir cam kabın içine yerleştirin ve lamelleri gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.

Ertesi gün, tüm lamelleri 2,5 litre çift damıtılmış su ile doldurulmuş dört litrelik bir behere aktarın. Lamelleri içeren beheri 100 RPM'de bir saat boyunca çalkalayın ve sallama sırasında beheri tutmak için lastik bantlar kullanmayı unutmayın. Daha sonra, temizlenmiş lamelleri metal kapaklı kuru bir şişeye aktarın.

Lamelleri 225 derecelik bir fırında altı saat pişirin. Ardından, oda sıcaklığına soğumalarını bekleyin ve kullanılana kadar sterilize edilmiş plastik bir kapta saklayın. Şimdi, 24 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna bir lamel yerleştirin.

12 milimetrelik bir lamel üzerine 30 mikrolitre lamel kaplama solüsyonu ekleyin ve döndürün. Daha sonra, her kuyucuğa bir mililitre steril PBS ekleyin. Plaka hemen kullanılabilir veya steril PBS'de dört santigrat derecede bir haftaya kadar saklanabilir.

Diseksiyon gününde, PBS'yi plakadan çıkarın. Havayla kurutun ve plakayı iki ila dört saat UV ışığı altında tutun. Hipokampal nöronları kültür için ayırmak için, proteaz enzim çözeltisini çözün ve kaplama ortamını 37 santigrat derecede önceden ısıtın.

Daha sonra, disseke hipokampusu SLDS ile durulayın. Daha sonra çıkarın ve iki mililitre proteaz enzim çözeltisi ekleyin ve numuneyi 37 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin. Daha sonra, hipokampus eksplantlarını iki kez beş ila 10 mililitre kaplama ortamı ile yıkayın ve beş mililitre kaplama ortamı ekleyin.

Bir mililitrelik plastik uçlu bir pipet kullanarak küçük bir girdap oluşturarak hipokampal eksplantları tek hücrelere ayırın. Çözelti bulanıklaşana ve büyük eksplant parçaları kalmayana kadar oksijen kabarcıklarının oluşmasını önleyerek yaklaşık 40 kez yukarı ve aşağı pipetleyin. Daha sonra, hücreleri üç dakika boyunca yerçekiminin 1.125 katı sıcaklıkta santrifüjleyin.

Süpernatanı, hücreler ortama batırılmış halde çıkarın ve hücreleri 145 mililitre kaplama ortamında yeniden askıya alın. Daha sonra, 24 oyuklu bir plakaya oyuk başına bir mililitre hücre süspansiyonu ekleyin. Kaplama ortamındaki hücreleri 37 santigrat derecede iki ila dört saat inkübe edin.

Daha sonra, kaplama ortamını çıkarın ve yeni bakım ortamıyla değiştirin. İki gün sonra, fibroblast, endotel ve glial hücrelerin büyümesini engellemek için ortamın yarısını bakım ortamında çözünmüş iki mikromolar RSC ile değiştirin. Ardından, hücreleri iki gün boyunca RSC'ye maruz bıraktıktan sonra, ortamı yeni bakım ortamıyla değiştirin.

Hücre morfolojisinin görselleştirilmesi için transfekte etmek için, yapıyı Opti-MEM ortamında ve girdapta mikrolitre başına bir mikrogram olarak stoktan seyreltin. Ardından, lipozom aracılı transfeksiyon reaktifini Opti-MEM ortamında ve girdapta seyreltin. Daha sonra, her kuyucuk için bir inşaat seyreltmesi ve bir transfeksiyon seyreltmesi hazırlayın.

Ardından, yapı ve Opti-MEM ortamı ve transfeksiyon reaktifi ile Opti-MEM ortamı ve girdabın bire bir karışımını hazırlayın. Karışımı oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. 20 dakika sonra, ortamın yarısını her bir oyuktan çıkarın ve bu ortamı temiz bir konik tüpe aktarın.

Tüpü inkübatörde tutun, daha sonra önceki adımda hazırlanan karışımın 100 mikrolitresini kuyucukta kalan ortama ekleyin. Hücrelerin 37 santigrat derecede 20 ila 30 dakika inkübe etmesine izin verin. İnkübasyon sırasında, konik tüpteki ortama bir hacim taze bakım ortamı ekleyin ve karışımı aynı inkübatöre yerleştirin.

İnkübasyonun ardından, transfeksiyon çözeltisini içeren ortamları kuyucuklardan çıkarın ve konik tüpteki eski ve taze bakım ortamının bire bir karışımı ile değiştirin. Bu prosedürde, pipeti yerinde tutmak için mikromanipülatörün vidalı üst kısmına yerleştirin. Mikromanipülatör koluna takılı metal düz üst vidayı, pipetin çekilmemiş ucunu kauçuk borunun takıldığı yerin hemen üzerinde tutacak şekilde vidalayın.

Pipeti, lamelleri içeren nöronun yüzeyi ile 45 derecelik bir açıyla açın. Çiçeklenme filtresini açın. Diyaframı açın ve objektiften gelen floresan bir noktanın görülebildiğinden emin olun.

Mikromanipülatörü kullanarak, pipeti, ucu floresan nokta ile aynı hizaya getirecek bir konuma getirin ve pipeti, hücre kültürü kabının yüksekliğinin hemen üzerinde bir konuma indirin. Yerine oturduğunda, iletilen ışığı açın ve çiçek salkımını kapatın. Cımbız kullanarak, hücreler pipete bakacak şekilde bir lamel hücre kültürü plakasından oda sıcaklığında 2 mililitre Hank tamponu içeren hücre kültürü kabına aktarın.

İnce odak düğmesini ve 20 katlı objektifi kullanarak, hücrelerin yaklaşık dört tam tur üzerindeki bir düzleme odaklanın. Ardından, pipet ucunu, göz merceklerinden görüldüğü gibi odaklanacak ve düzlemin sol orta tarafında olacak şekilde konumlandırmak için mikromanipülatörü kullanın. Pipet yerine oturduktan sonra, mikroskobu ilgilenilen bölgeyi içeren bir düzleme odaklayın.

Yedi divin görüntülenmesinde, GFP transfekte edilmiş fare hipokampal nöronları, şişirme öncesi ve sonrası bir akson ve ardından 10 dakikalık bir iyileşme süresi gösterdi. İşte aynı nöronun hızlandırılmış görüntülemesinin Kymograph'ı. Kırmızı oklar, 30 saniyeden başlayarak 190 mililitre H2O şişirmenin 150 saniyesine kadar oluşan varisleri gösterir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde yapılırsa üç saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü takiben, mekanik stresin nöral ve elektriksel ve kalsiyum sinyalizasyonu, protein kaçakçılığı ve etkileşimler üzerindeki etkileri gibi ek soruları yanıtlamak için tüm hücre kaydı, hızlandırılmış FRET ve TIRF görüntüleme ve kalsiyum görüntüleme gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Geliştirildikten sonra, bu teknik, fototravmatik beyin hasarı araştırmacılarının, canlı nöronlarda aksonal varis oluşumunun altında yatan moleküler mekanizmaları açıklamalarının yolunu açtı.

Bu videoyu izledikten sonra, merkezi nöronların mekanosensasyonlarını incelemek için deneylerin nasıl yapılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.