Name: Varisler oluşumu ve kurtarma merkezi nöron aksonlar içinde çalışmak için bir Microbiomechanical sistemi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Öğrenin basınçlı sıvı yöntemiyle kültürlenmiş hipokampal nöronlarda tekrarlanabilir akson şişlikleri oluşturmayı. Bu teknik mekanik stres altında nöronal plastisite ve beyin hasarı tedavileri için mekanizmaları açıklamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Tüm hayvan deneyleri Ulusal kurumları, sağlık hayvan kullanım kılavuzlarınıza uygun olarak yapılmıştır. Bu eser kısmen C. Gu için Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01NS093073 ve R21AA024873) gelen hibe tarafından desteklenmiştir.

Tüm yöntemler aşağıda açıklanan kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Ohio State Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.
1. Coverslip hazırlık
<ol><li>Bir veya daha fazla kutu 12 mm veya 25 mm coverslips % 70 nitrik asit içeren bir cam kabı yerleştirin ve oda sıcaklığında coverslips gecede kuluçkaya. Not: 12 mm coverslips olarak aynı ölçek 25 mm coverslips yıkama yok. Onları ayrı ayrı yıkamak iyidir.</li>
	<li>GKD2O 2.5 L ile dolu bir 4 L kabı içine tüm coverslips transfer ve 1 h 100 RPM için coverslips içeren kabı sallamak. Lastik bantlar kabı sallayarak sırasında tutmak için kullanın. Durulama taze 2.5 L GKD2O ile dört kez tekrarlayın.</li>
	<li>Temizlenmiş coverslips metal bir kapak ile kuru bir şişesi aktarın. Coverslips 225 ° c 6 h için fırında pişirin ve oda sıcaklığına kadar soğutmak izin. Not: 25 mm coverslip için kırılma eğilimli. Coverslips tek tek ayrı ve kurutma sonra onları bir fırında pişirin.</li>
	<li>Kurutulmuş ve temizlenmiş coverslips oda sıcaklığında bir steril plastik kap içinde kullanımı kadar saklayın.</li>
	<li>
Coverslips aşağıdaki gibi kat:
	<ol>
<li>Taze kaplama çözümde bir santrifüj tüpü hazırlayın.</li>
		<li>Her coverslip 24-iyi (veya 6-şey) plaka bir kuyunun içine yerleştirin. 30 (-100) µL coverslip kaplama çözüm (Tablo 1) bir 12 mm (veya 25 mm) coverslip ve girdap üzerine yerleştirin. 1 mL steril fosfat tamponlu tuz (PBS, doku kültürü sınıf) kuyuya ekleyin. Bu tabakları hemen kullanılan ya da steril PBS için bir hafta içinde 4 ° C'de depolanan.</li>
		<li>Diseksiyon günü, PBS kaldırın. Kuruması ve UV ışık (30W) için 2-4 h altında tabak yerleştirin. Not: Son adım bir hücre kültür laminar akış başlıklı UV ışığı ile tamamlanmalıdır. Kapıyı kapüşonlu coverslips kurutma için hava akımı sağlamak için biraz kaldırdı.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. diseksiyon, ayrışma ve hamile Mouse/fare Hipokampal Neurons kültür
<ol><li>
Diseksiyon ve Hipokampal nöron kültürü için ayrılma
	<ol>
<li>Proteaz enzimi çözüm (3 mg/mL proteaz 23 SLD'ler, Tablo 1içinde) çözülme ve kaplama öncesi sıcak ortam (Tablo 2) 37 ° C'de</li>
		<li>Hippocampus teşrih ve önceki yayın14' te açıklanan yöntemlere göre SLD ile durulayın. Not: Dört hippocampi bir 24-şey veya bir 6-şey plaka için yeterince hücre sağlar.</li>
		<li>SLD'ler kaldırmak, proteaz enzimi çözüm 2 mL ekleyin ve 37 ° c, % 5 CO2 15dk için örnek kuluçkaya.</li>
		<li>Hippocampus explants 5-10 mL kaplama orta ile iki kez yıkayın. Orta kaplama 5 mL ekleyin. Hipokampal explants Tek Kişilik hücrelere bir pipet ile 1 mL plastik ucu kullanarak küçük bir girdap oluşturarak ayırmak. Yukarı ve aşağı yaklaşık 40 kez, pipet oksijen kabarcıkları, oluşumu çözüm bulutlu olur ve explant büyük no adet kalması kadar uzak durmaya. Not: yıkama sırasında bazı medya bırakmayı unutmayın, Hipokampal explants tüm süreç sırasında ortamda batık kalmalıdır.</li>
		<li>1.125 x g 3 dk. süpernatant hücreleri ile medyada batık Kaldır, hücreleri santrifüj kapasitesi. Medya kaplama 145 mL hücrelerde resuspend. 1 mL/iyi hücre süspansiyon 24-şey plaka (3 mL/iyi bir 6-şey plaka) ekleyin. Not: medya kaplama 145 mL düşük hücre yoğunluğu olan bir hücre süspansiyon üretmek için kullanılır. Bu birim hücre kaplama altı 24-şey plakaları, sekiz 6-şey plakaları veya yapılacak deneyler bağlı olarak 24 - veya 6-da plakaların çeşitli kombinasyonları sağlayacaktır. 24-şey plaka her şey-ecek-si olmak 3 x 104 hücreleri9.</li>
		<li>Kaplama medya 37 ° c, % 5 CO2 için 2-4 h, hücrelerde kuluçkaya sonra tüm kaplama medyayı çıkarın ve taze bakım ortamı ile değiştirin.</li>
		<li>2 gün sonra (2 gün vitro, 2DIV), medya yarısı ile 2 yerine µM Ara-C (arabinosylcytosine) çözünmüş bakım medya hangi fibroblastlar, endotel ve gliyal hücreler büyümesini engeller. Ara-C hücrelere iki gün boyunca maruz kalmaları ortamı taze bakım medya ile değiştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Transfection hücre morfolojisi görselleştirme için Not: yeşil flüoresan protein (GFP), sarı floresan protein (YFP), mCherry, bireysel nöronların morfolojisi aydınlatmak için vb floresan yapıları içeren hücreleri Transfect.<ol>
<li>Yapıları (1 µg/µL) stoktan Opti-MEM medya (Opti-MEM Medya 50 µL inşa 0.8 µg) ve girdap sulandırmak. 1 yapı seyreltme her şey için hazır olun. Not: 24-şey plaka 0.8 µg Opti-MEM Medya 50 µL inşa gerekir. 6-şey plaka yapı 150 µL Opti-MEM medya 2.4 µg gerektirir.</li>
		<li>Lipozom aracılı transfection reaktif Opti-MEM medya (50 µL Opti-MEM medya transfection reaktif 1,5 µL) ve girdap sulandırmak. 1 transfection seyreltme her şey için hazır olun. Not: 24-şey plaka 50 µL Opti-MEM medya transfection reaktif 1,5 µL gerektirir. 6-şey plaka transfection reaktif Opti-MEM medya 150 µL içinde 4,5 µL gerektirir.</li>
		<li>1:1 karışımı (100 µL) Opti-Mem medya ve transfection reaktif Opti-MEM medya ve girdap içinde yapı, hazır olun. Karışımı, oda sıcaklığında 20 dk için kuluçkaya. Not: iyi yaklaşık 100 µL yapý, transfection reaktif ve Opti-MEM medya 24-şey plaka (6-şey plaka için 300 µL) kullanarak, içeren çözüm olmalı.</li>
		<li>Ve bu ortamı temiz konik tüp içine transfer medya (24-şey plaka, 6-şey plaka için 1,5 mL için 500 µL) yarısı her kuyudan çıkarın. Bu tüp da kuluçka makinesine tutun. Daha sonra 100 µL karışımı (Adım 2.2.3) iyi kalan medya ekleyin. 20-30 dk 37 ° C'de kuluçkaya hücrelere izin.</li>
		<li>Kuluçka (Adım 2.2.4) sırasında konik tüp (Adım 2.2.4) medyada bir birim taze bakım medya ekleyin. Karışım aynı İnkübatör (37 ° C ve % 5 CO2) yerleştirin.</li>
		<li>Kuluçka kuyulardan transfection solüsyon içeren tüm medyayı çıkarın ve 1:1 karışımı eski ve yeni bakım medya konik tüp (Adım 2.2.5) ile değiştirin. Not: yapıları boyutuna bağlı olarak, hücre içinde 12 h ifade başlamak; yapıları, en yüksek ifade ulaşılmadan 3-4 gün daha büyük yapıları için gerekli olabilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. şişirme pipet aparatı ayarlama
Not: Bu kurulum için beş temel bileşeni vardır: cam pipet, tüp, şırınga, micromanipulator ve tampon (Hank'in). Fizyolojik olarak ilgili tuz konsantrasyonları vardır herhangi bir arabellek bu kurulum içinde kullanılabilir.
<ol><li>45-µm-çapı açılış ipucu Tablo 3' te bir micropipette çektirmenin ve teknik özellikleri kullanma civarında olması borosilikat pipet çek. Not: Bulunan 45 µm deneysel koşullar altında açılış pipet çapları için uygun bir boyutudur. Açılış boyutu küçük farklılıklar sonuçları önemli ölçüde etkilememelidir. Bu sayıdan büyük gidiş hala pipet boru üzerinden bağlandığı şırınga yüksekliğini ayarlayarak varisler indüksiyon için çalışması gerektiğini unutmamak gerekir, ama bu ayarlamayı basınç değeri gerektirir.</li>
	<li>Pipet un çekti sonuna ince lastik boru içine yerleştirin. Not: Boru duvar ince ve sıvı direnci şırınga yüksekliğini doğrudan pipet ile ihmal edilebilir direnç akan sıvı basıncı orantılıdır sağlanması, en aza indirmek için katı olmalıdır. Yaklaşık 0,6 m uzunluğunda daha en aza indirmek daha direniş tüp artık olmalıdır.</li>
	<li>10 mL plastik enjektör çevirmek mümkün bir vana ile bir bağlayıcıyla hortumunun diğer ucunu bağlayın. Not: Pipet akan kabul edilen basınç için doğru bir ölçü sağlamak için sürekli, ölçülebilir bir yükseklik yapılacak plastik şırınga ihtiyacı var. 190 mm yüksekliğe kullanılmıştır, beri bu en az basınç sağlar fakat güvenilir bir şekilde aksonlar varicosities neden olmaktadır. Eğer basınç coverslip yüzeyinden ayırmak hücreleri neden diğer yükseklik değerleri de kullanılabilir. Bu deney boyunca aynı ayarı kullanmak için tavsiye edilir.</li>
	<li>Pipet pipet tutmak için micromanipulator vida tepesine yerleştirin. Böylece hemen üzerinde nerede alıpkendi bağlı olduğu pipet un çekti sonu tutan micromanipulator koluna bağlı metal, düz tepesinde vida canı cehenneme. Açı nöron içeren coverslips yüzeyi ile 45° açıyla pipet. Not: pipet alıpkendi constricting olmadan tutulabilen böylece micromanipulator inşa edilmelidir. Micromanipulator doğru hücre aralığında pozisyon x, y ve z yön pipet hareket izin vermesi gerekir. Bir fotoğraf cihazları yanı sıra grafik (şekil 1) sağlamıştır.</li>
	<li>Bir floresan Filtresi'ni açmak, diyafram açın ve floresan bir yer-ebilmek var olmak seen amacı ile geliyor emin olun. Micromanipulator kullanarak, pipet ucu ile floresan nokta kadar hatları ve pipet hücre kültür çanak (35 mm x 10 mm) yüksekliği yukarıda sadece bir konum içine daha düşük bir pozisyon içine taşıyın. Bir kez o pozisyonda, iletilen ışığı ve floresan açmak.</li>
	<li>Cımbız kullanarak, bir coverslip (hücrelerle pipet doğru yukarı bakacak şekilde) hücre kültür plaka Hank'in arabellek oda sıcaklığında yaklaşık 2 mL içeren hücre kültür çanak ekleyin.</li>
	<li>Coverslip kapsamı üzerine içeren kültür çanak yerleştirin.</li>
	<li>İyi odak düğmesi ve 20 X objektif kullanarak, bir uçağa Hücreleri (yaklaşık 0.4 mm) yukarıda yaklaşık dört tam döner odaklan. Böylece odaklanmıştır ve merkezinde, uçağın göz parçaları görüldüğü gibi sol tarafta pipet ucu konumlandırmak için micromanipulator kullanın. Not: Dendrites onlar kaynaklanan hücre organ olarak aynı çerçevede olmalıdır projeksiyonları vardır. Aksonal varicosities ikna etmek için bir daha uzun projeksiyonlar hücre gövdesinden medial ve distal aksonlar takip etmeli.</li>
</ol>4. bir gerilebilir membran sistemi kullanan pipet Basınç Kalibrasyonu
<ol><li>Şişirme pipet aparatı ile tam olarak aynı parametreleri içeren bir microfabricated silikon membran (çapı 500 µm) ve 50 µm kalınlığında bir sistemde yukarıda açıklandığı gibi kurulum ve membran yüzeyinin mikroskop odak. Not: Bu sistem küçük basınç değerleri ölçmek için tasarlanmıştır ve sistem açıklaması10önce yayımlanmıştır. Bu ölçüm yalnızca bir kez şişirme tam aynı ayarı kullanıldığında deneyler şişirme için yapılması gereken.</li>
	<li>Mikroskop merkezleri arasında ölçülen microdots (çapı 4 µm) ve 10 µm ayrı, diziler üzerinde odaklanın. Kapatma vanasını açın ve pipet dışarı akışı için sıvı sağlar. Sıvı basıncını cevaben membran saptırma confocal mikroskopla inceleyin.</li>
	<li>Membran saptırma ile ilişkili karşılık gelen basınç belirlemek için doğrusal bir model kullanmak. Not: Süre son bir çalışmada bulundu ki bir saptırma w-3.143 = ± 0,69 µm 190 mm şırınga yükseklik için elde edilen, bu fizyolojik ve patolojik aralığı içinde olsa geçerli pipet kurulumundan 0,25 ± 0,06 nN/µm2 baskı üretilen şırınga yüksekliği tek belirleyici değil. Diğer faktörler açma, konumlandırma pipet (mesafe ve açı) hücreleri ve hatta esneklik tüp4,10göre pipet ucu da dahil olmak üzere tam basınç değeri de, nöronlar üzerinde etkiler.</li>
</ol>5. Varicosities ikna etmek için şişirme
<ol><li>Pipet konumda olduğunda, mikroskop ilgi bölgesi içeren bir uçakta odaklan. Sağ alan şişirme dışında iken hücreleri ve işlemleri (kamera canlı yakalama tarafından görüldü) görüntüleme alanı şişirme alaný sol yarısında yerleştirin. Not: akson geniş akıbet ve nöronların dendrites nedeniyle, bu bir nöron tüm işlemler aynı şişirme alanı içinde olduğunu düşüktür. Şişirme yerel etkisi incelenmesi sağlayan bu sistem, aslında bir avantajı bu. Varicosities ikna etmek için kullanılan şişirme iki tür vardır: uzun süre şişirme ve nabız şişirme.</li>
	<li>
Şişirme
	<ol>
<li>Uzun süre şişirme<ol>
<li>Kültürlü nöronlar4içeren coverslip yukarıda 190 mm yükseklikte şırınga getirin. İlgi alanı hızlandırılmış görüntüleme açık nöronal Morfoloji açığa bir en iyi duruma getirilmiş çekim hızı ile başlar. En az 15 kare taban çizgisi olarak 2 s aralıklarla (30 s toplam) yakalama. Aralığı dayalı deneme olarak ayarlanabilir. Karede 16, şırınga çevirmek mümkün vanasını açın ve sıvı akışı için 75 kare izin (150 s). Sıvı akışı durur böylece çerçeve 75, kapak kapat. Video yakalama durdurmak. Not: büyük nöronlar formu varicosities için daha uzun sürer, ancak bu nöronlar içinde aksonal varicosities 7-9 DIV içinde 5-10 lar, ikna etmek.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Nabız (2 s süresi) şişirme<ol>
<li>Şırınga uygun yükseklikte (190 mm) konumlandırın. Hızlandırılmış görüntüleme başlar ve en az 15 çerçeveleri yakalamak (30 s) 2 s aralıkta. Karede 16, şırınga Vanayı aç ve sıvı akışı izin verin ve sonra tekrar kapak açmadan önce 2 s. bekle 5-20 s (bağlı olarak test edilmesi için frekans) ardından vanayı kapat. Açılış ve kapanış Vana sıvı bakliyat oluşturmak ve toplam 150-300 s. kurtarma sahne yakalamak için 20 min için Imaging hızlandırılmış devam için devam için yineleyin. Not: Ne zaman aralığı 10'dan daha uzun s, bakliyat büyük ölçüde daha az varicosities ikna etmek. 20 s aralıkta, hiçbir varicosities bakliyat4tarafından indüklenen. Güvenilir ve tutarlı varisler formasyonu elde etmek için bu şırınga yüksekliği yaklaşık 190 mm. şırınga yüksekliği olmalıdır ve sıvı basıncı hücreleri coverslip yüzeyden ayırma başladığı bir noktaya artırılmalıdır değil tavsiye edilir.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Kullanım bir gün önce 10 mL % 70 hakkında akan tarafından kurulum (pipet, boru ve şırınga) temiz up ile etanol. Etanol yıkayın, sistem o günkü kullanmak için hazırlamak için set-up Hank'in arabellek (veya istediğiniz arabellek) 10 mL akışı. Gün için bitirme deneyler temizledikten sonra set-up olarak etanol ile gecede kirletici gelişimini önlemek için daha önce açıklanan.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. övgü yöntemleri
Not: Şişirme tahlil çeşitli giriş bölümünde açıklanan farklı teknikleri ile kombine edilebilir. Burada, yüksek çözünürlüklü Floresans timelapse görüntüleme, kalsiyum görüntüleme ve kurtarma deneyleri gibi şişirme tahlil ile birlikte, en sık kullanılan temel teknikleri üzerine odaklanmıştır. Bunlar aşağıda ele alınmıştır.
<ol><li>
Aşağıdaki iletişim kuralı takip ederek yüksek çözünürlüklü floresan hızlandırılmış görüntüleme kuralları
	<ol>
<li>Nöronlar bir 100 X Petrol mercek ile içinde fluorescently öğesini proteinlerin hareketlerini takip. Nöronlar sahip uygun cDNA yapı transfected. İçin 150 çerçeveleri yakalamak (Toplam 300 s) 2 s aralığı ile. Not: Bazen, aynı anda birden fazla protein fluorescently öğesini hareketi görüntüye birden çok renkli hızlandırılmış görüntüleme yapılır.</li>
		<li>Bir kymograph video yazılım yakalama veya aracılığıyla ImageJ (NIH) oluşturur. Not: Hız ve yön seyahat kymograph kullanarak belirlenebilir. * Emin soma bölgeden yatıyor yönünü unutmamak yakalanması. Aksonal ipucu soma uzak seyahat anterograd soma doğru seyahat retrograd, iken.</li>
		<li>Tekrar bu işlemi şişirme, veya kymograph görüntü yakalama sırasında şişirme tahlil kullanılarak oluşturulabilir. Not: mitokondri ve sinaptik proteinler aksonal taşımacılığının şişirme etkileri bir son kağıt4' te gösterilmiştir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Kalsiyum görüntüleme
	<ol>
<li>1 µL (için 24-şey plaka) ya da 5 mm Fluo-4 (6-şey plaka için) 3 µL eklemek AM medya bir şey ve 30 dk 37 ° C'de kuluçkaya kültürüne.</li>
		<li>1 mL Hank'in arabellek iki kez hücrelerle yıkayın. Not: Yüklenen nöronlar FITC filtre kümesi yeşil Floresans yayarlar. Loci hücre içinde kayda değer kalsiyum bölgeleri gösterir. Şişirme ile birleştirildiğinde, yoğunluğu (iç kalsiyum düzeyinde artış) bir artış görülebilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Varisler kurtarma Not: Hemen şişirme bir deney, bir 20 dk kurtarma deneme yapılabilir.<ol>
<li>300 kare için çekim (1.200 s) 4 s aralığı ile. Not: bir hücre ile YFP/mCherry/GFP çözünür transfected makul ses seviyelerinde (% 50'den az) görüntüleme oturum bitmeden kurtarma göstermelidir. Aksonal kurtarma bir dizi faktöre, kültürlü nöronlar4gelişim aşaması gibi bağlıdır. Bu da yüksek çözünürlüklü floresan görüntüleme ve yukarıda açıklanan kalsiyum görüntüleme ile kombine edilebilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Nikić, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reversible+form+of+axon+damage+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+and+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis.</a> Nat. Med. 17, 495-499 (2011).</li>
<li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+axon+degeneration+after+injury+and+in+development+by+the+endogenous+calpain+inhibitor+calpastatin%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Regulation of axon degeneration after injury and in development by the endogenous calpain inhibitor calpastatin.</a> Neuron. 80 (5), 1175-1189 (2013).</li>
<li>Debanne, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Information+processing+in+the+axon%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Information processing in the axon.</a> Nat. Rev. Neurosci. 5, 304-316 (2004).</li>
<li>Gu, Y., Jukkola, P., Wang, Q., Esparza, T., Zhao, Y., Brody, D., Gu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarity+of+varicosity+initiation+in+central+neuron+mechanosensation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Polarity of varicosity initiation in central neuron mechanosensation.</a> J Cell Biol. 216 (7), 2179-2199 (2017).</li>
<li>Chung, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mild+axonal+stretch+injury+in+vitro+induces+a+progressive+series+of+neurofilament+alterations+ultimately+leading+to+delayed+axotomy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Mild axonal stretch injury in vitro induces a progressive series of neurofilament alterations ultimately leading to delayed axotomy.</a> J. Neurotrauma. 22 (10), 1081-1091 (2005).</li>
<li>Staal, J. A., Dickson, T. C., Chung, R. S., Vickers, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclosporin-A+treatment+attenuates+delayed+cytoskeletal+alterations+and+secondary+axotomy+following+mild+axonal+stretch+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Cyclosporin-A treatment attenuates delayed cytoskeletal alterations and secondary axotomy following mild axonal stretch injury.</a> Dev. Neurobiol. 67 (14), 1831-1842 (2007).</li>
<li>Tang-Schomer, M. D., Johnson, V. E., Baas, P. W., Stewart, W., Smith, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+interruption+of+axonal+transport+due+to+microtubule+breakage+accounts+for+the+formation+of+periodic+varicosities+after+traumatic+axonal+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Partial interruption of axonal transport due to microtubule breakage accounts for the formation of periodic varicosities after traumatic axonal injury.</a> Exp. Neurol. 233 (1), 364-372 (2012).</li>
<li>Donkin, J. J., Vink, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+cerebral+edema+in+traumatic+brain+injury%3A+therapeutic+developments%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of cerebral edema in traumatic brain injury: therapeutic developments.</a> Curr Opin Neurol. 23 (3), 293-299 (2010).</li>
<li>Gardner, A., Jukkola, P., Gu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelination+of+rodent+hippocampal+neurons+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Myelination of rodent hippocampal neurons in culture.</a> Nat Protoc. 7 (10), 1774-1782 (2012).</li>
<li>Wang, Q., Zhang, X., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://iopscience.iop.org/article/10.1088/0960-1317/23/1/015002">Micromechanical stimulator for localized cell loading: fabrication and strain analysis.</a> J. Micromech. Microeng. 23, 015002(2013).</li>
<li>Lu, Y. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viscoelastic+properties+of+individual+glial+cells+and+neurons+in+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Viscoelastic properties of individual glial cells and neurons in the CNS.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103 (47), 17759-17764 (2006).</li>
<li>Elkin, B. S., Azeloglu, E. U., Costa, K. D., Morrison, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+heterogeneity+of+the+rat+hippocampus+measured+by+atomic+force+microscope+indentation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Mechanical heterogeneity of the rat hippocampus measured by atomic force microscope indentation.</a> J. Neurotrauma. 24 (5), 812-822 (2007).</li>
<li>Franze, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurite+branch+retraction+is+caused+by+a+threshold-dependent+mechanical+impact%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Neurite branch retraction is caused by a threshold-dependent mechanical impact.</a> Biophys. J. 97 (7), 1883-1890 (2009).</li>
<li>Campàs, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+cell-generated+mechanical+forces+within+living+embryonic+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantifying cell-generated mechanical forces within living embryonic tissues.</a> Nat. Methods. 11 (2), 183-189 (2014).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu microbiomechanical tahlil düz ön işlemdir. Eğer onun adımları dikkatlice yürütülen güvenilir sonuçlar üretecektir. Uygun olmayan şekilde gerçekleştirdiyseniz, başarılı veri toplama engel olacak çeşitli anahtar adımlar vardır. Akıntıya karşı kritik adımlara başlamadan şişirme uyarıcı gerçek uygulamanın. Dikkatli diseksiyon, kültür ve bakım birincil nöron kültürünün olağanüstü vardır. Kültürlü nöronlar sağlıklı değilse, onlar zaten stres için astarlanmalıdır bu yana sürekli olarak, tepki değil. Kültür, ilk kurulum ve va...

Varisler oluşumu veya şişlik/boncuk, akson, boyunca önemli bir özelliğidir birçok bozuklukları veya yaralanma multipl skleroz, Alzheimer hastalığı, Parkinson hastalığı, dahil olmak üzere merkezi sinir sisteminin gözlenen ateş ve travmatik beyin yaralanması1,2. Aksonal varicosities aksiyon potansiyeli yayma ve sinaptik iletimi3önemli fizyolojik etkileri rağmen varicosities nasıl oluşturulduğunu bilinmemektedir. Son zamanlarda, yeni kurulan microbiomechanical tahlil kemirgenler kültürlü Hipokampal neurons kullanarak, mekanik uyaranlara varicosities son derece ilginç özellikleri ile bu nöronlar içinde tetikleyebilir buldum. İlk olarak, varisler indüksiyon hızlı (< 10 s) ve bu işlem beklenmedik bir şekilde geri alınabilir. İkinci olarak, varisler başlatma basınç şişirme gücüne bağlıdır: yüksek basınç, hızlı başlatma. Üçüncü olarak, varisler başlatma nöronal yaş üzerinde bağlıdır. Genç nöronların aksonlar mekanik stres, büyük nöronlar için göre daha duyarlı görünür. Dördüncü olarak, süre dendrites ve ilk axon kesimleri bu nöronların Hipokampal nöronlar akson boyunca varicosities şeklinde değişiklik yok aynı şişirme koşul altında görüntüler. Böylece, bizim çalışma nöronal polarite roman bir özelliği ortaya koydu. Bu bulgular vitro sistemiyle fizyolojik ilgilidir. Vivo modeli hafif travmatik beyin hasarı (mTBI) kullanarak, biz aksonal varicosities hemen sonra Kapat-kafatası etkisi, bizim vitro ile tutarlı fareler somatosensor korteks multifokal bir biçimde geliştirilen gösterdi sonuçları4. Boyama ve görüntüleme mTBI farelerin sadece bir görüntüsü nöronal morfolojik değişiklikler sağlamak, in vivo performans beri nöronal Morfoloji hızlandırılmış görüntüleme sırasında bir mekanik etkisi hala mümkün değil unutmamak önemlidir.
Bu sıvı şişirme sistem sadece mekanik stres kaynaklı varisler oluşumu ile ilgili benzersiz özellikleri yakalamak için ama aynı zamanda temel mekanizması belirlemek için izin verdi. Farklı hücre dışı çözümler, blokerler ve mechanosensitive iyon kanalları ve hücresel Elektrofizyoloji farklı adayların açacakları test ederek, biz geçici reseptör potansiyel katyon kanal bu alt familya V üye 4 (TRPV4) tespit Ca2 + ve Na+ geçirgen ve Şişirme tarafından aktive kanal aksonal varisler oluşumu4sırasında ilk mekanik stres algılamak için esas olarak sorumludur. Bu daha da bir siRNA nakavt yaklaşım ile doğrulandı. Birlikte, Hipokampal nöron kültürü ile hazırladığımız bu yeni tahlil sistem ele alındığında, diğer teknikleri ile birlikte özellikle merkezi nöronların micromechanical özelliklerini çalışmak için son derece değerlidir.
Biz kurduk bu micromechanical sistemi benzersizdir ve birkaç önemli yönü daha önce var olan sistemleri farklıdır. İlk olarak, bu sistemde nöronlar uçak mekanik stres sıkıştırma ve yamultma şekillerde deneyim. Mekanik etkisi sırasında nöronal süreçleri coverslip yüzeye bağlı kalır ve hareket etmiyor. Bu deneysel diğer esas olarak bükme ve uçak-germe dahil sistemleri (veya gerilim) farklıdır, örneğin, birlikte aksonlar saptırma gibi dizeleri5,6 taşıyarak veya micropatterned üzerinde yetiştirilen aksonlar yayarak kanalları ve gerilebilir membranlar7,8. Ayrıca, aksonlar varicosities da içinde indüklenen her ne kadar bu deneyleri gibi sistemimizde sıvı şişirme, bu ayarları sürecinde (üzerinden birkaç saat6,7,810 dk) çok daha fazla zaman alır ve görünür geri alınamaz. Son olarak, sistemimiz yerel sıvı şişirme kullanarak varisler oluşumu uzamsal özelliklerinin incelenmesi sağlar (örneğin., dendrites, dendritik omurgalar, soma, aksonlar ilk kesimleri, aksonlar terminalleri), zamansal özellikleri yanında. Bu sistemi kullanarak, biz birkaç beklenmedik ve benzersiz özellikleri aksonal varisler oluşumu, özellikle hızlı başlangıçlı, yavaş reversibility ve akson-dendrite polarite keşfetti.
Biz bu yazıda görüşmek sistem moleküler ile birçok teknikleri uyumludur ve hücre biyolojisi. Örneğin, nöronal morfoloji ve fonksiyonu mekanik stres etkileri çalışmaya, miyelin coculture ile birlikte, düşsel floresan rezonans enerji transferi (FRET) ve toplam iç yansıma floresan (TIRF), hızlandırılmış kullanılabilmesi için Kalsiyum görüntü ve yama kelepçe kayıt. Bu yazıda, sistemin çekirdek bileşenlerinin odaklanacağız. Hipokampal nöron kültürü, sıvı şişirme Kur, aksonlar taşıma için yüksek çözünürlüklü hızlandırılmış görüntü ve kalsiyum görüntüleme hakkında adım adım aşağıda gösterilmiştir.

<table><tbody><tr><td>12 mm lameller&nbsp;</td><td>Warner Instruments&nbsp;</td><td>64-0702</td><td>24 kuyulu plaka için&nbsp;</td></tr><tr><td>25 mm lameller&nbsp;</td><td>Fisher Bilimsel&nbsp;</td><td>12-545-102&nbsp;</td><td>6 oyuklu plaka için&nbsp;</td></tr><tr><td>Asetik asit</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>A38-212</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-lizin</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>Sıçan kuyruğu kollajeni&nbsp;</td><td>Roche&nbsp;</td><td>11 179 179 001&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>10X PBS&nbsp;</td><td>Ulusal Teşhis&nbsp;</td><td>CL-253</td><td></td></tr><tr><td>Na2SO4</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>S373-500</td><td></td></tr><tr><td>K2SO4</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>P304-500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>Fisher Bilimsel&nbsp;</td><td>BP410-500</td><td></td></tr><tr><td>D-glikoz&nbsp;</td><td>Fisher Bilimsel&nbsp;</td><td>D16-500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher Bilimsel&nbsp;</td><td>SS255-1</td><td></td></tr><tr><td>Proteaz enzimi&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P4032</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>26140</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum piruvat ve nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamin &</td><td>Gibco&nbsp;</td><td></td><td></td>25030081</tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin 100x (P / S)</td> <td>Gibco&nbsp;</td><td></td><td></td>15140122</tr><tr><td>MEM Earle'ün Tuzları&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>11090</td><td></td></tr><tr><td>B27 takviyesi&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Nörobazal&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Arabinosilsitozin (Ara-C)</td> <td>Sigma&nbsp;</td><td>147-94-4</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM medya&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>Lipofektamin 2000</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>1854313</td><td>transfeksiyon reaktifi&nbsp;</td></tr><tr><td>Borosilikat çubuklar&nbsp;</td><td>Dünya Hassas Aletler A.Ş. &nbsp;</td><td></td><td>Pipeti şişirmek için PG52151-4&nbsp;</td></tr><tr><td>kauçuk boru & nbsp;</td><td>Fisher Bilimsel&nbsp;</td><td>14-169-1A</td><td></td></tr><tr><td>10cc plastik şırınga ve piston</td><td>Becton Dickinson&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mikromanipülatör&nbsp;</td><td>Sutter Aletleri&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl&nbsp;</td><td>Fisher Bilimsel&nbsp;</td><td>S640-3</td><td></td></tr><tr><td>KCl&nbsp;</td><td>Fisher Bilimsel&nbsp;</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>C70-500</td><td></td></tr><tr><td>Hücre kültürü kabı (35 mm x 10 mm)</td><td>Corning&nbsp;</td>Kalsiyum görüntüleme için <td>3294</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4</td><td>Moleküler Problar</td><td>F14201</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Mito-YFP yapısı&nbsp;</td><td>Takara Biyo A.Ş. & nbsp;</td><td></td><td>hücre transfeksiyonu için&nbsp;</td></tr><tr><td>YFP-N1 yapısı&nbsp;</td><td>Takara Biyo A.Ş. & nbsp;</td><td></td><td>hücre transfeksiyonu için&nbsp;</td></tr><tr><td>Model P-1000 Alevli/Kahverengi Mikropipet çektirmesi&nbsp;</td><td>Sutter Aletleri&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse TE2000-U Mikroskob&nbsp;</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plan Fluor ELWD 20x objektif ve nbsp; &nbsp;</td><td>Nikon</td><td>062933</td><td>objektif&nbsp;</td></tr><tr><td>Apo TIRF 100x/1.49 yağ lensi&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>MRD01991</td><td>objektif&nbsp;</td></tr></tbody></table>

varisler oluşumu ve kurtarma merkezi nöron aksonlar içinde çalışmak için bir microbiomechanical sistemi

A Microbiomechanical System for Studying Varicosity Formation and Recovery in Central Neuron Axons

Aksonal varicosities akson heterojenite yüksek derecesi ile Miller boyunca genişlemiş yapılardır. Onlar sadece beyin nörodejeneratif hastalıklar veya yaralanma ile ama aynı zamanda normal beyin bulunur. Burada, biz varisler oluşumu ve türdeş olmayan protein kompozisyon yöneten mekanizmalarını anlamamızı sağlayan hızlı, güvenilir ve ters aksonal varicosities, ikna etmek için bir yeni kurulan micromechanical sistemi açıklanmaktadır. Bu sistem farklı hücre altı bölmeleri nöronların, esas olarak germe etkisi üzerinde odaklanmak diğer vitro sistemlerinden farklı sıkıştırma ve kayma stres etkilerini değerlendirmek için bir roman araç temsil eder. Önemlisi, bizim sistemi ve benzersiz özellikleri sayesinde, son zamanlarda basınçlı sıvı uygulama hızla ve geri dönülebilir olarak geçici reseptör potansiyeli kanal etkinleştirmesi üzerinden aksonal varicosities tetikleyebilir gösterilen yeni bir keşif yaptı. Biyomekanik sistemimiz uygun ilaç perfüzyon, canlı hücre görüntüleme, kalsiyum görüntüleme ve yama kelepçe yazmak ile birlikte kullanılabilir. Bu nedenle, bu yöntem mechanosensitive iyon kanalları, aksonlar Taşıma Yönetmeliği, aksonlar sitoiskeleti dinamikleri, sinyal kalsiyum ve morfolojik değişiklikler ile ilgili travmatik beyin hasarı eğitimi için kabul edilebilir.

Şişirme önce akson normalde küçük varisler oluşumu göster. Aşağıdaki bizim standart basınç ile (190 mmH2O yükseklik), birçok boncuk benzeri varicosities geliştirmek için aksonlar Başlat şişirme. Varicosities oluşumu 10 dk kurtarma döneminden sonra (Şekil 2A-B) önceden kahvaltılık durumlarına geri dönen axon bölgelerinde tarafından gösterildiği gibi kısmen tersinir olduğunu. Kurtarma daha uzun bir süre sonra (&gt; 20 dk), bazı akson...

Bu iletişim kuralı bir fizyolojik alakalı, basınçlı sıvı yaklaşım varicosities nöronlar içinde hızlı ve geri dönüşümlü indüksiyon için açıklar.

Varisler oluşumu ve kurtarma merkezi nöron aksonlar içinde çalışmak için bir Microbiomechanical sistemi

Axonal varicosities are enlarged structures along the shafts of axons with a high degree of heterogeneity. They are present not only in brains with ...

Bu basınçlı sıvı kurulumunun genel amacı, kültürlenmiş nöronların aksonları boyunca tekrarlanabilir ve tutarlı şişlikler üretmektir. Bu yöntem, yaralanma sonrası nöronlardaki hücre altı morfolojik değişikliklerin arkasındaki mekanizmalar gibi beyin hasarı alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, yöntemin zamanla iyileşen tutarlı ve tekrarlanabilir morfolojik değişiklikler üretmesidir.Bu laboratuvarda geliştirdiğimiz çok önemli bir teknik. Bunun nedeni, sistemi sadece yeni bir nöronal plastisite formu olarak mekanik strese bağlı akson morfoloji değişikliğini yöneten moleküler mekanizmayı tanımlamak için değil, aynı zamanda sistemi yeni ilaçları ve hafif veya travmatik beyin hasarı için tedavi stratejisini tanımlamak için bir tarama aracı olarak da kullanabilmemizdir. Bu işleme başlamak için, bir veya daha fazla kutu 12 milimetre veya 25 milimetre lamel kutusunu %70 nitrik asit içeren bir cam kabın içine yerleştirin ve lamelleri gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.Ertesi gün, tüm lamelleri 2,5 litre çift damıtılmış su ile doldurulmuş dört litrelik bir behere aktarın. Lamelleri içeren beheri 100 RPM'de bir saat boyunca çalkalayın ve sallama sırasında beheri tutmak için lastik bantlar kullanmayı unutmayın. Daha sonra, temizlenmiş lamelleri metal kapaklı kuru bir şişeye aktarın.Lamelleri 225 derecelik bir fırında altı saat pişirin. Ardından, oda sıcaklığına soğumalarını bekleyin ve kullanılana kadar sterilize edilmiş plastik bir kapta saklayın. Şimdi, 24 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna bir lamel yerleştirin.12 milimetrelik bir lamel üzerine 30 mikrolitre lamel kaplama solüsyonu ekleyin ve döndürün. Daha sonra, her kuyucuğa bir mililitre steril PBS ekleyin. Plaka hemen kullanılabilir veya steril PBS'de dört santigrat derecede bir haftaya kadar saklanabilir.Diseksiyon gününde, PBS'yi plakadan çıkarın. Havayla kurutun ve plakayı iki ila dört saat UV ışığı altında tutun. Hipokampal nöronları kültür için ayırmak için, proteaz enzim çözeltisini çözün ve kaplama ortamını 37 santigrat derecede önceden ısıtın.Daha sonra, disseke hipokampusu SLDS ile durulayın. Daha sonra çıkarın ve iki mililitre proteaz enzim çözeltisi ekleyin ve numuneyi 37 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin. Daha sonra, hipokampus eksplantlarını iki kez beş ila 10 mililitre kaplama ortamı ile yıkayın ve beş mililitre kaplama ortamı ekleyin.Bir mililitrelik plastik uçlu bir pipet kullanarak küçük bir girdap oluşturarak hipokampal eksplantları tek hücrelere ayırın. Çözelti bulanıklaşana ve büyük eksplant parçaları kalmayana kadar oksijen kabarcıklarının oluşmasını önleyerek yaklaşık 40 kez yukarı ve aşağı pipetleyin. Daha sonra, hücreleri üç dakika boyunca yerçekiminin 1.125 katı sıcaklıkta santrifüjleyin.Süpernatanı, hücreler ortama batırılmış halde çıkarın ve hücreleri 145 mililitre kaplama ortamında yeniden askıya alın. Daha sonra, 24 oyuklu bir plakaya oyuk başına bir mililitre hücre süspansiyonu ekleyin. Kaplama ortamındaki hücreleri 37 santigrat derecede iki ila dört saat inkübe edin.Daha sonra, kaplama ortamını çıkarın ve yeni bakım ortamıyla değiştirin. İki gün sonra, fibroblast, endotel ve glial hücrelerin büyümesini engellemek için ortamın yarısını bakım ortamında çözünmüş iki mikromolar RSC ile değiştirin. Ardından, hücreleri iki gün boyunca RSC'ye maruz bıraktıktan sonra, ortamı yeni bakım ortamıyla değiştirin.Hücre morfolojisinin görselleştirilmesi için transfekte etmek için, yapıyı Opti-MEM ortamında ve girdapta mikrolitre başına bir mikrogram olarak stoktan seyreltin. Ardından, lipozom aracılı transfeksiyon reaktifini Opti-MEM ortamında ve girdapta seyreltin. Daha sonra, her kuyucuk için bir inşaat seyreltmesi ve bir transfeksiyon seyreltmesi hazırlayın.Ardından, yapı ve Opti-MEM ortamı ve transfeksiyon reaktifi ile Opti-MEM ortamı ve girdabın bire bir karışımını hazırlayın. Karışımı oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. 20 dakika sonra, ortamın yarısını her bir oyuktan çıkarın ve bu ortamı temiz bir konik tüpe aktarın.Tüpü inkübatörde tutun, daha sonra önceki adımda hazırlanan karışımın 100 mikrolitresini kuyucukta kalan ortama ekleyin. Hücrelerin 37 santigrat derecede 20 ila 30 dakika inkübe etmesine izin verin. İnkübasyon sırasında, konik tüpteki ortama bir hacim taze bakım ortamı ekleyin ve karışımı aynı inkübatöre yerleştirin.İnkübasyonun ardından, transfeksiyon çözeltisini içeren ortamları kuyucuklardan çıkarın ve konik tüpteki eski ve taze bakım ortamının bire bir karışımı ile değiştirin. Bu prosedürde, pipeti yerinde tutmak için mikromanipülatörün vidalı üst kısmına yerleştirin. Mikromanipülatör koluna takılı metal düz üst vidayı, pipetin çekilmemiş ucunu kauçuk borunun takıldığı yerin hemen üzerinde tutacak şekilde vidalayın.Pipeti, lamelleri içeren nöronun yüzeyi ile 45 derecelik bir açıyla açın. Çiçeklenme filtresini açın. Diyaframı açın ve objektiften gelen floresan bir noktanın görülebildiğinden emin olun.Mikromanipülatörü kullanarak, pipeti, ucu floresan nokta ile aynı hizaya getirecek bir konuma getirin ve pipeti, hücre kültürü kabının yüksekliğinin hemen üzerinde bir konuma indirin. Yerine oturduğunda, iletilen ışığı açın ve çiçek salkımını kapatın. Cımbız kullanarak, hücreler pipete bakacak şekilde bir lamel hücre kültürü plakasından oda sıcaklığında 2 mililitre Hank tamponu içeren hücre kültürü kabına aktarın.İnce odak düğmesini ve 20 katlı objektifi kullanarak, hücrelerin yaklaşık dört tam tur üzerindeki bir düzleme odaklanın. Ardından, pipet ucunu, göz merceklerinden görüldüğü gibi odaklanacak ve düzlemin sol orta tarafında olacak şekilde konumlandırmak için mikromanipülatörü kullanın. Pipet yerine oturduktan sonra, mikroskobu ilgilenilen bölgeyi içeren bir düzleme odaklayın.Yedi divin görüntülenmesinde, GFP transfekte edilmiş fare hipokampal nöronları, şişirme öncesi ve sonrası bir akson ve ardından 10 dakikalık bir iyileşme süresi gösterdi. İşte aynı nöronun hızlandırılmış görüntülemesinin Kymograph'ı. Kırmızı oklar, 30 saniyeden başlayarak 190 mililitre H2O şişirmenin 150 saniyesine kadar oluşan varisleri gösterir.Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde yapılırsa üç saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü takiben, mekanik stresin nöral ve elektriksel ve kalsiyum sinyalizasyonu, protein kaçakçılığı ve etkileşimler üzerindeki etkileri gibi ek soruları yanıtlamak için tüm hücre kaydı, hızlandırılmış FRET ve TIRF görüntüleme ve kalsiyum görüntüleme gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Geliştirildikten sonra, bu teknik, fototravmatik beyin hasarı araştırmacılarının, canlı nöronlarda aksonal varis oluşumunun altında yatan moleküler mekanizmaları açıklamalarının yolunu açtı.Bu videoyu izledikten sonra, merkezi nöronların mekanosensasyonlarını incelemek için deneylerin nasıl yapılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

a-microbiomechanical-system-for-studying-varicosity-formation

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Canlı Gram-negatif ve Gram-pozitif bakterilerin jelatin kaplı mika üzerinde hareketsiz ve Atomik Kuvvet Mikroskobu (AFM) kullanarak sıvı görüntülü olabilir.

Atomik Kuvvet Mikroskopi Görüntüleme Bakteriyel İmmobilizasyon

Bu video, bir mikroakışkan oda sistemi kullanarak motor nöronlarda aksonal taşımayı izlemek için bir yöntemi göstermektedir. Aksonal büyümeyi indüklemek için fare embriyonik omurilik dokularının polimer kaplı kuyucuklarda besleyici ortamla kültürlenmesini içerir. Floresan boya lekeli organellerin canlı görüntülemedeki hareketi, çift yönlü aksonal taşımayı doğrular.

Mikroakışkan Bir Cihaz Kullanarak Motor Nöronlarda Organellerin Aksonal Taşınımının İzlenmesi

Bu video, nöronlara mikromekanik uyaran uygulayarak aksonal varislerin indüksiyonunu göstermektedir. Sistem, boru yoluyla tampon içeren bir şırıngaya bağlı bir mikropipet içerir. Bir mikromanipülatör kullanılarak, mikropipet nöronların üzerine yerleştirilir. Daha sonra aksonlarda varisleri indüklemek için sıvı basıncı uygulanır.

Aksonal Varislerin Nöronlar Üzerinde Mikromekanik Bir Uyaran ile İndüklenmesi

Periferal sinir sisteminin (PNS) yaralanmadan sonra önemli tamir yeteneğine sahip olmasına rağmen, küçük bu olgu yöneten hücresel ve moleküler mekanizmaları bilinmektedir. Canlı, transgenik zebrafish ve tekrarlanabilir bir sinir kesisi testi kullanarak, sinir dejenerasyonu ve rejenerasyonu sırasında dinamik glial hücre davranışlarını eğitim görebilirsiniz.

Motor Sinir transeksiyonu ve Canlı Zebra balığı Glial Hücre Davranışlarının Time-lapse Görüntüleme

Lazer nanodissection bağlanmış iki foton görüntüleme, hücre içi çözünürlük ile merkezi sinir sisteminin dejeneratif ve rejeneratif işlemlerini incelemek için yararlı araçlardır. Bu protokol, etiket görüntü ve in vivo serebellar korteks bir tırmanma lifleri incelemek için gösterilmiştir.

Serebellar Aksonlar Lazer Nanosurgery<em&gt; In Vivo</em

Akson ve miyelin yaralanmalarının dinamiklerini gerçek zamanlı olarak aynı anda görselleştirmek için iki foton uyarımlı hızlandırılmış mikroskopi kullanan bir protokol sunuyoruz. Önerilen bu protokol, yaralanma sonrası merkezi miyelinli akson kaderini etkileyebilecek ve kalıcı klinik sakatlığa katkıda bulunabilecek hem içsel hem de dışsal faktörlerin çalışmasına izin vermektedir.

Bir Ex vivo Lazer kaynaklı Omurilik Felçlileri Modeli Gerçek zamanlı aksonal Dejenerasyon mekanizmaları değerlendirmek için

Burada in vitro propriyospinal bağlantıları işlevsel rejenerasyonu çalışma çoklu elektrot dizileri üzerinde kültürlü omurilik dilimleri dayanan bir protokol mevcut.

Çok elektrot Dizileri Yetiştirilen Organotipik Omurilik Co-kültürler Fonksiyonel Rejenerasyon incelenmesi

Bu el yazması, mikro-doku ile tasarlanmış sinir ağlarının imalatını ayrıntılarıyla anlatmaktadır: boru biçiminde bir hidrojel içine konan agrega nöronal popülasyon (lar) yı kapsayan uzunlamasına hizalanmış aksonal yollardan oluşan üç boyutlu mikron boyutlu yapılar. Bu canlı iskele, sinirsel devreleri yeniden yapılandırmak veya modüle etmek için fonksiyonel röleler veya gri-beyaz madde nöroanatomisini taklit eden biyofiziksel test yatakları olarak işlev görebilir.

Sinir Sistemi Yeniden Yapılanma, Modülasyon ve Modelleme için Anatomik olarak İlham Almış Üç Boyutlu Mikro-Dokulu Mühendisli Sinir Ağları

Aksonal taşıma motor nöron sağlığı için çok önemli bir mekanizmadır. Bu protokolde mikroakışkan odacıklar kullanılarak motor nöron aksonlarında asidik bölmelerin ve mitokondrinin aksonal naklinin izlenmesi için ayrıntılı bir yöntem sağlıyoruz.

Mikroakışkan Odacıksistemi Kullanılarak Motor Nöron Kültürlerinde Organellerin Aksonal Taşınması

Bu protokol, aksonal yaralanma sonrası nöronal metabolik dinamikleri modelleyen, görüntüleme, çoklu omik analiz ve içsel metabolik yeniden şekillenmenin mekanik çalışmalarını mümkün kılan bir mikroakışkan sistemi tanımlar.

Aksonal Yaralanma Modelleri Yapımı ve Çoklu Omik Analizin Etkinleştirilmesi için Mikroakışkan Çip

Öğrenin basınçlı sıvı yöntemiyle kültürlenmiş hipokampal nöronlarda tekrarlanabilir akson şişlikleri oluşturmayı. Bu teknik mekanik stres altında nöronal plastisite ve beyin hasarı tedavileri için mekanizmaları açıklamaya yardımcı olur.

Varisler oluşumu ve kurtarma merkezi nöron aksonlar içinde çalışmak için bir Microbiomechanical sistemi

Daha fazla video keşfet