Bir sıçan modelinde kısmi kolektomi sonra kaçağı azaltmak için Yağ dokusundan elde edilen kök hücre sayfasının nakli

Doku iyileşmesi üzerinde olumlu etkileri olduğu için ASC tabakaları miyokard enfarktüsü gibi birçok hastalık modelinde test edilmiştir. Bu deney ASC tabakalarının karın içinden kullanılabileceğini ve bağırsağa uygulanabileceğini göstermiştir. ASC levhaların temel avantajı, sentetik malzemelere ihtiyaç duyulmamasıdır.

Ek olarak, ASC tabaka transplantasyonunun gerçekleştirilmesi nispeten kolaydır ve sadece az miktarda pratikle yapılır. ASC tabaka transplantasyonunun bu yeni uygulaması, barsak rezeksiyonu sonrası sızıntıyı önlemek için geliştirilmiştir ve yeni bir terapötik stratejinin ilk adımını sunmaktadır. Bağırsak anastomozuna uygulanan ASC tabakalarının sızıntıyı önlemede umut verici olduğu gösterilmiştir.

ASC tabakaları, idrar yolları gibi diğer karın içi organlara da uygulanabilir. İnsan deri altı abdominal yağ dokusunu 10 numara steril cerrahi bıçak, Adson-Brown doku forsepsleri ve Metzenbaum makası ile 0,5 cm'lik parçalar halinde diseke ederek başlayın. Steril bir cam şişede disseke edilen toplam doku miktarını tartın.

Şişe başına 30 ml izolasyon ortamı ekleyin. Ve disseke edilen yağ dokusunu bir saat boyunca 150 rpm ve 37 santigrat derecede bir çalkalayıcı inkübatörde sindirin. Bir saat sonra, sindirilmiş doku çözeltisini 50 ml'lik tüplere bölün ve tüpleri 390 G'de 10 dakika santrifüjleyin

Hücre peletlerini yeniden süspanse etmek için ortam ekleyin ve 45 ml'ye kadar daha fazla kültür ortamı ekleyin. Birleştirilmiş hücreleri 390 G'de beş dakika santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın. Hücre peletini 10 ml kültür ortamı ile yeniden süspanse edin.

Ve hücre süspansiyonunu 100 mikronluk bir filtreden süzün. Bitli kırmızı kan hücrelerine 50 l hücre süspansiyonuna 50 l% 3 asidik asit metilen mavisi çözeltisi ekleyin. Çözeltiyi karıştırdıktan sonra, bir hemositometreye 10 l pipetleyin ve hücreleri sayın.

Hücreleri, kültür ortamı içeren bir T175 şişesinde, cm kare başına 40000 hücre yoğunluğunda plakalayın. Ve hücreleri 37 santigrat derecede% 5 CO2 ile nemli bir atmosferde 24 saat boyunca inkübe edin. Ertesi gün, hücre kalıntılarını gidermek için hücreleri ılık fosfat tamponlu tuzlu su ile yıkayın.

Daha sonra, ortamı% 10 FBS kültür ortamı ve ayrıca taze eklenmiş askorbik asit-2-fosfat ve insan rekombinant fibroblast büyüme faktörü iki ile değiştirin. Hücreler% 90 birleşime ulaşana kadar inkübe edin. Standart% 0.25 Tripsin-EDTA çözeltisi kullanarak% 90 birleşme oranında yağ kök hücrelerini alt kültürleyin.

Üç ila beş dakika sonra,% 0.25 Tripsin-EDTA çözeltisini 10 ml kültür ortamı ile nötralize edin. Bir santrifüj tüpüne aktarın ve hücreleri 250 G'de sekiz dakika santrifüjleyin, süpernatanı çıkarın ve hücreleri 1 ml kültür ortamında yeniden süspanse edin. Hücreleri bir hemositometre ile saydıktan sonra, hücreleri cm kare başına 8000 hücre yoğunluğunda T175 kültür şişelerine yerleştirin.

Kalan ASC'leri daha fazla kullanmadan önce kültür ortamında% 10 dimetil sülfoksit ile sıvı nitrojen içinde dondurun. 3,5 cm çapında ısıya duyarlı kültür kaplarını 1 ml fetal sığır serumu ile önceden kaplayın. Daha sonra bulaşıkları tohumlamadan önce en az 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede bir kuluçka makinesine koyun.

ASC'nin ısıya duyarlı tabağa yapışmasına yardımcı olmak ve kültürde erken ASC tabakasının ayrılması riskini azaltmak için, termo-duyarlı tabak, hücre tohumlamadan önce fetal sığır serumu ile ön kaplanmalıdır. ASC'leri daha önce olduğu gibi tripnize edin, tripsinizasyondan sonra herhangi bir hücre kümesi varsa, saymadan önce hücreleri 100 mikronluk bir filtreden süzün. Bulaşıkları inkübatörden çıkarın ve 37 santigrat derecede bir ısıtma plakasına aktarın.

FBS'yi tabaktan çıkarın. Hücre peletini LG DMEM'de% 10 FBS ile yeniden süspanse ettikten ve hücreleri saydıktan sonra, her 3.5 cm'lik tabakta cm kare başına 400000 hücre tohumlamak için, tabak başına 2 ml kültür ortamında 3.52 kez 10 ila 6. ASC'leri seyreltin. Çanağı hafifçe sallayarak hücreleri mümkün olduğunca eşit bir şekilde dikkatlice dağıtın.

Daha sonra,% 5 CO2 ile nemli bir atmosferde 37 santigrat derecede 48 saat boyunca ASC tabakalarını kültürleyin. Transplantasyon gününde, ASC tabakasının ayrılmasını kolaylaştırmak için in vivo transplantasyondan 40 dakika önce kültür kaplarının oda sıcaklığına soğumasını bekleyin. Soğuduktan sonra kültür ortamını çıkarın ve 1 ml serumsuz LG DMEM ile değiştirin.

Hücre tabakasını nakletmek için, ASC tabakasının kenarını atravmatik forseps ile nazikçe tutun ve ASC tabakasının çanak tarafını anastomoz hattının üzerine yerleştirin. Başarılı bir sağlam tabaka nakli sağlamak için nazik tabaka kullanımı ve doğru tabaka yerleştirme çok önemlidir. ASC tabakasını anastomoz çizgisinin yaklaşık 0,25 cm üstüne ve altına kadar dikkatlice gerin.

ASC tabakasını sırt tarafının etrafına sarmak için kolonu kaldırarak tabakayı kolonun etrafına sarın. Nakledilen ASC tabakalarını almayan kontrol hayvanları, ameliyat sonrası üçüncü günde beyaz okla gösterilen anastomoz çizgisinin yakınında dışkı sızıntısı sergiler. Siyah okla gösterilen nakledilen ASC tabakalarına sahip hayvanlar, ameliyat sonrası üçüncü günde dışkı sızıntısında azalma ve apse oluşumu gösterdi.

Aynı sonuç ameliyattan yedi gün sonra gözlendi. Bu görüntü, H ve E ile boyanmış nakledilen bir hayvanda kolorektal anastomoz bölgesinin temsili bir kesitini göstermektedir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde yapılırsa birkaç dakika içinde yapılabilir.

ASC tabakası kolonun sıfır hücre yüzeyine kendiliğinden yapışık olacaktır, ASC tabakasına uyacak şekilde yapıştırıcı veya sütür kullanmaya gerek yoktur. Bu videoyu izledikten sonra, parsiyel kolektomi sonrası sızıntıyı önlemek için ASC tabakalarının sıçanlarda kolorektal anastomoza nasıl hazırlanacağını ve nakledileceğini iyi anlamış olmalısınız.