Yalıtım Karın zarını kaynaklı Mast hücreleri ve onların fonksiyonel karakterizasyonu ile Ca^{2 +}-görüntüleme ve Degranulation deneyleri

Bu yöntemler, bağışıklık hücresi aktivasyonu ve aracı salınımı için hangi iyon kanallarının kritik olduğu gibi, uyarılabilir hücreler üzerinde hücre içi sinyalleme alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniklerin temel avantajları, göreceli basitlikleri ve çok sayıda hücrenin aynı anda analiz edilebilmesidir. Mast hücrelerinde Fura-2 kalsiyum görüntülemeyi göstermek, laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olan Kathrin Ohlenschlager olacak.

Bu prosedüre başlamak için, ötenazi fareye% 70 etanol püskürtün ve pimler kullanarak sırt tarafı aşağı bakacak şekilde bir köpük blok üzerine sabitleyin. Künt kenarlı makas kullanarak, farenin karnının üzerindeki cildi çıkarın ve periton boşluğuna zarar vermekten kaçının. Daha sonra, peritona dikkatlice 27 gauge iğne sokarak periton boşluğuna yedi mililitre buz gibi soğuk RPMI ortamı enjekte edin.

Herhangi bir organı delmeyin ve organ delinmesi riskini azaltmak için epididimal yağ bölgesinde bir nokta kullanın. Enjeksiyondan sonra, periton hücrelerini RMPI ortamına ayırmak için fareyi bir dakika sallayın. İç organlara zarar vermekten ve periton boşluğunu kanla kirletmekten kaçınmak için fareyi çok güçlü sallamayın.

Ardından, şırıngayı yeni bir 20 gauge kanül ile donatarak yeniden kullanın. Köpük bloğu eğerek ve diğer taraftan orta aspirasyonu kolaylaştırmak için tezgahın üzerine hafifçe vurarak iç organları bir tarafa kaydırın. Daha sonra, iç organların tıkanmasını önlemek için sıvıyı karın bölgesinden nazikçe ve yavaşça aspire etmek için 20 gauge iğne eğimi yerleştirin.

Mümkün olduğunca fazla sıvı toplayın. Daha sonra, iğneyi şırıngadan çıkarın ve toplanan hücre süspansiyonunu buz üzerindeki bir toplama tüpüne aktarın. Görünür kan kontaminasyonu varsa bir numune tüpünü atın.

Tüpü temiz hücre süspansiyonu ile 300 g'da beş dakika santrifüjleyin. Steril bir başlık altında, süpernatantı aspire edin. Numune peletlerini soğuk PMC ortamında yeniden süspanse edin ve hücre süspansiyonunu 25 santimetre karelik bir hücre kültürü şişesine aktarın.

Daha sonra, büyüme faktörleri IL-3 ve SCF'yi sırasıyla mililitre başına 10 nanogram ve mililitre başına 30 nanogram nihai konsantrasyonlara ekleyin. Bir sonraki işleme kadar hücreleri 37 santigrat derecede yaklaşık 48 saat inkübe edin. 12 ila 15. günlerde, plazmalemmal IgE reseptörlerinin uyarılması ile ilgili herhangi bir deney planlanırsa, hücreleri standart kültür ortamında mililitre IgE anti-DNP başına 300 nanogram ile gece boyunca ön işlemden geçirin.

Fura-2 görüntülemeyi hazırlamak için, yükleme tamponunu hazırlamak için Fura-2, stok çözeltisini kalsiyum HBSS içinde beş mikromolar nihai konsantrasyona seyreltin. Ardından, 500 mikrolitre yükleme tamponunu 500 mikrolitre PMC hücre süspansiyonu ile karıştırın. Karışımı görüntüleme odasına pipetleyin ve hücreleri karanlıkta oda sıcaklığında 20 ila 30 dakika inkübe edin.

Yerçekimi beslemeli uygulama sistemini stimülasyon protokolüne göre farklı çözümlerle kurun. Daha sonra, uygulama sistemini ters çevrilmiş mikroskobun sahnesine monte edin. Üzerine küçük bir damla daldırma yağı koyarak 40X yüksek diyafram açıklığına sahip bir yağa daldırma hedefi hazırlayın.

Yüklenen hücrelerin bulunduğu görüntüleme odasını uygulama sistemine yerleştirin ve kayıt sırasında hareket etmesini önlemek için sabitleyin. Ardından, iletilen ışığı açın ve hücrelere odaklanın. Ardından, görüntüleme edinme programını Fizyolojik Edinme modunda başlatın.

Kurulum penceresini açın ve odağı ve optimum çekim süresini ayarlayın. Bir referans resim görüntüleyin ve hücreleri ROI olarak işaretleyin. Hiçbir hücrenin bulunmadığı bir alanda son yatırım getirisini işaretleyin ve bunu arka plan olarak tanımlayın.

Ardından, kurulumu tamamlayın ve ölçümü beş saniyelik bir alım hızıyla başlatın. Ardından, deneyin tasarımına göre uygun döngü numarasına çözeltiler ekleyin. Hücre içi kalsiyum konsantrasyonunun antijen kaynaklı yükselmesini ölçmek için, döngü 20'den sonra şırınga-iki solüsyonunu uygulayın ve döngü 150'den sonra kaydı durdurun.

Hücre içi kalsiyum konsantrasyonunun bileşik 48/80 kaynaklı yükselmesini ölçmek için, döngü 20'den sonra şırınga-üç çözeltisini uygulayın ve döngü 150'den sonra kaydı durdurun. SOCE tarafından uyarılan hücre içi kalsiyum konsantrasyonunun yükselmesini ölçmek için, döngü 10'dan sonra şırınga-dört çözeltisini uygulayın, döngü 70'ten sonra şırınga-beş çözeltisini uygulayın, döngü 120'den sonra şırınga-dört çözeltisini uygulayın, döngü 150'den sonra şırınga bir çözeltisini uygulayın ve döngü 220'den sonra kaydı durdurun. Satın alma programında, art arda düğmelere basın Kesiciyi Başlat, Tümünü İşaretle, Tümünü Dönüştür, Fizyoloji Ölçümleri, Tamam, ve sonra tekrar Tamam.

Çevrimdışı analiz için dosyaları tablolar ve görüntü yığınları olarak kaydedin. Beta-heksosaminidaz salınımını ölçmek için, oyuk başına 100 mikrolitre hücre süspansiyonunu 96 oyuklu bir V-dip kuyu plakasına aktarın. Her kuyucuğa 25 mikrolitre stimülasyon veya kontrol çözeltisi ekleyin.

Ardından, hücreleri 37 santigrat derecede 45 dakika inkübe edin. Daha sonra, 96 oyuklu plakayı beş dakika boyunca buzun üzerine yerleştirerek reaksiyonu durdurun. Ardından, plakayı dört santigrat derecede 120 g'da dört dakika santrifüjleyin.

120 mikrolitre süpernatanı düz tabanlı 96 oyuklu bir plakaya aktarın ve buzun üzerine yerleştirin. Hücre peletlerine dokunmaktan dikkatlice kaçının, ancak süpernatanı tamamen aspire edin. Daha sonra, hücre peletlerine 125 mikrolitre lizis tamponu ekleyin.

Hücre peletlerini oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin ve inkübasyondan sonra tekrarlanan pipetleme ile yeniden süspanse edin. Dört milimolar pNAG çözeltisinin 25 mikrolitresini yeni bir düz tabanlı 96 oyuklu plakanın gerekli kuyucuklarına pipetleyin. Hazırlanan pNAG çözeltisine her bir süpernatanttan 25 mikrolitre ve her hücre lizatından ayrı ayrı 25 mikrolitre ekleyin.

Reaksiyon partilerini 37 santigrat derecede bir saat inkübe edin. İnkübasyondan sonra, reaksiyonu durdurmak için her bir oyuğa 150 mikrolitre durdurma çözeltisi pipetleyin. Ardından, otomatik arka plan çıkarma için 630 nanometre referanslı 405 nanometrede bir mikro plaka okuyucu ile plaka numunesi ışık emilimini analiz edin.

Edinme programında, Referans kutusunu işaretleyin ve absorbans programı öğesi menüsünde, otomatik arka plan çıkarma için 630 nanometreyi seçin. Beta-heksosaminidaz salınım testi, plazmalemmal IgE yüksek afiniteli reseptörlerin çapraz bağlanması veya Mrg PRB2 reseptörlerinin uyarılması üzerine degranülasyona uğrayan izole PMC'lerin yeteneğini test etmek için gerçekleştirildi. Hücreler, V tabanlı 96 oyuklu bir plakaya eklendi ve bu şemaya göre 37 santigrat derecede 45 dakika boyunca uyarıldı.

Süpernatantın santrifüjlenmesi ve çıkarılmasından sonra, peletler parçalandı. Bireysel süpernatanların ve pelet lizatlarının beta-heksosaminidaz içeriği daha sonra 37 santigrat derecede bir saatlik inkübasyon sırasında pNAG ile reaksiyonları ile analiz edildi. Reaksiyon ürünlerinin miktarı kolorimetrik olarak tespit edildi ve salınan beta-hekzosaminidaz yüzdesi hesaplandı.

Spontan salınım çok düşüktü, oysa mililitre başına 50 mikrogramda 10 mikromolar iyonomisin ve bileşik 48/80 gibi güçlü degranülasyon uyaranlarına verilen yanıtlar sırasıyla% 40 ve% 60'ın üzerindeydi. DNP stimülasyonuna degranülasyon yanıtları, mililitre başına 10 ila 300 miligram konsantrasyon aralığında doza bağımlıydı. Birlikte, bu veriler izole edilmiş PMC'lerin iyi bir işlevsel durumunu açıkça göstermektedir.

Bu tekniği kullanarak, iki hafta içinde peritondan türetilen murin olgun bağ dokusu mast hücrelerinin yüksek saflıkta popülasyonunu elde edeceksiniz. Bu prosedürü denerken, bakteriyel kontaminasyonu önlemek için hücre izolasyonu ve kültürleme sırasında steril koşulları korumayı unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, mast hücrelerinde kalsiyum giriş yolakları ile ilgili ek soruları yanıtlamak için elektrofizyolojik yama-klemp iyon akımı ölçümleri gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir.

Fura-2 hücre içi kalsiyum görüntüleme tekniği geliştirildikten sonra, kitle hücresi fizyolojisi alanındaki araştırmacıların mast hücre degranülasyonunun kalsiyum bağımlılığını araştırmalarının yolunu açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, Fura-2 kalsiyum görüntüleme deneylerinin ve mast hücreleri ile beta-heksosaminidaz degranülasyon testinin nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız. UV radyasyonu ile çalışmanın gözler ve cilt için tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken gereksiz maruziyetten kaçınılması gerektiğini unutmayın.